本發(fā)明涉及中藥質(zhì)量檢測領(lǐng)域，具體涉及含有黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方藥物制劑中的黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量檢測方法。

背景技術(shù)：

黃莪膠囊是浙江康恩貝制藥股份有限公司、浙江現(xiàn)代中藥與天然藥物研究院有限公司聯(lián)合中國中醫(yī)研究院廣安門醫(yī)院研制的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，其組方由黃芪、桃仁、莪術(shù)、大黃、土茯苓、薏苡仁、益母草、夏枯草、肉桂、北豆根、桔梗、川牛膝共12味中藥組成，具有益氣活血、清熱利濕功能，主治前列腺增生氣虛血瘀、濕熱阻滯證。黃莪膠囊已于2011年獲國家新藥證書，并經(jīng)SFDA批準上市。

黃莪膠囊是依據(jù)中醫(yī)理論和臨床實踐配制而成的治療前列腺增生藥物，其組方多 達十二味中藥材，制備工藝復(fù)雜。中國專利ZL200510060631.3公開了黃莪膠囊治療前列腺增生癥的相關(guān)研究結(jié)果及其制備方法，其制備方法是取肉桂、大黃、薏苡仁、桃仁碎成細粉；莪術(shù)飲片提揮發(fā)油；黃芪水提醇沉；桃仁、薏苡仁、土茯苓、北豆根、夏枯草、益母草、桔梗、川牛膝的飲片、莪術(shù)藥渣，水提濾液與黃芪乙醇液合并濃縮制干膏，粉碎，過篩，加入莪術(shù)揮發(fā)油及肉桂等藥物的細粉，配以藥用輔料制成膠囊。黃芪是黃莪膠囊組方的君藥，益氣、推動血行，可消散血瘀，是黃莪膠囊的主要藥效成分之一，文獻“HPLC-ELSD測定黃莪通閉膠囊中黃芪甲苷的含量”和藥品注冊標準都采用HPLC-ELSD法測定了黃莪膠囊中黃芪甲苷的含量，雖然后者還采用薄層色譜法鑒別莪術(shù)、大黃、熊果酸和桂皮醛，但這些已公開資料都僅對黃芪甲苷進行定量分析，缺乏對其他組分的測定分析，有可能導(dǎo)致其它組分含量的不穩(wěn)定甚至缺乏，這將使黃莪膠囊的質(zhì)量難以得到全面控制。

尤其是，中藥材莪術(shù)在黃莪膠囊組方中為臣藥，具有行氣活血功效，但其主要的有效成分是一種易揮發(fā)性油，其在制備和儲藏過程中都容易因為揮發(fā)而含量損失；而且，莪術(shù)油的生物利用度較低。因此，如何有效減少莪術(shù)油在生產(chǎn)、儲存過程中的揮發(fā)、提高其生物利用度,達到安全有效、質(zhì)量可控的目標，是黃莪膠囊在技術(shù)研究中要重點解決的問題。研究人員在黃莪膠囊制備過程中采用β-環(huán)糊精包結(jié)莪術(shù)油的辦法解決了這個難題。而有關(guān)研究也表明，莪術(shù)油包結(jié)率的高低影響著黃莪膠囊治療前列腺增生癥的療效。但是莪術(shù)油的成分較為復(fù)雜且含量較低，國內(nèi)外常用牻牛兒酮、莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮等為莪術(shù)油質(zhì)量的檢測指標；而牻牛兒酮的含量最為豐富且最穩(wěn)定，因此，以牻牛兒酮為莪術(shù)油的質(zhì)量檢測指標是一種較受推薦的方法。所以，為了保證黃莪膠囊組方中各味藥材的協(xié)同作用，為了保證黃莪膠囊質(zhì)量的穩(wěn)定性和療效的有效性，在黃莪膠囊的質(zhì)量控制方法中，不僅要檢測黃芪甲苷的含量，而且有必要同時測定其牻牛兒酮的含量。

黃芪甲苷通常作為評價黃芪藥材質(zhì)量優(yōu)劣的標準，目前含有黃芪甲苷的中藥有黃 芪藥材和含有黃芪的膠囊、顆粒、散劑等中藥復(fù)方制劑。而黃芪甲苷為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，難溶于氯仿、乙酸乙酯等弱酸性有機溶劑。其早期的含量測定主要使用薄層掃描法，如張怡等(中國醫(yī)藥雜志2004.1(5):185-186)采用雙波長-薄層色譜法測定康胃泰膠囊中黃芪甲苷的含量，樣品平均回收率為98.27%；但該方法重復(fù)性較差。隨著應(yīng)用研究的不斷深入，逐漸發(fā)展出采用HPLC法分離測定黃芪甲苷的含量，該方法也先后經(jīng)歷HPLC-UV法和HPLC-ELSD法的演變，ELSD法具有靈敏度高、適用性廣的優(yōu)點，尤其適用于在近紫外區(qū)無紫外吸收或紫外吸收較弱的物質(zhì)，如黃芪甲苷等。李毅等(時珍國醫(yī)國藥2011.22(3):768-769)先采用石油醚溶解活血散結(jié)合劑（組方為當歸、黃芪、莪術(shù)、川芎、昆布等藥材），水層多步正丁醇提取，然后用氨試液洗滌，再將正丁醇溶液于水浴中蒸干，最后加甲醇溶解得供試品溶液，用shim-pack C18-ODS(150mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以乙腈-水（32∶68）流動相測定活血散結(jié)合劑中黃芪甲苷的含量，結(jié)果表明HPLC-ELSD法操作簡便，重復(fù)性好，靈敏度高，專屬性強。

《中國藥典》2010版以牻牛兒酮為指標，采用薄層色譜法鑒別莪術(shù)藥材；且莪術(shù)藥 材的含量測定規(guī)定莪術(shù)揮發(fā)油的含量不得少于1.5%（mg/g）。牻牛兒酮作為莪術(shù)藥材質(zhì)量評價指標已得到普遍認可，其為倍半萜類化合物，其能溶于甲醇、乙醇、石油醚等有機溶劑中，不溶于水。莪術(shù)等含有牻牛兒酮的藥材和注射劑、膠囊等復(fù)方制劑中牻牛兒酮含量測定早期曾經(jīng)采用比色法，但精密度、重復(fù)性和適用性存在局限，后來多采用HPLC法和GC法，HPLC法是牻牛兒酮含量測定最常使用的檢測方法。梁小潔等(貴州師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版2011.29(1):92-94)直接用甲醇溶解保婦康泡沫劑制得供試品溶液，用SpherisorbC18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱，以乙腈-甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶25∶25）為流動相測定牻牛兒酮的含量。結(jié)果表明，HPLC法測定牻牛兒酮含量操作簡單，重復(fù)性好。

已有上百種同時含有黃芪和莪術(shù)的中藥復(fù)方制劑被批準上市，但目前對這類復(fù)方 制劑的質(zhì)量控制大部分仍采用以黃芪甲苷為單一的質(zhì)量控制指標，也尚未見一次性同時測定黃芪甲苷和牻牛兒酮含量的報道。這是由于在提取黃芪甲苷時，多采用水溶解后多步醇提堿洗，這是公認的提取黃芪甲苷的方法，但是牻牛兒酮不溶于水，采用該傳統(tǒng)提取方法無法同時提取黃芪甲苷和牻牛兒酮，高效液相色譜難以測到黃莪膠囊中的牻牛兒酮。因此，同時提取黃芪甲苷和牻牛兒酮是采用高效液相色譜法檢測黃莪膠囊質(zhì)量的前提，也是目前研究的難點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：本發(fā)明的目的在于提供一種同時測定含有黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方藥物制劑中的黃芪甲苷和牻牛兒酮含量的高效液相色譜測定方法。該方法可同時測定此類復(fù)方藥物制劑中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量，具有良好的精密度、重現(xiàn)性和可靠性，可用于包括已上市的黃莪膠囊在內(nèi)的含有黃芪和莪術(shù)的復(fù)方藥物制劑的質(zhì)量控制。

本發(fā)明運用循證醫(yī)學(xué)研究方法對黃莪膠囊治療前列腺增生癥的中醫(yī)理論進行分 析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪益氣、推動血行，可消散血瘀，莪術(shù)行氣活血，兩者是黃莪膠囊的主要藥效成分；有關(guān)臨床研究證實，缺乏黃芪和莪術(shù)的黃莪膠囊在治療前列腺增生癥上效果微弱，黃芪和莪術(shù)是黃莪膠囊組方中相當重要的組分。國內(nèi)外相關(guān)研究分別將黃芪甲苷、牻牛兒酮作為黃芪和莪術(shù)的質(zhì)量檢測指標，但是黃芪甲苷傳統(tǒng)的水提醇沉法無法同時提取牻牛兒酮，因此目前采用高效液相色譜法一次性同時檢測黃芪甲苷和牻牛兒酮含量仍有一定的困難。本發(fā)明針對黃芪甲苷和牻牛兒酮不同的化學(xué)性質(zhì)，首先對黃莪膠囊進行前處理，然后直接進樣檢測黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：

含有黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方黃莪膠囊制劑的測定方法，

（1）供試品溶液的制備：取黃莪膠囊制劑，傾出內(nèi)容物，混勻，精密稱定10g置250ml容量瓶中，精密加甲醇100ml，搖勻稱定重量；超聲處理（功率150W，頻率50Hz）30min，放置24h，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻；靜置12h，轉(zhuǎn)速2000r/min離心5min，吸取上清液，過45μm濾紙，收集濾液；

濾液直接過中性硅膠氧化鋁柱，用甲醇洗脫，洗脫液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液；

對照品溶液的制備：取黃芪甲苷和牻牛兒酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0.5mg、牻牛兒酮0.10mg的溶液，即得對照品溶液；

（2）高效液相色譜條件：采用Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱；以乙腈（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫：0-20min，30%A→40%A；20-30min,40%A→60%A；

30-50min，60%A→70%A，流速為1.0ml/min，柱溫25～40℃；AllerchELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器，檢測參數(shù)：漂移管溫度101℃，氮氣流速2.7L/min；檢測波長為200～215nm；

（3）檢測方法，按照《中國藥典》2010年版1部附錄ⅥD高效液相色譜法測定黃莪膠囊中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量：精密吸取供試品溶液10μl，注入高效液相色譜儀，測定，計算，即得。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：

（1）采用甲醇溶解黃莪膠囊粉末代替?zhèn)鹘y(tǒng)的水溶解，解決了無法采用黃芪甲苷傳統(tǒng)的提取方法同時提取黃芪甲苷和牻牛兒酮的問題，使得采用高效液相色譜法同時測定黃莪膠囊中黃芪甲苷和牻牛兒酮這兩種主要成分的含量成為可能。

（2）采用甲醇過濾后直接過中性硅膠氧化鋁柱代替多次醇提堿洗，不但有效去除了供試品溶液中的磷脂、色素等雜質(zhì)，而且減少了提取中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量損失，提高了含量測定的準確度。

（3）采用HPLC-ELSD法一次性同時測定了黃莪膠囊中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含 量，并對其測定波長進行了研究，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷和牻牛兒酮在208nm處吸收良好。

通過本發(fā)明黃莪膠囊質(zhì)量檢測方法，可以一次性同時有效地測定黃莪復(fù)方制劑中 黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量，提高了黃莪膠囊質(zhì)量測定的準確性和產(chǎn)品的穩(wěn)定性，有利于提高工業(yè)化生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

具體實施方式

本發(fā)明結(jié)合具體實施例進一步說明如下。

實施例1

1、儀器：

Agilent 1100高效液色譜儀；Allerch ELSD-2000蒸發(fā)光散射檢測器；中性氧化鋁柱4g/12ml；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器；METTLER AE240電子天平。

2、試藥：

采用黃莪膠囊（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號：091207）；不含黃芪和莪術(shù)的黃莪膠囊（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號:100824）；黃芪甲苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-200613，含量測定用）；牻牛兒酮（中國食品藥品檢定研究院，批號：111665-200902，98.8%，含量測定用）；甲醇和乙腈（色譜純）；其他試劑都為分析純。

3、色譜條件：

Waters Symmetry C18(4.6mm×250mm，5μm)色譜柱；以乙腈（A）-水（B）為流動相，梯度洗脫（0-20min，30%A→40%A；20-30min，40%A→60%A；30-50min，60%A→70%A），流速為1.0ml/min，柱溫30℃；蒸發(fā)光散射檢測器參數(shù)：漂移管溫度101℃，氮氣流速2.7L/min；檢測波長為208nm。

4、試驗方法：

4.1對照品溶液的制備

取黃芪甲苷和牻牛兒酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含黃芪甲苷0.5mg、牻牛兒酮0.10mg的溶液，即得對照品溶液。

4.2供試品溶液的制備

取黃莪膠囊制劑，傾出內(nèi)容物，混勻，精密稱定10g置250ml容量瓶中，精密加甲醇100ml，搖勻稱定重量；超聲處理（功率150W，頻率50Hz）30min，放置24h，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻；再靜置12h，轉(zhuǎn)速2000r/min離心5min，吸取上清液過45μm濾紙，收集濾液；濾液過中性硅膠氧化鋁柱，用甲醇洗脫；將洗脫液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

4.3不含黃芪和莪術(shù)的黃莪膠囊的陰性溶液的制備

取不含黃芪和莪術(shù)的黃莪膠囊，按4.2供試品溶液的制備方法制備陰性溶液。

4.4含量測定方法

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，分析（其中，A為黃芪甲苷，B為牻牛兒酮）。

5、結(jié)果表明：

陰性溶液對測定基本無干擾，供試品溶液中黃芪甲苷、牻牛兒酮與雜質(zhì)峰分離良好，不干擾測定。

綜上，本發(fā)明所建立的高效液相色譜法（HPLC-ELSD）同時測定含黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方藥物制劑黃莪膠囊中黃芪甲苷和牻牛兒酮的含量，（該方法）具有操作簡便、精密度好、重復(fù)性高的特點，可更全面、更有效地控制含黃芪和莪術(shù)藥材的復(fù)方藥物制劑黃莪膠囊質(zhì)量。