本發(fā)明涉及土壤微生物污染誘導(dǎo)群落耐性的測定，具體的說是一種新的對比不同土壤微生物污染誘導(dǎo)群落耐性的測定方法。
背景技術(shù)：
長期以來，土壤面臨著各種污染物的威脅。土壤微生物作為土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要驅(qū)動(dòng)者，在維持土壤養(yǎng)分循環(huán)、污染物分解等方面具有不可替代的作用。可以說，土壤微生物在一定程度上指示了土壤乃至整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況。污染物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響可以體現(xiàn)在分子、細(xì)胞、個(gè)體和群落水平上，同時(shí)具有不同的時(shí)間尺度效應(yīng)。因此，如何評價(jià)污染物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響是環(huán)境科學(xué)研究中人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。在群落水平方面，長期以來人們多采用反映群落功能、活性和數(shù)量的指標(biāo)，例如群落多樣性、酶活性及生物量等，并以這些指標(biāo)在數(shù)量上的大小變化來評價(jià)污染的生態(tài)學(xué)效應(yīng)和污染程度(Flieβbach et al.,1994；Mikanová et al.,2002；Mikanová,2006)。事實(shí)上，這些指標(biāo)反映的信息并不全面，例如不能反映污染導(dǎo)致的微生物群落對于相同或不同污染物耐受性的變化，也不能反映污染條件下群落的穩(wěn)定性和恢復(fù)力等(Griffiths et al.,2001)。
污染誘導(dǎo)群落耐性的概念于上世紀(jì)80年代由Blanck等人引入到生態(tài)毒理學(xué)領(lǐng)域，并被作為一項(xiàng)指標(biāo)，從生物群落耐性方面評價(jià)污染物的生態(tài)學(xué)效應(yīng)(Rutgers et al.,1998；Siciliano et al.,2000)。目前國內(nèi)外測定土壤微生物PICT的方法根據(jù)檢測載體大體可以分為兩類：1)基于土壤菌液的檢測法包括胸腺嘧啶摻入率、亮氨酸摻入率、碳源利用圖譜(Biolog法)和菌落平板計(jì)數(shù)等；2)原位檢測法包括底物誘導(dǎo)呼吸和放射性同位素標(biāo)記底物的礦化速率。由于受到檢測方法的限制，目前對于土壤微生物群落PICT研究仍然以土壤菌液為主，但該類方法仍存在很多不足：如提取過程會導(dǎo)致微生物群落組成可能和原始土壤中存在偏差；使用土壤菌液進(jìn)行檢測的指標(biāo)通常要經(jīng)過培養(yǎng)而忽略了不可培養(yǎng)微生物的作用以及培養(yǎng)過程帶來的選擇性放大和縮小問題；另外，菌液的提取方法目前只適用于細(xì)菌群落，因此也限制了該方法的推廣。
參考文獻(xiàn)：
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MikanováO.2006.Effects of heavy metals on some soil biological parameters[J].Journal of Geochemical Exploration,88:220-223
Rutgers M,Sweegers B M C,Wind B S,van Veen R P M,Folkerts A J,Posthuma L,Breure A M.1998.Pollution–induced community tolerance in terrestrial microbial communities[C].Conference Proceedings Contaminated Soil,Thomas Telford,London,UK:337-343
Siciliano S D,Gong P,Sunahara G I,Greer C W.2000.Assessment of 2,4,6-trinitrotoluene toxicity in field soils by pollution-induced community tolerance,denaturing gradient gel electrophoresis,and seed germination assay[J].Environmental Toxicology&Chemistry,19:2154-2160
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種重復(fù)性好，靈敏度高，并且簡單易行的測定土壤微生物污染誘導(dǎo)群落耐性的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
1)采集土壤樣品，過孔徑2mm篩，取過篩樣品，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間持水量的40％；
注：土壤田間持水量,就是指毛管懸著水達(dá)到最大量時(shí)的土壤含水量占烘干土重的百分比,也就是在田間自然狀況下土壤所能保持的最大水量，一般采用環(huán)刀法測定。
2)檢測板制備：將甲酚紅(12.5mg·L-1)、氯化鉀(150mmol·L-1)和碳酸氫鈉(2.5mmol·L-1)混合制成的指示劑100mL溶解在50mL的Noble瓊脂(3％)中(保持55-60℃使得指示劑呈液體狀態(tài))，然后使用多通道移液槍將以上溶液添加到檢測板的微孔中(每孔150μL)，室溫條件下凝固后將配制好的檢測板存放在含有堿石灰的干燥器里待用；
3)用去離子水把葡萄糖制備成儲備液(93.6g·L-1)，用多通道移液槍將其添加到深孔板的微孔中(每孔25μL)，再將不同濃度污染物，包括對照(不添加污染物，只添加25μL去離子水)至少5個(gè)濃度梯度，且最高濃度應(yīng)使得土壤誘導(dǎo)呼吸減少50％以上，按照從小到大的順序添加到深孔板的微孔中(每孔25μL)；
注：該污染物主要是化學(xué)污染物，如重金屬(如銅、鋅、鎘、鉛和砷等)，抗生素(如四環(huán)素類、氟喹諾酮類和磺胺類等)和多環(huán)芳烴(如萘、蒽、菲和芘等)等。
4)用加樣裝置向已添加葡萄糖和污染物的微孔中添加待測土壤樣品(每孔0.850g土壤)；
5)570nm或590nm波長下測定密封前檢測板微孔的吸光度；
6)將深孔板和檢測板孔口一一相對，用墊圈連接，再用夾子固定封閉；
7)將固定封閉后的深孔板和檢測板在培養(yǎng)箱25℃條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，570nm或590nm波長下再次讀取檢測板微孔的吸光值；
8)誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度(CO2產(chǎn)生率)根據(jù)下述公式計(jì)算：
CO2(％)＝A+B/(1+D×Ai6)
式中，A＝–0.2265，B＝–1.606，D＝–6.771，Ai6為規(guī)范化的樣品添加碳源并培養(yǎng)6h后檢測板的吸光值。
采用下述公式將數(shù)據(jù)規(guī)范化：
Ai6＝(At6/At0)×Mean(At0)
式中，At6為樣品添加碳源并培養(yǎng)6h后檢測板的吸光值；At0為樣品未添加碳源培養(yǎng)時(shí)檢測板的吸光值，Mean(At0)為樣品未添加碳源培養(yǎng)時(shí)整個(gè)檢測板所有微孔吸光度的平均值。
CO2產(chǎn)生率[μg·(g·h)-1]根據(jù)下式計(jì)算：
CO2產(chǎn)生率＝[CO2(％)/100]×L×(44/22.4)×(12/44)×[273/(273+T)]/(W×U)/t
式中，T為培養(yǎng)溫度(25℃)，L為檢測板單個(gè)微孔的體積(945μL)，W為土壤鮮重(0.850g)，U為土壤含水率(40％)，t為培養(yǎng)時(shí)間(6h)。
9)采用數(shù)據(jù)分析軟件(如Excel,SPSS和SAS等)模擬污染物濃度與CO2產(chǎn)生率的相關(guān)方程，并以對照為100％誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度計(jì)算土壤誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度減少50％的污染物濃度(IC50)，通過對比不同土壤的IC50值即可比較不同土壤微生物群落誘導(dǎo)耐性的大小，即數(shù)值越大該土壤對此污染物的微生物群落誘導(dǎo)耐性越大。
本方法涉及的原理：
本方法以使土壤微生物群落的相對活性(誘導(dǎo)呼吸)減少50％的污染物濃度(IC50)來表示土壤微生物群落誘導(dǎo)耐性的大小。
本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)如下：
1)采用原位檢測方法：避免土壤菌液提取方法的不足；
2)該方法不需要同位素和ECO板等價(jià)格昂貴的試劑和耗材；
3)采用酶標(biāo)儀檢測吸光度的變化，該儀器具有價(jià)格便宜、操作簡便快捷等優(yōu)點(diǎn)，且運(yùn)行和維護(hù)成本低，完全能達(dá)到測定需要。
試劑與儀器：
試劑：葡萄糖，甲酚紅，氯化鉀，碳酸氫鈉，Noble瓊脂
儀器：Microresp設(shè)備(http://www.microresp.com)；酶標(biāo)儀，多通道移液器
注意事項(xiàng)：
1)試驗(yàn)中所用器皿需徹底洗凈，并用離子水沖洗，以確保無污染物質(zhì)存在；
2)因?yàn)闄z測板和深孔板是面對面放置，所以兩個(gè)板的順序正好相反；
3)若土壤誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度與污染物濃度相關(guān)性不顯著，可增加污染物濃度或者加入污染物后預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間。
附圖說明
圖1土壤誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度與銅濃度的相關(guān)性
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：
具體過程如下：
1)采集沈陽生態(tài)站未污染土壤樣品，過孔徑2mm篩后，取過篩樣品，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間持水量的40％；
2)檢測板制備：將甲酚紅(12.5mg·L-1)、氯化鉀(150mmol·L-1)和碳酸氫鈉(2.5mmol·L-1)混合制成的指示劑100mL溶解在50mL的Noble瓊脂(3％)中(保持55-60℃使得指示劑呈液體狀態(tài))，然后使用多通道移液槍將以上溶液添加到檢測板的微孔中(每孔150μL)，室溫條件下凝固后將配制好的檢測板存放在含有堿石灰的干燥器里待用；
3)用去離子水把葡萄糖制備成儲備液(93.6g L-1)，將其添加到深孔板中(每孔25μL)，再將不同濃度的銅(0，50，100，200，500和1000mg kg-1)按照從低到高的順序添加到深孔板的微孔中(每孔25μL)；
4)用加樣裝置向已添加葡萄糖和銅的微孔中添加待測土壤樣品(每孔0.850g)；
5)570nm波長下測定密封前檢測板微孔的吸光度；
6)將深孔板和檢測板孔口一一相對，用墊圈連接，再用夾子固定封閉；
7)將固定封閉后的深孔板和檢測板在培養(yǎng)箱25℃條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，570nm波長下再次讀取檢測板微孔的吸光值；
8)根據(jù)上述公式計(jì)算誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度(CO2產(chǎn)生率)，并以添加銅濃度和誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度為橫縱坐標(biāo)作圖，采用數(shù)據(jù)分析軟件(Excel)模擬，如圖1所示。
從圖中可以看出，該土壤誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度與銅濃度成顯著負(fù)相關(guān)(R2＝0.8532,p<0.01)，因此該方法能很好地反映銅污染對土壤微生物活性的影響。
實(shí)施例2：
1)采集不同銅濃度(0，50，200，500和1000mg kg-1)預(yù)培養(yǎng)28天的土壤，過孔徑2mm篩后，取過篩樣品，調(diào)節(jié)土壤含水量為田間持水量的40％；
2)檢測板制備：將甲酚紅(12.5mg·L-1)、氯化鉀(150mmol·L-1)和碳酸氫鈉(2.5mmol·L-1)混合制成的指示劑100mL溶解在50mL的Noble瓊脂(3％)中(保持55-60℃使得指示劑呈液體狀態(tài))，然后使用多通道移液槍將以上溶液添加到檢測板的微孔中(每孔150μL)，室溫條件下凝固后將配制好的檢測板存放在含有堿石灰的干燥器里待用；
3)用去離子水把葡萄糖制備成儲備液(93.6g L-1)，將其添加到深孔板的微孔中(每孔25μL)，再將不同濃度的銅(0，50，100，200，500，1000mg kg-1)按照從低到高的順序添加到深孔板的微孔中(每孔25μL)；
4)用加樣裝置向已添加葡萄糖和銅的微孔中添加待測土壤樣品(每孔0.850g)；
5)570nm波長下測定密封前檢測板微孔的吸光度；
6)將深孔板和檢測板孔口一一相對，用墊圈連接，再用夾子固定封閉；
7)將固定封閉后的深孔板和檢測板在培養(yǎng)箱25℃條件下培養(yǎng)6小時(shí)后，570nm波長下再次讀取檢測板微孔的吸光值；
8)根據(jù)上述公式計(jì)算誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度(CO2產(chǎn)生率)，并采用數(shù)據(jù)分析軟件(Excel)模擬污染物濃度與CO2產(chǎn)生率的相關(guān)方程，并以對照為100％誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度計(jì)算土壤誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度減少50％的污染物濃度(IC50值)，結(jié)果如表1所示。
表1 不同銅污染程度土壤誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度的IC50值
從表中可以看出，土壤誘導(dǎo)呼吸強(qiáng)度的IC50值隨銅濃度升高而增加，這表明受到銅污染的土壤微生物群落耐性增強(qiáng)。
結(jié)論
由以上兩實(shí)例的結(jié)果可以看出，本發(fā)明靈敏度高，簡單易行的優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足比較不同土壤微生物污染誘導(dǎo)群落耐性的要求。