本發(fā)明屬于微生物治理重金屬污染
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種能高效生物轉(zhuǎn)化污染土壤中鎘形態(tài)的微生物菌劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著礦產(chǎn)資源的開(kāi)發(fā)利用，工業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展和各種化學(xué)產(chǎn)品、農(nóng)藥及化肥的廣泛使用，含重金屬的污染物通過(guò)各種途徑進(jìn)入環(huán)境，造成土壤污染日益嚴(yán)重。目前我國(guó)受cd、hg、as、cr、pb污染的耕地面積約2000×104hm2，每年因重金屬污染而損失的糧食約1000×104t，受污染糧食多達(dá)1200×104t，經(jīng)濟(jì)損失至少達(dá)200×108元。重金屬污染物不能被化學(xué)或生物降解，易通過(guò)食物鏈途徑在植物、動(dòng)物和人體內(nèi)積累，毒性大，對(duì)生態(tài)環(huán)境、食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，農(nóng)田土壤重金屬污染己成為當(dāng)前日益嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，其污染來(lái)源和修復(fù)技術(shù)也一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。由于傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法的局限性，土壤重金屬修復(fù)越來(lái)越偏向于生物修復(fù)，其中植物修復(fù)比較普遍，但高富集植物的馴化培養(yǎng)以及生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等因素限制了植物修復(fù)的發(fā)展，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)以其經(jīng)濟(jì)高效的優(yōu)勢(shì)突顯出來(lái)。例如，李潔等人通過(guò)將1％的黑曲霉菌接種在1.5％的土漿濃度中進(jìn)行生物浸出，在11天時(shí)達(dá)到最大浸出率67.4％。再如，張靜霞等人利用自養(yǎng)菌和異養(yǎng)菌混合浸出湘江底泥時(shí)，以10％的菌種接種到5％的土漿濃度中，在48天時(shí)達(dá)到浸出率84.4％。與本發(fā)明的微生物菌劑相比，他們面臨浸出率低，以及時(shí)間周期長(zhǎng)等關(guān)鍵問(wèn)題。礦山廢水微生物早已廣泛應(yīng)用于冶金工業(yè)中，而很少將其獨(dú)特的功能在治理土壤中的重金屬元素中展現(xiàn)出來(lái)，主要是由于土壤體系十分復(fù)雜，有機(jī)物含量豐富，浸礦微生物難以存活。同時(shí)，由于浸礦微生物生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)條件較為苛刻，復(fù)配出一種可以快速生長(zhǎng)，條件簡(jiǎn)單易控且能高效轉(zhuǎn)化土壤中鎘形態(tài)的微生物菌劑十分必要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種微生物復(fù)合功能菌劑的應(yīng)用，該復(fù)合功能菌劑能將污染土壤中難利用鎘高效轉(zhuǎn)化成可溶態(tài)，實(shí)現(xiàn)快速，有效治理鎘污染的目的。一種能高效生物轉(zhuǎn)化土壤中鎘形態(tài)的微生物菌劑：該微生物菌劑主要包括以下菌種：產(chǎn)朊假絲酵母(candidautilis)、申克孢子絲菌(sporothrixsp.)、氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)、異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)；這些菌混合前分別在含鎘的培養(yǎng)基中進(jìn)行了馴化。進(jìn)一步的優(yōu)選，該微生物菌劑主要包括以下數(shù)量比例的菌混合而成：25～35％產(chǎn)朊假絲酵母菌(candidautilis)、15～20％申克孢子絲菌(sporothrixsp.)、15～20％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、15～20％嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)、5～15％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)；這些菌混合前分別在含鎘的培養(yǎng)基中進(jìn)行了馴化。所述的能高效生物轉(zhuǎn)化土壤中鎘形態(tài)的微生物菌劑的菌種的馴化過(guò)程如下：設(shè)置鎘的濃度梯度為1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l；培養(yǎng)基其它成分為：9k培養(yǎng)基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)；培養(yǎng)條件為:溫度20～30℃，轉(zhuǎn)速150～200r/min，產(chǎn)朊假絲酵母菌和申克孢子絲菌的初始ph為4.0，氧化亞鐵嗜酸硫桿菌、嗜酸硫桿菌和異化鐵還原菌的初始ph為2.0。首先分別將活化的5種菌濃達(dá)到5.0x107個(gè)/ml以上的菌液以8-12％(v/v)的接種量接種到100ml含1mg/lcdso4的培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)2-10天后再以8-12％體積的接種量接種到下一個(gè)鎘的濃度梯度培養(yǎng)基中，直到最終鎘濃度達(dá)到25mg/l。所述的能高效生物轉(zhuǎn)化土壤中鎘形態(tài)的微生物菌劑的配方來(lái)源以下過(guò)程：通過(guò)將長(zhǎng)期受到高濃度鎘污染的農(nóng)田土壤和富含鎘的鉛鋅礦坑廢水富集物接種到富集培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到新鮮的富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)5～10次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后獲得高效生物轉(zhuǎn)化土壤中鎘形態(tài)的微生物菌劑。所述的長(zhǎng)期受到高濃度鎘污染的農(nóng)田土壤來(lái)自于湖南省衡陽(yáng)大浦鎮(zhèn)礦區(qū)污染農(nóng)田土壤，污染年限長(zhǎng)達(dá)40年，鎘含量高達(dá)100ppm；礦坑廢水來(lái)自于湖南省郴州市柿竹園鉛鋅礦區(qū)，鎘含量高達(dá)20ppm。采集長(zhǎng)期受到高濃度鎘污染的土壤樣品，以2～10％(v/v)的比例接種到富集培養(yǎng)基中。采集富含鎘的鉛鋅礦坑廢水，以5～20％的(v/v)比例接種于9k培養(yǎng)基中，在初始ph1.8～2.5，溫度20～30℃，轉(zhuǎn)速150～200r/min條件下培養(yǎng)2～10天，直到菌濃達(dá)到4x108個(gè)/ml以上，然后以5～20％(v/v)的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的9k培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)5～10次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后獲得富含鎘的鉛鋅礦坑廢水富集物，然后以2～10％(v/v)接種到富集培養(yǎng)基中。富集培養(yǎng)基組成如下：9k培養(yǎng)基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)。所述的9k培養(yǎng)基成分如下：蒸餾水1000ml，3g/l的(nh4)2so4，0.5g/l的k2hpo4，0.1g/l的kcl，0.01g/l的ca(no3)2，0.5g/l的mgso4·7h2o。配制時(shí)，首先在9k培養(yǎng)基中加入0.01～0.5％酵母膏，同時(shí)配入0.01％～0.5％的葡萄糖溶液，在115～121℃高壓滅菌15～30分鐘，然后稱(chēng)取0.01～0.5％硫粉進(jìn)行紫外滅菌15-30min后加入。所述微生物菌劑的富集培養(yǎng)條件為：初始ph4.0～6.0，溫度20～35℃，轉(zhuǎn)速150～200r/min條件下富集培養(yǎng)2～10天，傳代培養(yǎng)8次以上，每次以8-12％(v/v)接種濃度接種于新鮮的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。最終得到的微生物菌劑ph為1.0～1.7，菌濃為1.0x109～4.0x109個(gè)/ml。采用上述方法得到的微生物菌劑進(jìn)行miseq測(cè)序，能夠得到主要的微生物種類(lèi)和相對(duì)豐度，然后根據(jù)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行本發(fā)明菌群的復(fù)配，得到功能統(tǒng)一的微生物菌劑。本發(fā)明菌劑使用時(shí)，將其稀釋至濃度為4.0x107～8.0x107個(gè)/ml，將稀釋后的菌劑加入到鎘污染土壤中，控制土壤質(zhì)量:稀釋菌劑體積＝(0.05～1.0)kg:1l，攪拌處理2～96h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明通過(guò)將鎘污染土壤中具有鎘轉(zhuǎn)化功能的微生物和鉛鋅礦坑廢水中的浸礦微生物富集物結(jié)合起來(lái)生成微生物菌劑，然后通過(guò)miseq測(cè)序得到主要的微生物種類(lèi)和數(shù)量，然后復(fù)配得到功能統(tǒng)一的微生物菌劑；不僅突破了傳統(tǒng)物理和化學(xué)方法面臨的處理周期長(zhǎng)，成本高，不能從根本上減少土壤中鎘含量等缺點(diǎn)，也打破了植物和動(dòng)物富集法所面臨的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，不易存活等限制因素，本發(fā)明所述的微生物菌劑具有培養(yǎng)周期短，成本低，操作簡(jiǎn)單易控，能有效將難利用鎘轉(zhuǎn)化成可溶態(tài)，加速鎘溶出到溶液中來(lái)等優(yōu)勢(shì)，在土壤重金屬鎘修復(fù)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1是實(shí)施例1得到的微生物菌劑的生長(zhǎng)曲線；圖2是實(shí)施例1得到的微生物菌劑的ph值變化曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：微生物菌劑的采集、培養(yǎng)和馴化培養(yǎng)基配制：9k培養(yǎng)基+0.1％酵母膏+0.1％葡萄糖+0.1％硫粉。9k培養(yǎng)基成分如下：蒸餾水1000ml，(nh4)2so43g/l，k2hpo40.5g/l，kcl0.1g/l，ca(no3)20.01g/l，mgso4·7h2o0.5g/l。首先在9k培養(yǎng)基中加上0.1％酵母膏，調(diào)節(jié)ph4.0，同時(shí)配制5％的葡萄糖溶液，在121℃高壓滅菌20分鐘，然后稱(chēng)取0.1％硫粉進(jìn)行紫外滅菌20min后加入。底泥采集于湖南省衡陽(yáng)大浦鎮(zhèn)礦區(qū)污染農(nóng)田土壤，污染年限長(zhǎng)達(dá)40年，鎘含量高達(dá)100ppm。利用五點(diǎn)采樣法采集5～10cm深的長(zhǎng)期受到高濃度鎘污染的土壤樣品，混勻后作為制備微生物菌劑的底泥，以5％的比例接種到富集培養(yǎng)基中。鉛鋅礦坑廢水富集物的制備包括如下步驟：采集富含鎘的鉛鋅礦坑廢水，以15％的比例接種于9k培養(yǎng)基中，在初始ph2.0，溫度30℃，轉(zhuǎn)速180r/min條件下富集培養(yǎng)5～7天，直到菌濃達(dá)到4x108個(gè)/ml以上，然后以10％的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的9k培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)6次富集培養(yǎng)后獲得鉛鋅礦坑廢水富集物，然后以5％的比例接種到富集培養(yǎng)基中。將富集培養(yǎng)基高溫滅菌后，加入5％的底泥和5％的礦坑廢水富集物，在30℃，轉(zhuǎn)速180r/min條件下富集培養(yǎng)7～10天。當(dāng)菌濃達(dá)到4.0x108個(gè)/ml以上后，以10％的接種濃度接種于新鮮的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)5～10天，經(jīng)過(guò)8次傳代培養(yǎng)后，獲得生長(zhǎng)周期基本穩(wěn)定在72h左右，ph1.5～1.7，菌濃1.0x109～4.0x109個(gè)/ml的微生物菌劑。選取第1代、第6代、第8代富集物進(jìn)行miseq測(cè)序，結(jié)果表明：第1代富集物主要由：42％產(chǎn)朊假絲酵母(candidautilis)、15％單胞瓶霉屬真菌(phialemoniumsp.)、5％蠟狀子囊菌(coniochaetavelutina)、23％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)、10％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)；第6代富集物主要由：30％產(chǎn)朊假絲酵母菌(candidautilis)、15％申克孢子絲菌(sporothrixsp.)、3％單胞瓶霉屬真菌(phialemoniumsp.)、20％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、12％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)、14％嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)組成；最終所得微生物菌劑的群落結(jié)構(gòu)主要由29％產(chǎn)朊假絲酵母菌(candidautilis)、17％申克孢子絲菌(phialemoniumsp.)、18％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、10％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)、17％嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)組成。實(shí)施例2：本發(fā)明微生物菌劑的復(fù)配根據(jù)實(shí)施例1測(cè)序的結(jié)果，按照以下數(shù)量比例的菌混合而成：25～35％產(chǎn)朊假絲酵母菌(candidautilis)、15～20％申克孢子絲菌(sporothrixsp.)、15～20％氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(acidithiobacillusferrooxidans)、15～20％嗜酸硫桿菌(sulfobacillusacidophilus)、5～15％異化鐵還原菌(shewanellaoneidensis)；這些菌混合前分別在含鎘的培養(yǎng)基中進(jìn)行了馴化。菌種的馴化過(guò)程如下：設(shè)置鎘的濃度梯度為1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l、20mg/l、25mg/l；培養(yǎng)基成分為：9k培養(yǎng)基+0.01～0.5％酵母膏(m/v)+0.01％～0.5％葡萄糖(m/v)+0.01～0.5％％硫粉(m/v)；培養(yǎng)條件為:溫度20～30℃，轉(zhuǎn)速150～200r/min，產(chǎn)朊假絲酵母菌和申克孢子絲菌的初始ph為4.0，氧化亞鐵嗜酸硫桿菌、嗜酸硫桿菌和異化鐵還原菌的初始ph為2.0。首先分別將活化的5種菌濃達(dá)到5.0x107個(gè)/ml以上的菌液以8-12％(v/v)的接種量接種到100ml含1mg/lcdso4的培養(yǎng)基中，馴化培養(yǎng)2-10天后再以8-12％體積的接種量接種到下一個(gè)鎘的濃度梯度培養(yǎng)基中，直到最終鎘濃度達(dá)到25mg/l。表1三個(gè)組合的菌劑配方組合產(chǎn)朊假絲酵母菌申克孢子絲菌氧化亞鐵嗜酸硫桿菌嗜酸硫桿菌異化鐵還原菌126％20％20％20％14％230％20％20％18％12％335％15％15％20％15％實(shí)施例3：微生物菌劑生物去除污染土壤中的鎘鎘污染土壤采自于湖南省衡陽(yáng)大浦鎮(zhèn)礦區(qū)污染農(nóng)田土壤，編號(hào)a、b、c。將土壤風(fēng)干后磨碎過(guò)100目篩，然后分別稱(chēng)取20g樣品到干凈小三角瓶中，封裝滅菌。實(shí)驗(yàn)所用菌劑包括：實(shí)施例2所得微生物菌劑a、實(shí)施例1的礦山廢水富集物b、直接由鎘污染土壤通過(guò)實(shí)施例1得到礦山廢水富集物相同方法富集得到的土壤富集物c、實(shí)施例1中將5％礦山廢水富集物和5％的底泥混合培養(yǎng)后的第1代富集物d。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：反應(yīng)體系為200ml富集培養(yǎng)基，初始ph4.0。每個(gè)樣品設(shè)置7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組都加入10％的污染土壤樣品，其中三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組接種10％的a(exp.)，一個(gè)接種10％的b(kk)，一個(gè)接種10％的c(sk)，一個(gè)接種10％的d(dk),一個(gè)不加菌(ck)，在30℃，180r/min條件下振蕩5天。每天測(cè)定ph，5天后離心收渣，將殘?jiān)L(fēng)干過(guò)100目篩，測(cè)定土壤中鎘含量，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明：實(shí)施例2制備的微生物菌劑的鎘去除率顯著優(yōu)于其他各組的效果。表2實(shí)施例3中鎘的去除率實(shí)驗(yàn)組abcck(對(duì)照)28.69％21.04％21.40％sk(土壤富集物)29.05％20.89％21.76％kk(礦山廢水富集物)51.09％49.86％44.81％dk(第1次富集物)72.33％65.87％57.99％exp.(實(shí)施例2所得微生物菌劑組合1)92.76％90.46％82.55％exp.(實(shí)施例2所得微生物菌劑組合2)94.98％91.25％84.21％exp.(實(shí)施例2所得微生物菌劑組合3)90.74％89.41％82.10％當(dāng)前第1頁(yè)12