本發(fā)明涉及色譜微柱，尤其是涉及可以實現(xiàn)同一根色譜微柱中精準(zhǔn)可控地填充兩種固定相材料，用于復(fù)雜生物樣品在線二維分離的精準(zhǔn)可控雙相色譜微柱及其制備方法。

背景技術(shù)：

液相色譜是目前最為常用的用于實際生物樣品分析的分離技術(shù)。近年來，隨著高效液相色譜儀器的不斷進(jìn)步以及色譜填料技術(shù)的不斷改進(jìn)，液相色譜的分辨率有了很大的提升，然而即便是使用高效的色譜柱在非常緩的梯度下運(yùn)行，液相色譜的峰容量都將達(dá)到一個理論峰容量在1400～1600之間的極限，對于高度復(fù)雜的生物樣品來說單一分離模式的液相色譜的峰容量仍顯不足。

多維分離是通過耦合不同模式的單維分離技術(shù)以構(gòu)建更高分辨率的分離系統(tǒng)，理論上多維分離的峰容量為每一維峰容量的乘積，因此多維分離是進(jìn)一步提高峰容量的有效方法。構(gòu)建理想多維分離平臺有兩個標(biāo)準(zhǔn)，第一個標(biāo)準(zhǔn)是維與維之間必須是正交的，即每一個分離維度都是基于不同的分離機(jī)制對樣品進(jìn)行分離。在多維分離系統(tǒng)中，耦合正交的單維分離技術(shù)是獲得高峰容量的一個先決條件。第二個標(biāo)準(zhǔn)是在后一個維度的分離中不能損失前一維已經(jīng)獲得的分辨率，即對第一維的樣品不能采樣過疏，樣品在轉(zhuǎn)移至下一維的過程中也不能出現(xiàn)區(qū)帶展寬或返混的現(xiàn)象。

構(gòu)建二維液相色譜分離平臺最為直接的方法是將兩種不同分離機(jī)理的色譜柱直接相連，傳統(tǒng)的方法是將兩根含有不同填料的色譜柱用連接管或者二通進(jìn)行連接，將樣品捕集在第一根柱子的柱頭后使用臺階梯度以此洗脫，每一個洗脫的組分經(jīng)第二根色譜柱分離后進(jìn)入光學(xué)檢測器或進(jìn)行質(zhì)譜檢測。近些年還出現(xiàn)了一種多維蛋白鑒定技術(shù)(MudPIT)用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)分析，即在同一根空毛細(xì)管中先后填充反相C18填料和強(qiáng)陽離子交換填料，這種含有兩種固定相材料的雙相色譜柱省去了柱間的連接管，減少了操作的繁瑣性，同時降低了柱外峰展寬對于分離效率的影響。該多維蛋白鑒定技術(shù)對啤酒酵母全蛋白組進(jìn)行分析鑒定出1484種蛋白質(zhì)，充分展現(xiàn)了其在高通量蛋白組分析中的應(yīng)用潛質(zhì)。但傳統(tǒng)的雙相色譜柱由于無法將兩種填料物理性地區(qū)隔開，無法分別精確控制兩種填料柱床的長度，使得分離重現(xiàn)性難以保障。因此，研制一種精準(zhǔn)可控的雙相色譜微柱是這一技術(shù)領(lǐng)域的關(guān)鍵問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一目的在于提供可精確控制兩種固定相柱床長度，有效解決分離重現(xiàn)性的問題，方法操作簡單，使用方便，利于推廣的精準(zhǔn)可控雙相色譜微柱。

本發(fā)明的第二目的在于提供精準(zhǔn)可控雙相色譜微柱的制備方法。

所述精準(zhǔn)可控雙相色譜微柱設(shè)有一根毛細(xì)管，毛細(xì)管內(nèi)分別填充有兩種色譜固定相，兩種色譜固定相之間設(shè)有一個多孔微球作為填料定位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)隔，毛細(xì)管兩端分別設(shè)有柱塞，所述柱塞為多孔微球。

所述毛細(xì)管可采用中空石英毛細(xì)管，所述毛細(xì)管的內(nèi)徑可為25～500μm。

所述作為填料定位點(diǎn)的多孔微球和作為柱塞的多孔微球均可采用二氧化硅多孔微球。

所述精準(zhǔn)可控雙相色譜微柱的制備方法，包括以下步驟：

1)截取所需長度的毛細(xì)管，根據(jù)所需兩種固定相柱床長度在毛細(xì)管外標(biāo)出填料定位點(diǎn)，將一顆多孔微球壓入毛細(xì)管一端，然后將微球推至填料定位點(diǎn)；

2)將所要填充的色譜左固定相加入溶劑中，超聲震蕩制成勻漿，通過外力驅(qū)動使得勻漿通過毛細(xì)管，溶劑被填料定位點(diǎn)處的多孔微球濾過，填料本身則在毛細(xì)管中逐步堆砌成柱床；在填充完成后，毛細(xì)管一端壓入一個同上述一致的多孔微球作為柱塞；

3)將所要填充的第二種右固定相加入溶劑中，超聲震蕩制成勻漿，通過外力驅(qū)動從毛細(xì)管另一端進(jìn)入毛細(xì)管中，待填充完成后，壓入同樣的多孔微球作為柱塞，從而完成整根兩相色譜微柱的制備。

在步驟1)中，所述多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述毛細(xì)管可采用中空石英彈性毛細(xì)管，毛細(xì)管的內(nèi)徑可為25～500μm；所述在毛細(xì)管外標(biāo)出填料定位點(diǎn)可用記號筆在毛細(xì)管外標(biāo)出填料定位點(diǎn)；所述將微球推至填料定位點(diǎn)可使用外徑小于毛細(xì)管內(nèi)徑的石英絲將微球推至填料定位點(diǎn)。

在步驟2)中，所述左固定相可選自反相C18填料、陰離子交換填料、陽離子交換填料、親水作用填料等中的一種。

在步驟3)中，所述右固定相可選自反相C18填料、陰離子交換填料、陽離子交換填料、親水作用填料等中的一種。

在步驟2)和3)中，所述作為柱塞的多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述溶劑可采用密度和黏度較大的有機(jī)溶劑，所述有機(jī)溶劑可選自二氧六環(huán)、環(huán)己烷、四氯化碳等中的一種；所述外力驅(qū)動可采用液流驅(qū)動或氣流驅(qū)動；所述左固定相和右固定相可為同種色譜填料或不同種色譜填料。

本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

1)可以在同一根毛細(xì)管內(nèi)精準(zhǔn)可控地填充兩段不同種類的色譜填料作為固定相，可精確控制兩種固定相柱床長度。

2)本發(fā)明可用于毛細(xì)管液相色譜系統(tǒng)中，利用單顆粒多孔微球作為柱塞以及填料定位點(diǎn)，將兩種不同材料的色譜固定相依次填充在同一毛細(xì)柱管中，可以實現(xiàn)對蛋白質(zhì)、多肽等復(fù)雜生物樣品的在線二維分離，大幅度提高對復(fù)雜生物樣品的分辨能力，縮短實驗所需時間，簡化操作步驟，提高分離重現(xiàn)性。

3)集成化程度高，一根柱子內(nèi)即可實現(xiàn)兩種分離模式的串聯(lián)，無需額外的連接裝置。同時本發(fā)明利用單顆粒多孔微球作為柱塞和填料定位點(diǎn)，可以精準(zhǔn)控制兩種固定相的柱床長度，大幅度提高了多次實驗間的分離重現(xiàn)性，提高分離效率。

4)方法操作簡單，使用方便，利于推廣。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為使用本發(fā)明得到的牛血清白蛋白酶解物二維分離(離子交換-反相)色譜圖。

具體實施方式

以下結(jié)合圖1和2詳細(xì)說明本發(fā)明的幾種可選實施例。

參見圖1，本發(fā)明實施例設(shè)有一根中空石英毛細(xì)管1，毛細(xì)管1內(nèi)分別填充有左固定相3和右固定相5兩種色譜固定相，左固定相3和右固定相5之間設(shè)有一個多孔微球作為填料定位點(diǎn)4進(jìn)行區(qū)隔，毛細(xì)管1兩端分別設(shè)有柱塞2和6。

所述毛細(xì)管1的內(nèi)徑為25～500μm。

所述作為填料定位點(diǎn)4的多孔微球和作為柱塞的多孔微球均可采用二氧化硅多孔微球。

所述精準(zhǔn)可控雙相色譜微柱的制備方法為：

1)截取所需長度的毛細(xì)管，根據(jù)所需兩種固定相柱床長度在毛細(xì)管外用記號筆標(biāo)出填料定位點(diǎn)，將一顆多孔微球壓入毛細(xì)管一端，然后使用外徑小于毛細(xì)管內(nèi)徑的石英絲將微球推至填料定位點(diǎn)；所述多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述毛細(xì)管可采用中空石英彈性毛細(xì)管，毛細(xì)管的內(nèi)徑可為25～500μm。

2)將所要填充的色譜左固定相加入溶劑中，超聲震蕩制成勻漿，通過外力驅(qū)動使得勻漿通過毛細(xì)管，溶劑被填料定位點(diǎn)處的多孔微球濾過，填料本身則在毛細(xì)管中逐步堆砌成柱床；在填充完成后，毛細(xì)管一端壓入一個同上述一致的多孔微球作為柱塞；所述左固定相可選自反相C18填料、陰離子交換填料、陽離子交換填料、親水作用填料等中的一種。

3)將所要填充的第二種右固定相加入溶劑中，超聲震蕩制成勻漿，通過外力驅(qū)動從毛細(xì)管另一端進(jìn)入毛細(xì)管中，待填充完成后，壓入同樣的多孔微球作為柱塞，從而完成整根兩相色譜微柱的制備。所述右固定相可選自反相C18填料、陰離子交換填料、陽離子交換填料、親水作用填料等中的一種。

在步驟2)和3)中，所述作為柱塞的多孔微球可采用二氧化硅多孔微球；所述溶劑可采用密度和黏度較大的有機(jī)溶劑，所述有機(jī)溶劑可選自二氧六環(huán)、環(huán)己烷、四氯化碳等中的一種；所述外力驅(qū)動可采用液流驅(qū)動或氣流驅(qū)動；所述左固定相和右固定相可為同種色譜填料或不同種色譜填料。

以下給出具體實施例。

實施例1：精準(zhǔn)可控雙相色譜微柱的制備

截取內(nèi)徑100μm，外徑365μm的彈性石英毛細(xì)管15cm(河北永年銳灃色譜器件有限公司)，在距離一端出口10cm處用記號筆標(biāo)出填料定位點(diǎn)，將毛細(xì)管一端置于盛有直徑110μm的多孔二氧化硅微球(英國X-tec公司)的離心管中，將單顆多孔二氧化硅微球壓入毛細(xì)管一端，然后使用外徑為90μm的石英毛細(xì)管(河北永年銳灃色譜器件有限公司)在顯微鏡下將多孔二氧化硅微球推至填料定位點(diǎn)。

稱取10mg粒徑為5μm的C18反相硅膠鍵合填料(Waters公司)作為左固定相，將所取填料加入到1mL二氧六環(huán)中制備成勻漿，超聲震蕩使其充分混勻。取1mL所得勻漿裝入濕法填柱機(jī)的勻漿罐中，將毛細(xì)管長端通過接頭與勻漿罐出口相連。打開濕法填柱機(jī)的泵開關(guān)，在液流驅(qū)動下，勻漿罐中的勻漿被壓入毛細(xì)管中，其中溶劑被位于填料定位點(diǎn)的多孔二氧化硅微球濾過，填料顆粒在柱管內(nèi)逐步堆砌成柱床。待柱床增長至毛細(xì)管端口時，關(guān)閉濕法填柱機(jī)開關(guān)，取下毛細(xì)管，在端口處按上述同樣方法壓入一顆多孔二氧化硅微球作為柱塞。

將所得毛細(xì)管柱倒置使得短端空管與濕法填柱機(jī)相連，稱取10mg粒徑為5μm的強(qiáng)陽離子交換填料(Waters公司)作為右固定相，按上述同樣方法制成勻漿后，在濕法填柱機(jī)的液流驅(qū)動下從短端填入，待填充完成后按上述方法在端口處壓入一顆多孔二氧化硅微球作為柱塞。從而完成整根雙相色譜微柱的制作。

實施例2：精準(zhǔn)可控雙相色譜微柱用于牛血清白蛋白酶解物的二維分離(強(qiáng)陽離子交換-反相)

將實施例1中所制備的雙相色譜微柱安裝在納流液相色譜儀(美國Dionex公司)上，安裝方向需使得液流先流經(jīng)短端即強(qiáng)陽離子交換柱床，然后流經(jīng)長端即反相柱床。配制1M的NaCl溶液，含有0.1％三氟乙酸的乙腈溶液和含有0.1％三氟乙酸的超純水分別作為色譜流動相A、B、C，待系統(tǒng)壓力平衡后，使用系統(tǒng)自帶的自動進(jìn)樣器吸取樣品20μL，將流動相流路設(shè)置為A+C，分別使用0％A，0.1％A，1％A，5％A，10％A，50％A，100％A的流動相配比(對應(yīng)色譜圖中NaCl濃度分別為PMD、1mM、10mM、50mM、100mM、500mM、1000mM)對樣品進(jìn)行臺階式等度洗脫，流速為300nL/min，每次洗脫10min。每進(jìn)行一次洗脫后將流路切換至B+C，使用5％～40％B對柱床進(jìn)行梯度洗脫，流速為300nL/min，每次洗脫60min洗脫后的溶液進(jìn)入色譜柱后端紫外檢測器進(jìn)行檢測，檢測波長為214nm。所得色譜圖如圖2所示。