本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的分離與測定方法。
背景技術(shù)：
：卡泊三醇化學(xué)名稱為9，10-開環(huán)膽甾-24-環(huán)丙基-5，7，10(19)，22-四烯-1，3，24三醇，其分子式為C27H40O3，分子量：412.61?？ú慈贾饕糜趯こＰ豌y屑病的局部治療。化合物L(fēng)是合成卡泊三醇的一個重要的中間體，其結(jié)構(gòu)式如下：在中間體L的合成過程中，會產(chǎn)生多種雜質(zhì)如Mb、副產(chǎn)物Mb的20S-異構(gòu)體、Mc及Mc的20S-異構(gòu)體等，這些雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下：上述的雜質(zhì)中，Mb及其副產(chǎn)物Mb的20S-異構(gòu)體因含有某些表現(xiàn)為毒性、致突變或致癌等作用的基團(tuán)因而警示其可能具有基因毒性，所謂基因毒性是指能直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生致突變和致癌作用。具有基因毒性作用的基團(tuán)一般具有親電試劑的性質(zhì)，這些基團(tuán)在生理條件下同體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)或其他重要成分中的親核中心發(fā)生取代反應(yīng)，使這些成分發(fā)生不可逆的損傷，表現(xiàn)為毒性、致突變或致癌等作用。表現(xiàn)為毒性、致突變或致癌等作用的基團(tuán)舉例如下：a、惶酰烷酯b、芳香硝基c、芳香偶氮d、芳香氮氧-化物e、芳香伯胺或者仲胺f、烷基肼g、酯醛基h、N-甲醇基i、鹵代烯烴j、氮芥基k、氯胺l、β-內(nèi)酯m、乙烯亞胺n、鹵代烷o、烏拉坦p、N-亞硝基胺q、芳胺或酚r、環(huán)氧基卡泊三醇中間體L在合成過程中產(chǎn)生的上述雜質(zhì)尤其是Mb及其副產(chǎn)物Mb的20S-異構(gòu)體除去不完全最終會影響藥物的純度和質(zhì)量。因此，為了控制中間體L的質(zhì)量，需要對中間體L及其相關(guān)雜質(zhì)進(jìn)行分離和測定。但是，目前還沒有分離及測定中間體L及其相關(guān)雜質(zhì)的HPLC方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種分離卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的有效分離；本發(fā)明的目的之二在于提供一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，利用高效液相色譜法，能夠?qū)崿F(xiàn)中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的有效分離與測定。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：分離卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，所述的方法采用硅膠為固定相，以乙酸乙酯-正己烷為流動相進(jìn)行分離。本發(fā)明所述的方法適用于上述的卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的分離，可用于單獨分離某一種物質(zhì)，也可同時分離卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)。本發(fā)明所述的一種分離卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，優(yōu)選的，所述相關(guān)雜質(zhì)為Mb、Mb的20S異構(gòu)體、Mc和Mc的20S異構(gòu)體中的一種或多種。一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，具體步驟如下：取中間體L及相關(guān)雜質(zhì)對照品加稀釋劑溶解制備成已知濃度的對照品溶液，取供試品加稀釋劑溶解制備成供試品溶液，分別取對照品溶液及供試品溶液進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，比較供試品溶液與對照品溶液中對應(yīng)出峰時間的雜質(zhì)的峰面積，計算供試品中所含卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的含量；所述高效液相色譜分析采用硅膠為填充劑的色譜柱，以乙酸乙酯-正己烷為流動相進(jìn)行分析。本發(fā)明所述的高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法適用于卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的分離和測定，可用于單獨檢測某一種物質(zhì)，也可同時分離和檢測卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)。進(jìn)一步，所述方法還包括如下步驟：分別取中間體L及相關(guān)雜質(zhì)對照品，分別用稀釋劑溶解制成中間體L定位溶液及各相關(guān)雜質(zhì)的定位溶液，分別取中間體L定位溶液及各相關(guān)雜質(zhì)的定位溶液進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析， 確定中間體L及各相關(guān)雜質(zhì)的保留時間。進(jìn)一步，所述的一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，所述相關(guān)雜質(zhì)為Mb、Mb的20S異構(gòu)體、Mc和Mc的20S異構(gòu)體中的一種或多種。進(jìn)一步，所述的一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，所述稀釋劑為流動相乙酸乙酯-正己烷或流動相中的任一種有機(jī)溶劑如乙酸乙酯或正己烷。進(jìn)一步，所述的一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，所述流動相流速為0.5-1.5ml/min，優(yōu)選1ml/min。進(jìn)一步，所述的一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，所述流動相中乙酸乙酯與正己烷的體積比為1-4：96-99。進(jìn)一步，所述的一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，所述高效液相色譜分析采用紫外檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長為272±2nm。進(jìn)一步，所述的一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，所述色譜柱的規(guī)格為4.6×250mm，5μm。本發(fā)明的有益效果在于：(1)本發(fā)明的一種分離卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的有效分離，實現(xiàn)了雜質(zhì)有效控制，從根本上確定了產(chǎn)品質(zhì)量，具有簡便，快速，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點；(2)本發(fā)明的一種高效液相色譜法分離測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的有效分離與測定，同時采用高效液相色譜法操作簡單，準(zhǔn)確度高；(3)本發(fā)明所述的方法適用于卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)的分離和/或測定，可用于單獨分離和/或測定某一種物質(zhì)，也可同時分離和/或測定卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法更快捷，提高了效率，具有顯著的進(jìn)步性。附圖說明圖1為實施例1中稀釋劑的HPLC圖，圖中的色譜峰為稀釋劑的色譜峰。圖2為實施例1中Mb的20S異構(gòu)體的HPLC圖，圖中的色譜峰為Mb的20S異構(gòu)體的色譜峰，保留時間為9.2min。圖3為實施例1中Mb的HPLC圖，圖中的色譜峰為Mb的色譜峰，保留時間為9.8min。圖4為實施例1中Mc的20S異構(gòu)體的HPLC圖，圖中的色譜峰為Mc的20S異構(gòu)體的色譜峰，保留時間為17.2min。圖5為實施例1中Mc的HPLC圖，圖中的色譜峰為Mc的色譜峰，保留時間為19.3min。圖6為實施例2中混合溶液的HPLC圖，圖中的色譜峰依次為Mb的20S異構(gòu)體、Mb、Mc的20S異構(gòu)體、Mc、中間體L的色譜峰，保留時間依次為：9.4min、9.9min、17.4min、19.8min、82.8min。圖7為實施例3中供試品的HPLC圖，圖中的色譜峰為供試品的色譜峰，保留時間為81.9min。具體實施方式所舉實施例是為了更好地對本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限于所舉實施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述
發(fā)明內(nèi)容對實施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實施例中所涉及的對照品來源：L：重慶華邦制藥有限公司，批號：Cal-L-140903，99.0％；Mb：重慶華邦制藥有限公司，批號：Cal-Mb-140809，96.4％；Mb的20S-異構(gòu)體：重慶華邦制藥有限公司，批號：140701，97.8％；Mc：重慶華邦制藥有限公司，批號：Cal-Mc-140903，96.3％；Mc的20S-異構(gòu)體：重慶華邦制藥有限公司，批號：140803-2，92.9％；以下實施例中，本發(fā)明的方法中，采用的儀器及色譜條件如下：高效液相色譜儀：SHIMADZULC-2010AHT；色譜柱：ZORBAXSIL(4.6×250mm，5μm)；流動相：乙酸乙酯：正己烷(2：98)；波長：272nm；柱溫：25℃；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣體積：20μl；稀釋劑：流動相(乙酸乙酯：正己烷(2：98))。實施例1相關(guān)雜質(zhì)Mb、Mb的20S異構(gòu)體、Mc、Mc的20S異構(gòu)體的定位(1)Mb、Mb的20S異構(gòu)體、Mc、Mc的20S異構(gòu)體的定位溶液的配制Mb定位溶液：稱取雜質(zhì)Mb15.11mg，置50ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。Mc定位溶液：稱取雜質(zhì)Mc15.26mg，置50ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。Mb的20S異構(gòu)體定位溶液：稱取雜質(zhì)Mb的20S異構(gòu)體15.28mg，置50ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。Mc的20S異構(gòu)體定位溶液：稱取雜質(zhì)Mc的20S異構(gòu)體15.22mg，置50ml量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。(2)Mb、Mb的20S異構(gòu)體、Mc、Mc的20S異構(gòu)體的定位分別取稀釋劑、Mb定位溶液、Mc定位溶液、Mb的20S異構(gòu)體定位溶液、Mc的20S異構(gòu)體定位溶液，按上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1-5，由結(jié)果可知，稀釋劑不干擾樣品的檢測，Mb的20S異構(gòu)體保留時間為9.2min，Mb保留時間為9.8min，Mc的20S異構(gòu)體保留時間為17.0min，Mc保留時間為19.3min。實施例2卡泊三醇中間體L及相關(guān)雜質(zhì)Mb、Mb的20S異構(gòu)體、Mc、Mc的20S異構(gòu)體的分離(1)中間體L及相關(guān)雜質(zhì)Mb、Mb的20S異構(gòu)體、Mc、Mc的20S異構(gòu)體的混合溶液的制備分別精密移取實施例1中制備的Mb、Mc、Mb的20S異構(gòu)體和Mc的20S異構(gòu)體的定位溶液各3.3ml，置同一100ml量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻得混合定位儲備溶液，然后精密稱取中間體L對照品10.26mg置10ml量瓶中，加入混合定位儲備溶液1.0ml，再加稀釋劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合溶液。(2)取混合溶液20μl進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖6，由結(jié)果可知，中間體L的保留時間為81.9min，在本發(fā)明的分離條件下中間體L與各相關(guān)雜質(zhì)完全分開，Mb的20S異構(gòu)體與其他雜質(zhì)的分離度符合要求。中間體L對照品中未檢出雜質(zhì)Mb的20S異構(gòu)體。實施例3供試品的分離檢測(1)供試品溶液配制：取供試品約10mg，置10ml量瓶中，加稀釋劑使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。(2)分別取供試品溶液、混合溶液20μl進(jìn)樣，按照上述的色譜條件進(jìn)行高效液相色譜分析，記錄色譜圖，供試品溶液的色譜圖如圖7所示，供試品溶液中均未檢出相關(guān)雜質(zhì)Mb、Mb的20S異構(gòu)體、Mc和Mc的20S異構(gòu)體。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。當(dāng)前第1頁1 2 3