本發(fā)明涉及分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種獸藥中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法。

背景技術(shù)：

喹諾酮(4-quinolones)，又稱喹諾酮類、吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)，對細(xì)菌DNA螺旋酶具有選擇性抑制的抗菌劑。由于喹諾酮既不是微生物分泌物又不是微生物分泌物的類似物，所以嚴(yán)格來說其只是人工合成的抗菌劑(Antibacterial)。

喹諾酮類抗生素是一類人畜通用的藥物。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性和毒副作用小等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中，包括在雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、魚、蝦、蟹等的養(yǎng)殖中用于疾病防治。由于喹諾酮類藥物在動物機(jī)體組織中的殘留，人食用動物組織后喹諾酮類抗生素就在人體內(nèi)殘留蓄積，造成人體疾病對該藥物的嚴(yán)重耐藥性，影響人體疾病的治療。人類長期食用含較低濃度喹諾酮類藥物的動物性食品容易誘導(dǎo)耐藥性的傳遞，從而影響該類藥物的臨床療效。因此，喹諾酮類藥物殘留問題越來越引起人們的關(guān)注。聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑專家聯(lián)席委員會、歐盟都已制定了多種喹諾酮類藥物在動物組織中的最高殘留限量。美國FDA于2005年宣布禁止用于治療家禽細(xì)菌感染的抗菌藥物恩諾沙星的銷售和使用。我國也于2002年規(guī)定了環(huán)丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7種喹諾酮類藥物在動物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500μg/kg。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種獸藥中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種獸藥中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定獸藥中的喹諾酮類藥物殘留，具體步驟如下：

(1)標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣品溶液在設(shè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件下進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積的比值Y為縱坐標(biāo)，繪制5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，所述標(biāo)準(zhǔn)工作液為氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星4種喹諾酮類藥物混合工作液；

用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對樣品進(jìn)行定量，樣品溶液中藥物的響應(yīng)值應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，其中，所設(shè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件如下：

①液相色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18,100mm×2.1mm,1.9μm

流動相：0.1％甲酸/甲醇；流速：0.35mL/min 柱溫：35℃進(jìn)樣量10μL

液相梯度條件

②質(zhì)譜條件

離子源：H-ESI源 掃描方式：負(fù)離子掃描；

檢測方式：多反應(yīng)檢測 噴霧電壓：3500V

霧化溫度：400℃ 鞘氣壓力：35arb

輔氣壓力：10arb 毛細(xì)管溫度：350℃

四種喹諾酮類藥物的色譜保留時(shí)間和定性定量離子參數(shù)

(2)在上述色譜條件下，判斷樣品中是否存在相應(yīng)的被測物，需要滿足如下條件：樣品溶液中出現(xiàn)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液一致，允許偏差小于±2.5％，該色譜峰所對應(yīng)的藥物在設(shè)定質(zhì)譜定性離子的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)幕|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對離子豐度一致，相對豐度偏差不超過設(shè)定 的規(guī)定，則可確定含有該藥物。

所述5點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制方法如下：從冰箱中取出100ng/mL的喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，恢復(fù)至室溫后用0.1％甲酸稀釋成濃度系列為0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每一濃度進(jìn)樣3針，按其所得峰面積比值平均數(shù)Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

上述獸藥中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法，所述樣品溶液的制備方法為試樣經(jīng)2％甲酸乙腈提取，氮吹后用0.1％甲酸復(fù)溶，過0.22μm微孔濾膜，試劑為色譜純試劑。

上述獸藥中喹諾酮藥物殘留的檢測方法，所述樣品溶液的制備方法，具體步驟如下：

(1)準(zhǔn)確稱取1g試樣，精確到0.01g，置于50mL聚苯乙烯離心管中，加5mL 2％甲酸乙腈，渦動1-3min，離心力4000g-6000g，室溫條件下離心10min，提取上清液1ml，55-60℃氮吹至干，以1mL0.1％甲酸復(fù)溶，復(fù)溶后再次用0.1％甲酸稀釋10倍，最終溶液過0.22μm微孔濾膜，即可供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

本發(fā)明的有益效果是：

上述獸藥中喹諾酮藥物殘留的檢測方法，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定獸藥中的喹諾酮類藥物殘留，該方法樣品前處理時(shí)省去了凈化過程，具有處理程序簡單，快速，測定準(zhǔn)確率高等特點(diǎn)；從獸藥源頭進(jìn)行分析，有效保障養(yǎng)殖業(yè)用藥安全，提高動物食品安全。

附圖說明

圖1為獸藥陰性樣品檢測喹諾酮類藥物(四種沙星)總離子流圖；

圖2為獸藥樣品添加喹諾酮類藥物(四種沙星)后總離子流圖(藥物濃度為1μg/kg)。

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明所述技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

一、提取

選取4種不同的獸藥樣品做3種不同濃度的添加回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行方法驗(yàn)證，獸藥中待測藥物的提取溶劑，分別采用乙腈、2％甲酸乙腈、甲醇和乙酸乙酯，4種試劑進(jìn)行提取條件的選擇。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對于獸藥中的喹諾酮類獸藥殘留，2％甲酸乙腈的提取效率好于另外兩種試劑。

具體操作：準(zhǔn)確稱取1g試樣，精確到0.01g，置于50mL聚苯乙烯離心管中，加5mL 2％甲酸乙腈，渦動1-3min，離心力4000g-6000g，室溫條件下離心10min，提取上清液1ml，55-60℃氮吹至干，以1mL0.1％甲酸復(fù)溶，復(fù)溶后再次用0.1％甲酸稀釋10倍，最終溶液過0.22μm微孔濾膜，即可供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

二、測定

本實(shí)驗(yàn)定量方法為外標(biāo)法定量。從冰箱中分別取出100ng/mL的四種沙星藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用恢復(fù)至室溫后用0.1％甲酸稀釋成濃度系列為0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每一濃度進(jìn)樣3針，按其所得峰面積比值平均數(shù)Y為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)試樣中被測物的藥物含量，選取響應(yīng)值相近的藥物標(biāo)準(zhǔn)工作液同時(shí)進(jìn)行分析。標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測液中藥物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)。如果含量超 過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)用基質(zhì)空白溶液(0.1％甲酸)稀釋到合適濃度后分析。

①液相色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18,100mm×2.1mm,1.9μm

流動相：0.1％甲酸/甲醇；流速：0.35mL/min 柱溫：35℃進(jìn)樣量10μL

液相梯度條件

②質(zhì)譜條件

離子源：H-ESI源 掃描方式：負(fù)離子掃描；

檢測方式：多反應(yīng)檢測 噴霧電壓：3500V

霧化溫度：400℃ 鞘氣壓力：35arb

輔氣壓力：10arb 毛細(xì)管溫度：350℃

四種喹諾酮類藥物的色譜保留時(shí)間和定性定量離子參數(shù)

在上述色譜條件下，判斷樣品中是否存在相應(yīng)的被測物，需要滿足如下條件：樣品溶液中出現(xiàn)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液一致，允許偏差小于±2.5％，該色譜峰所對應(yīng)的藥物在設(shè)定質(zhì)譜定性離子的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)幕|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對離子豐度一致，相對豐度偏差不超過設(shè)定的規(guī)定，則可確定含有該藥物(如圖1、圖2所示)。

三、具體實(shí)施案例結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)共選取4種獸藥進(jìn)行喹諾酮類藥物做添加回收試驗(yàn)，其標(biāo)準(zhǔn)的曲線方程、回收率和精密度結(jié)果如下表：

表1四種喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)

表2阿莫西林可溶性粉回收率測定結(jié)果

表3硫氰酸紅霉素可溶性粉回收率測定結(jié)果

表4替米考星溶液回收率測定結(jié)果

表5地克珠利溶液回收率測定結(jié)果

表6阿莫西林可溶性粉精密度測定結(jié)果

表7硫氰酸紅霉素可溶性粉精密度測定結(jié)果

表8替米考星溶液精密度測定結(jié)果

表9地克珠利溶液精密度測定結(jié)果

由以上案例可見，本發(fā)明采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定獸藥中的喹諾酮類藥物殘留，所述樣品溶液的制備方法為試樣首先通過水溶過濾，2％甲酸乙腈提取，氮吹后用0.1％甲酸復(fù)溶，過0.22μm微孔濾膜，然后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定，外表法定量，回收率為62.3％～95.3％；樣品批間和批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10％左右。在樣品提取和LC-MS/MS檢測時(shí)，對樣品提取液和檢測條件都進(jìn)行了優(yōu)化處理。本發(fā)明的檢測方法樣品處理程序簡單、快速，省去了樣品凈化過程，降低了檢測成本，并且可快速準(zhǔn)確的測定出獸藥中殘留的喹諾酮類藥物。方法測定底限為50μg/kg，完全滿足藥物殘留檢測的要求。

上述參照具體實(shí)施方式對該一種獸藥中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。