本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種測定抗鏈球菌溶血素“O”的試劑盒。
背景技術(shù)：
抗鏈球菌溶血素“O”，簡稱抗“O”或ASO，是A群鏈球菌產(chǎn)生的一種外毒素，能溶解紅細(xì)胞，并對(duì)機(jī)體多種細(xì)胞有毒性作用。人體感染溶血性鏈球菌后，血清中可出現(xiàn)大量抗鏈球菌溶血素“O”抗體。檢測抗鏈球菌溶血素“O”可作為鏈球菌感染后變態(tài)反應(yīng)性疾病的輔助診斷。
人體感染了A組溶血性鏈球菌后，“O”溶血素在體內(nèi)作為一種抗原物質(zhì)存在。為了測定這種能中和鏈球菌溶血素“O”的抗體含量，就稱為抗鏈球菌溶血素“O”試驗(yàn)?？埂癘”的數(shù)值以單位計(jì)算，有100、125、166、250、333、500、625、833、1250、2500等數(shù)檔。正常人一般在500單位以下，若高于500單位，說明最近有過溶血性鏈球菌感染。有些病人抗“O”升高，但是沒有關(guān)節(jié)酸痛等癥狀，不能認(rèn)為就是患了風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，只能說明近期曾有過溶血性鏈球菌感染，患了扁桃體炎、咽炎、猩紅熱等一類疾病。但是，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病原因確實(shí)與鏈球菌的感染有關(guān)，所以，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動(dòng)期，抗“O”是會(huì)升高的。
據(jù)研究，柯薩奇B病毒、高膽固醇血癥、溶血、肝炎、腎病綜合癥等疾病，均可呈現(xiàn)非特異性的抗“O”增高，但是滴度不是很高，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎也是如此。一般認(rèn)為，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病可能與某些微生物的感染有關(guān)，感染后引起異常免疫反應(yīng)。鏈球菌也可能混雜在其間，部分參與了感染，因而出現(xiàn)了抗“O”。另外，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人“久病體虛”，抵抗力較差，容易收到鏈球菌的侵襲，我們?cè)谂R床上常見到類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人患有咽炎。還有部分關(guān)節(jié)炎病人應(yīng)用腎上腺皮質(zhì)激素或免疫抑制劑治療之后，抗感染能力明顯下降，這也是合并鏈球菌感染的原因。
目前測定抗鏈球菌溶血素“O”的方法主要為酶聯(lián)免疫法。但酶聯(lián)免疫吸附法測定耗時(shí)長，操作復(fù)雜，對(duì)操作者有較高的專業(yè)技能要求，且只能定性或者半定量檢測。膠乳凝集實(shí)驗(yàn)只可定性檢測。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中抗鏈球菌溶血素“O”檢測過程操作復(fù)雜、以及測定準(zhǔn)確度低的問題，提供一種測定抗鏈球菌溶血素“O”的試劑盒。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供的技術(shù)方案是：一種測定抗鏈球菌溶血素“O”的試劑盒，包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為：
試劑R1：
Tris緩沖液 20~100 mmol/L
聚乙二醇-2000 5~25 g/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
EDTA 20~70 mmol/L
海藻糖 20~50 mmol/L
其溶劑為純化水。
試劑R2：
Tris緩沖液 20~100 mmol/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
甘油 5~25 mmol/L
乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體 0.2~2 %
其溶劑為純化水。
作為優(yōu)選，本試劑盒中獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應(yīng)含量為：
試劑R1：
Tris緩沖液 60 mmol/L
聚乙二醇-2000 15 g/L
Proclin-300 1.5g/L
EDTA 45 mmol/L
海藻糖 35 mmol/L
其溶劑為純化水。
試劑R2：
Tris緩沖液 60 mmol/L
Proclin-300 1.5 g/L
甘油 15 mmol/L
乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體 1.1 %
其溶劑為純化水。
作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體為含有能與抗鏈球菌溶血素“O”抗體特異性結(jié)合的Fab功能部位的完整抗體或抗體片段。
作為優(yōu)選，所述的包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體的粒徑在40~500nm之間。
作為優(yōu)選，該測定抗鏈球菌溶血素“O”的試劑盒的制備方法和使用方法包括以下步驟：
（a）按照下列組分含量配制好R1試劑：
Tris緩沖液 20~100 mmol/L
聚乙二醇-2000 5~25 g/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
EDTA 20~70 mmol/L
海藻糖 20~50 mmol/L
其溶劑為純化水。
（b）按照下列組分含量配制好R2試劑：
Tris緩沖液 20~100 mmol/L
Proclin-300 0.5~2.5 g/L
甘油 5~25 mmol/L
包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體 0.2~2 %
其溶劑為純化水。
（c）將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)選的，試劑R1與試劑R2的體積比為4：1，待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1：20到1：70之間。
（d）用全自動(dòng)生化分析儀測定反應(yīng)后的吸光度差值；
（e）根據(jù)吸光度變化值計(jì)算出樣本中的抗鏈球菌溶血素“O”的值。
作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體制備步驟如下：
（a）將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到1%，每mL溶液中加入EDAC 0.5 mg，室溫反應(yīng)2小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散；
（b）將步驟（a）的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為2%，超聲分散，邊攪拌邊加入等體積的含抗鏈球菌溶血素“O”抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)；
（c）將步驟（b）的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4℃封閉過夜；離心去上清，用步驟（b）制得的分散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為1.1%，超聲分散，制得乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體。
本發(fā)明所采用的膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的反應(yīng)原理是抗原抗體反應(yīng)：樣品中抗鏈球菌溶血素“O”（ASO）可與試劑中乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O” 乳膠結(jié)合發(fā)生凝集反應(yīng)，產(chǎn)生一定濁度。該濁度高低ASO的含量成正比。在一定波長下測定濁度并通過多點(diǎn)定標(biāo)曲線可進(jìn)行抗鏈球菌溶血素“O”的定量測定。
樣本中抗鏈球菌溶血素“O”（ ASO）的活性（U/mL）= CS ×（U/mL）
式中：ΔAT 以空白管吸光度作對(duì)照的樣品管吸光度值
ΔAS 以空白管吸光度作對(duì)照的校準(zhǔn)管吸光度值
CS 校準(zhǔn)液中ASO的濃度
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明在試劑R1液中添加了聚乙二醇-2000，能夠加速反應(yīng)；在試劑R2中采用乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體，對(duì)抗鏈球菌溶血素“O”的檢測靈敏度更高，檢測準(zhǔn)確性更好，因此檢測準(zhǔn)確度高，另外檢測也比較方便。
附圖說明：
圖1為本試劑盒與化學(xué)發(fā)光法的檢測結(jié)果對(duì)比。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1
本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨(dú)立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中
試劑R1：
Tris緩沖液 60 mmol/L
聚乙二醇-2000 15 g/L
Proclin-300 1.5g/L
EDTA 45 mmol/L
海藻糖 35 mmol/L
其溶劑為純化水。
試劑R2：
Tris緩沖液 60 mmol/L
Proclin-300 1.5 g/L
甘油 15 mmol/L
乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體 1.1 %
其溶劑為純化水。
實(shí)施例2
試劑盒的制備和使用方法
1、乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體的制備：
（a）將粒徑為120nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到1%，每mL溶液中加入EDAC 0.5 mg，室溫反應(yīng)2小時(shí)，在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，去上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散；
（b）將步驟（a）的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為2%，超聲分散，邊攪拌邊加入等體積的含抗鏈球菌溶血素“O”抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應(yīng)2小時(shí)；
（c）將步驟（b）的產(chǎn)物在離心機(jī)內(nèi)15000 rpm轉(zhuǎn)速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4℃封閉過夜；離心去上清，用步驟（b）制得的分散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為1.1%，超聲分散，制得乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體。
2、按照下列組分含量配制好試劑：
（a）按照下列組分含量配制好R1試劑：
Tris緩沖液 60 mmol/L
聚乙二醇-2000 15 g/L
Proclin-300 1.5g/L
EDTA 45 mmol/L
海藻糖 35 mmol/L
其溶劑為純化水。
（b）按照下列組分含量配制好R2試劑：
Tris緩沖液 60 mmol/L
Proclin-300 1.5 g/L
甘油 15 mmol/L
乳膠包被抗鏈球菌溶血素“O”抗體 1.1 %
其溶劑為純化水。
3、全自動(dòng)生化分析儀參數(shù)設(shè)置
（a）檢測溫度：37℃；
（b）檢測波長：主波長600nm；
（c）反應(yīng)時(shí)間 ：10min，其中，孵育時(shí)間 5min，加入試劑 R2 后立即測定讀取吸光度 A1，5min后讀取吸光度 A2，計(jì)算吸光度變化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反應(yīng)方向：正反應(yīng)；
4、檢測步驟
（a）取200μl試劑R1與4μl待測樣本混勻；
（b）將混勻后的溶液在37℃的條件下孵育5min；
（c）加入50μl試劑R2，立即測定讀取吸光度A1，5min后讀取吸光度A2，計(jì)算吸光度變化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 樣本中抗鏈球菌溶血素“O”（ ASO）的活性（U/mL）= CS × （U/mL），計(jì)算出樣本中的抗鏈球菌溶血素“O”的活度。
參照附圖1，附圖1為用實(shí)施例1所制得的一種測定抗鏈球菌溶血素“O”的試劑盒多次測定不同樣本中抗鏈球菌溶血素“O”的測定結(jié)果，以及在同等條件下與化學(xué)發(fā)光法測定結(jié)果的對(duì)比分析。從相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，本試劑盒與化學(xué)發(fā)光檢測結(jié)果相關(guān)性很好，相關(guān)方程 y=0.9854x+0.5203，R2=0.9906，從結(jié)果可以看出本試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確性可靠，相關(guān)性良好，可以應(yīng)用于抗鏈球菌溶血素“O”的檢測。