本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是涉及一種注射用重組人尿激酶原的電泳純度測定方法。

背景技術(shù)：

尿激酶原是尿激酶的前體，是一種糖蛋白，由411個(gè)氨基酸組成，其本身無活性，經(jīng)纖維蛋白溶解酶和激肽酶的激活，使其Lys158-Ile159之間的肽鏈打開形成尿激酶，才能發(fā)揮其溶血栓的效能。是一種特異性的溶血栓的藥物。

上海天士力生產(chǎn)的重組人尿激酶原為通過基因工程方法構(gòu)建的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)表達(dá)獲得的，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治療，已于2011年作為國家一類新藥成功上市。

聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳技術(shù)是以聚丙烯酰胺凝膠做支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)，聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，很少帶有離子的側(cè)基，惰性好，電泳時(shí)，電滲作用小，幾乎無吸附作用，對(duì)熱穩(wěn)定，呈透明狀，易于觀察結(jié)果。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(簡稱Acr)和交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺(簡稱Bis)在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族大分子化合物。

聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳系統(tǒng)主要儀器包括：電泳儀、垂直平板電泳槽、微量注射器、燈泡瓶、移液器、染色與脫色缸、量筒、滴管等。使用的試劑包括：1.丙烯酰胺(單體，簡稱Acr)，2.1％瓊脂，3.N，N，N，，N，—四甲基乙二胺(TEMED)，4.N，N，—亞甲基雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑，簡稱Bis)，5.過硫酸銨(聚合時(shí)的催化劑)，6.試劑A(pH8.9)：36.6g三羥甲基氨基甲烷(Tris)和48mL1mol/l HCl混合加水至100ml，7.試劑B(pH 6.7)：5.98g Tris和48ml1mol/lHCl混合加水至100ml，8.電極緩沖液：6.0gTris和28.8g甘氨酸混合加水至1000ml，用時(shí)稀釋10倍，9.0.05％溴酚藍(lán)，10.20％甘油，11.7％醋酸，12.1mol/l HCl，13.蛋白樣品：人或動(dòng)物血清。

聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳系統(tǒng)主要操作步驟包括：1.垂直平板電泳槽的安 裝，2.凝膠的制備，包括(1)分離膠的制備，(2)濃縮膠的制備3.加樣，4.電泳，5.染色，6.鑒定等步驟。根據(jù)染色所出現(xiàn)的區(qū)帶，分析樣品的純度。

對(duì)于重組人尿激酶原而言，為保證重組人尿激酶原的質(zhì)量，需要對(duì)尿激酶原的純度進(jìn)行檢測。目前的檢測方法檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，且供試品分離不理想，尿激酶原樣品通常100℃高溫處理，造成蛋白質(zhì)破壞，以致測定方法準(zhǔn)確度不高，不適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的檢驗(yàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種注射用重組人尿激酶原的電泳純度測定方法。該方法準(zhǔn)確性好，適合產(chǎn)業(yè)化的日常檢驗(yàn)。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種注射用重組人尿激酶原的純度電泳測定方法，所述方法包括如下步驟：

(1)供試品溶液的制備：取注射用重組人尿激酶原置于冰上融化，MilliQ水稀釋，加入非還原樣品緩沖液后，置于55-80℃加熱1-5分鐘后，立即置于冰浴中得非還原態(tài)供試品溶液；

(2)Marker溶液的制備：取Marker溶液融化后置于80-100℃水浴1-5分鐘，立即置冰浴備用；

(3)測定方法：采用垂直板凝膠電泳系統(tǒng)，對(duì)供試品溶液和Marker溶液進(jìn)行檢測，兩種溶液的上樣量為10-20μl，儀器初始電壓50-60 V，進(jìn)入分離膠時(shí)調(diào)整電壓100-110V，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶跑到凝膠下邊緣時(shí)，電泳結(jié)束，電泳后分別染色、脫色、得到圖譜，根據(jù)圖譜計(jì)算供試品溶液純度。

其中，所述的非還原樣品緩沖液是指，三羥基氨基甲烷0.2-0.5份、十二烷基硫酸鈉0.5-1份、溴酚藍(lán)0.001-0.003份，丙三醇2-6份、鹽酸0.05-1份，加MilliQ注射用水溶解并定容到10份得到的緩沖液。優(yōu)選的是，三羥基氨基甲烷(Tris，電泳純)0.3份、十二烷基硫酸鈉(SDS,電泳純)0.8份、溴酚藍(lán)0.002份，丙三醇(甘油)4份、鹽酸0.2份，加MilliQ注射用水溶解并定容到10份即得。

本發(fā)明所述的份，固體是指重量(g)份，液體為體積(ml)份。例如1g＝1份、1ml＝1份。

其中，所述的Marker溶液，是購買自GE Healthcar、Takara、Geneshun、 Solarbio、TIANGEN

其中，MilliQ注射用水，企業(yè)自制。

其中，所述垂直板凝膠電泳系統(tǒng)屬于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上對(duì)電泳條件進(jìn)行了篩選。

本發(fā)明的電泳緩沖液采用以下緩沖液：三羥基氨基甲烷10-20份、甘氨酸65-85份，十二烷基硫酸鈉4-8份、加MilliQ注射用水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5-9.0后，繼續(xù)用milliQ水定容到5000份，即得。優(yōu)選的緩沖液為，三羥基氨基甲烷(Tris，至少分析純級(jí))15.0份，甘氨酸(至少分析純級(jí))72.0份，十二烷基硫酸鈉(SDS，至少分析純級(jí))5.0份，加4000份左右的MilliQ注射用水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.3后，繼續(xù)用milliQ水加至5000份，充分混勻，即得。

本發(fā)明所用的凝膠板為SDS-聚丙烯酰胺凝膠板，由玻璃板、15％分離膠溶液、5％濃縮膠溶液制備得到。其中所述的15％分離膠溶液包括MilliQ注射用水1-2.5份、30％凝膠貯備液1.5—3.5份、Tris-HCl緩沖液(PH8.8、1.5M)1-2.5份、10％SDS0.02-0.1份、10％AP 0.01-0.05份、TEMED0.001-0.005份；優(yōu)選的，所述15％分離膠溶液包括包括MilliQ注射用水1.2份、30％凝膠貯備液2.5份、Tris-HCl緩沖液(PH8.8、1.5M)1.25份、10％SDS0.05份、10％AP 0.025份、TEMED0.002份。所述5％濃縮膠溶液包括MilliQ注射用水1-2份、30％凝膠貯備液0.2-0.5份、Tris-HCl緩沖液(PH6.8、1.0M)0.1-0.5份、10％SDS0.01-0.04份、10％AP0.01-0.04份、TEMED0.001-0.005份。優(yōu)選的，所述5％濃縮膠溶液包括MilliQ注射用水1.4份、30％凝膠貯備液0.33份、Tris-HCl緩沖液(PH6.8、1.0M)0.25份、10％SDS 0.02份、10％AP0.02份、TEMED 0.002份。

凝膠貯備液,是購買自Sigma、Cellchipbj、Maibio、普利萊

TEMED,是購買自Sigma、Macklin、Amethyst、TCI

SDS,是購買自Sigma、SERVA Electrophoresis Gmblt、Macklin、TCI

AP,是購買自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、Macklin、TCI、Amethyst

本發(fā)明的測定方法，步驟(1)中，加熱溫度優(yōu)選55-65℃水浴加熱3-5分鐘。MilliQ水稀釋至蛋白含量18-23μg/28-33μl，非還原態(tài)供試品溶液蛋白含量為18-23μg/38-43μl。最佳蛋白含量20μg/30μl，非還原態(tài)供試品溶液蛋 白含量為20μg/40μl。

本發(fā)明的測定方法，步驟(2)中所述的Marker范圍95KD-15KD。

本發(fā)明的測定方法，步驟(3)中，上樣前供試品溶液和Marker溶液，過濾或離心后，冷凍待上樣。優(yōu)選采用離心機(jī)離心，離心條件為8000rmp/min，離心1min后置冰上冷凍。所述垂直板凝膠電泳系統(tǒng)的初始電壓優(yōu)選為58V，進(jìn)入分離膠時(shí)調(diào)整電壓108V，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶跑到凝膠下邊緣時(shí)，電泳結(jié)束。

用本發(fā)明的方法，對(duì)真實(shí)的樣品進(jìn)行了檢測，得到了電泳條帶圖譜，本發(fā)明用QuantityOne分析軟件對(duì)電泳條帶圖譜的圖像進(jìn)行分析，得出要報(bào)告的參數(shù)(分子量KD(Mol.Wt)、掃描豐度Int×mm(Trace Qty)、百分比％(Relative Qty)等。

本發(fā)明的測定方法，其中電泳條件是經(jīng)過篩選得到的，例如，本發(fā)明采用以下方法制備凝膠板，取得了意想不到的技術(shù)效果：

制備凝膠板方法如下：

安裝玻璃板

1.帶好乳膠手套，取出一套潔凈(無塵、無污漬)的玻璃板，將短玻璃板放在長玻璃板有突起的一面，將兩塊玻璃板的下端與兩邊對(duì)齊。

2將緊貼的兩塊玻璃板放入玻板夾內(nèi)，在確保兩塊玻板的下端與兩邊對(duì)齊后，卡緊玻板夾，并將此套裝置固定于制膠架上。

3.配膠(在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，但配膠過程中，不能開風(fēng)量)也可以采用商購預(yù)制膠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1：分離膠和濃縮膠配制表

4.配分離膠

◆按上述配方順序在通風(fēng)櫥中配制分離膠于一個(gè)燒杯中；

◆每加一樣試劑都要進(jìn)行混勻，混勻時(shí)可以用手輕輕的搖動(dòng)燒杯，使杯中的液體轉(zhuǎn)起來，或用手中的移液槍進(jìn)行吹吸混勻；待加完TEMED并混勻后，用移液槍迅速吸取配好的分離膠液體沿玻板夾縫邊緣灌入到玻板夾縫中，每套玻板夾縫約加入3.2ml分離膠；

◆然后再于膠液液面上緩緩加入MilliQ注射用水(約2～3mm高)，封住膠液液面，這樣形成的凝膠表面就會(huì)光滑平整。

◆等待約30-60分鐘，分離膠凝固，小心傾倒出分離膠上方的MilliQ水，殘液可用濾紙吸干，注意玻板夾縫中不要留有濾紙的毛屑。

5.配濃縮膠

◆分離膠上方的殘余液體吸干后，即可開始配制濃縮膠。

◆按上述配方順序配制濃縮膠于一個(gè)燒杯中，每加一樣試劑都要進(jìn)行混勻，混勻時(shí)可以用手輕輕的搖動(dòng)燒杯，使杯中的液體轉(zhuǎn)起來，或用手中的移液槍進(jìn)行吹吸混勻。

◆待加完TEMED并混勻后，用移液槍迅速吸取濃縮膠液體沿玻板夾縫邊緣灌入到分離膠上面，至玻璃板槽剛好被灌滿為止。

6.插梳子

◆濃縮膠灌入后，迅速將電泳專用梳子(10孔，0.75mm)插入到玻板夾縫中；

◆插入時(shí)先使梳子一邊接觸到濃縮膠，再逐漸的把梳子的另一邊接觸濃縮膠，這樣可以排除由于插入時(shí)帶入的氣泡。

◆將梳子一直插到底，使梳子柄上的突起碰倒玻板上緣即可，等待約30-60分鐘濃縮膠凝固，此時(shí)形成的上樣孔的最大上樣量為33μl。

7.配制好的膠，宜放置過夜后使用(可以得到較好的分離效果)。為防 止膠變干，玻板四周用封口膜封口，將制好的膠置于冰箱2-8℃冷藏條件下可保存14天。

本發(fā)明還包括步驟(4)染色，具體如下

將凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R250染液中，在搖床上搖動(dòng)染色(染色用的容器應(yīng)能避光)過夜，染液的多少以搖動(dòng)時(shí)液面仍沒過凝膠為宜，期間要輕輕搖動(dòng)，同時(shí)避免染液溢出。

當(dāng)Marker的各分子量條帶能清晰可見時(shí)，即可染色結(jié)束。

步驟(5)脫色

脫色液，共計(jì)更換3-5次脫色

若膠增加，應(yīng)分別獨(dú)立脫色，不能混放于一個(gè)容器內(nèi)進(jìn)行，會(huì)影響脫色的均一性。

當(dāng)Marker條帶清洗可見，凝膠底色幾乎無色時(shí)，脫色結(jié)束。

步驟(6)：脫色好的凝膠用milliQ注射水清洗干凈后，浸泡于milliQ水中。

步驟(7)圖像采集及分析

將經(jīng)脫色清洗后的凝膠置于成像儀中成像，獲得凝膠圖像。

1拍照結(jié)束后，取出膠用塑封膜封存。

采用QuantityOne分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，測得重組人尿激酶原蛋白分子量為40.0～60.0KD。

本發(fā)明的有益效果通過下述試驗(yàn)例闡述

試驗(yàn)例一，供試品溶液制備優(yōu)化試驗(yàn)

試驗(yàn)方法：按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行

試驗(yàn)結(jié)果：見表2

表2優(yōu)化試驗(yàn)純度比較

試驗(yàn)結(jié)論：

因重組人尿激酶原不耐受高溫，溫度對(duì)其有明顯影響，故將供試品溶液的處理溫度進(jìn)行調(diào)整，表2，優(yōu)化后SDS純度有明顯提高。3批樣品的重現(xiàn)性好，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。圖1、2可以看出，優(yōu)化樣品處理步驟后，產(chǎn)品的雜質(zhì)帶明顯減小。檢驗(yàn)方法經(jīng)優(yōu)化后可以減少檢驗(yàn)樣品處理過程帶來的干擾，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

試驗(yàn)例二，供試品前處理溫度的選擇

本發(fā)明的供試品溶液的處理方式是經(jīng)過優(yōu)化得到的：

由于重組人尿激酶原不耐受高溫，溫度對(duì)其有明顯影響，故將供試品溶液的處理溫度進(jìn)行了優(yōu)化，本發(fā)明的尿激酶原的處理溫度分別采用：100℃、80℃、70℃、65℃、55℃，經(jīng)電泳檢測后，發(fā)現(xiàn)，尿激酶原在55-65℃下進(jìn)行加熱，最終得到的純度最高。見表3、圖3。

表3不同溫度下的重組人尿激酶原純度

附圖說明

圖1為供試品優(yōu)化前電泳圖像

圖2為供試品優(yōu)化后的電泳圖像

圖3為不同溫度的電泳圖像

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的具體實(shí)施方式僅是用來說明本發(fā)明權(quán)利要求，對(duì)權(quán)利要求范圍沒有限定作用。

實(shí)施例1

真實(shí)樣品的檢測：

1、操作程序

1.1檢驗(yàn)所需試劑、溶液

1.1.1 30％凝膠貯備液：電泳純，2-8℃避光保存。

1.1.2 1.5mo1/L Tris-HCl緩沖液(pH8.8)：稱取18.2g三羥基氨基甲烷(Tris，電泳純)，加適量MilliQ注射用水溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.8，定容至100ml，2-8℃保存。

1.1.3 1.0mol/L Tris-HCl緩沖液(pH6.8)：稱取12.1g三羥基氨基甲烷(Tris，電泳純)，加適量MilliQ注射用水溶解，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，定容至100ml，2-8℃保存。

1.1.4 10％十二烷基硫酸鈉(SDS)：稱取10g的十二烷基硫酸鈉(SDS，電泳純)，加入100ml MilliQ注射用水溶解，即得，常溫保存。

1.1.5 10％過硫酸銨(AP)：稱取0.1g的過硫酸銨，加入1ml milliQ注射用水溶解，50μl/支進(jìn)行分裝，即得，-20℃避光保存，有效期1個(gè)月。

1.1.6四甲基乙二胺溶液(TEMED)：電泳純，2-8℃避光保存。

1.1.7非還原型樣品緩沖液(4×)：稱取三羥基氨基甲烷(Tris，電泳純)0.303g、十二烷基硫酸鈉(SDS,電泳純)0.8g、溴酚藍(lán)2mg，量取丙三醇(甘油)4ml、鹽酸0.189ml，加MilliQ注射用水溶解并定容至10ml，0.25ml/支分裝，-20℃保存。

1.1.8還原型樣品緩沖液(4×)：稱取三羥基氨基甲烷(Tris，電泳純)0.303g、十二烷基硫酸鈉(SDS,電泳純)0.8g、溴酚藍(lán)2mg，量取丙三醇(甘油)4ml、鹽酸0.189ml、二硫蘇糖醇(DTT)0.617g，加MilliQ注射用水溶解并定容至10ml，0.25ml/支分裝，-20℃保存。

1.1.9電泳緩沖液：稱取15.0g三羥基氨基甲烷(Tris，至少分析純級(jí))，72.0g甘氨酸(至少分析純級(jí))，5.0g十二烷基硫酸鈉(SDS，至少分析純級(jí))，加4000ml左右的MilliQ注射用水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.3后，繼續(xù)用milliQ水加至5000ml，充分混勻，即得。

1.1.10染色液：稱取1.0g考馬斯亮藍(lán)，加入甲醇200ml、乙酸50ml、純化水250ml，混勻即得，常溫避光保存。

1.1.11脫色液：量取甲醇400ml、乙酸100ml與純化水500ml混勻，即得。

1.1.12蛋白低分子量Marker：應(yīng)購買涵蓋95KD-15KD范圍的Marker。

1.1.13蛋白低分子量Marker溶液：按照Marker說明進(jìn)行配制。

1.2檢驗(yàn)所需儀器：垂直板凝膠電泳系統(tǒng)，拍照成像系統(tǒng)。

1.3檢驗(yàn)環(huán)境條件：20℃～30℃。

1.4檢驗(yàn)前準(zhǔn)備

1.4.1安裝玻璃板

1.4.1.1帶好乳膠手套，取出一套潔凈(無塵、無污漬)的玻璃板，將短玻璃板放在長玻璃板有突起的一面，將兩塊玻璃板的下端與兩邊對(duì)齊。

1.4.1.2將緊貼的兩塊玻璃板放入玻板夾內(nèi)，在確保兩塊玻板的下端與兩邊對(duì)齊后，卡緊玻板夾，并將此套裝置固定于制膠架上。

1.4.2配膠(在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，但配膠過程中，不能開風(fēng)量)也可以采用商購預(yù)制膠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

分離膠和濃縮膠配制表

1.4.2.1配分離膠

◆按上述配方順序在通風(fēng)櫥中配制分離膠于一個(gè)燒杯中；

◆每加一樣試劑都要進(jìn)行混勻，混勻時(shí)可以用手輕輕的搖動(dòng)燒杯，使杯中的液體轉(zhuǎn)起來，或用手中的移液槍進(jìn)行吹吸混勻；待加完TEMED并混勻后，用移液槍迅速吸取配好的分離膠液體沿玻板夾縫邊緣灌入到玻板夾縫中，每套玻板夾縫約加入3.2ml分離膠；

◆然后再于膠液液面上緩緩加入MilliQ注射用水(約2～3mm高)，封住膠液液面，這樣形成的凝膠表面就會(huì)光滑平整。

◆等待約30-60分鐘，分離膠凝固，小心傾倒出分離膠上方的MilliQ水，殘液可用濾紙吸干，注意玻板夾縫中不要留有濾紙的毛屑。

1.4.2.2配濃縮膠

◆分離膠上方的殘余液體吸干后，即可開始配制濃縮膠。

◆按上述配方順序配制濃縮膠于一個(gè)燒杯中，每加一樣試劑都要進(jìn)行混勻，混勻時(shí)可以用手輕輕的搖動(dòng)燒杯，使杯中的液體轉(zhuǎn)起來，或用手中的移液槍進(jìn)行吹吸混勻。

◆待加完TEMED并混勻后，用移液槍迅速吸取濃縮膠液體沿玻板夾縫邊緣灌入到分離膠上面，至玻璃板槽剛好被灌滿為止。

1.4.2.3插梳子

◆濃縮膠灌入后，迅速將電泳專用梳子(10孔，0.75mm)插入到玻板夾縫中；

◆插入時(shí)先使梳子一邊接觸到濃縮膠，再逐漸的把梳子的另一邊接觸濃縮膠，這樣可以排除由于插入時(shí)帶入的氣泡。

◆將梳子一直插到底，使梳子柄上的突起碰倒玻板上緣即可，等待約30-60分鐘濃縮膠凝固，此時(shí)形成的上樣孔的最大上樣量為33μl。

1.4.2.4配制好的膠，宜放置過夜后使用(可以得到較好的分離效果)。為防止膠變干，玻板四周用封口膜封口，將制好的膠置于冰箱2-8℃冷藏條件下可保存14天。

1.4.3接電極

1.4.3.1先從制膠架上取下玻璃板夾(綠色)，再從玻璃板夾上卸下含凝膠的玻璃板；

1.4.3.2使短玻璃板朝向內(nèi)，并將玻璃板三明治的下緣卡入電極下端的槽中，一個(gè)電極可接兩份玻璃板三明治(若只作一塊板電泳時(shí)，則電極的另一面放入一塊塑料擋板)；

1.4.3.3將電極放入電極室中，鎖緊電極室；

1.4.3.4將電極室放入電泳槽中，倒入電泳緩沖液(注意電極室內(nèi)部注入 的電泳緩沖

液的液面必須沒過兩塊短玻璃板，但不能超過兩塊長玻璃板；電極室外部注入的電泳緩沖液不能沒過任何一個(gè)玻璃板)；

1.4.3.5小心拔出梳子，不要把膠碰壞，使電泳緩沖液自然浸潤上樣槽，要使上樣孔內(nèi)的氣泡全部排出,否則會(huì)影響加樣效果。

1.5檢驗(yàn)步驟

1.5.1樣品制備

1.5.1.1供試品溶液制備

◆取待測樣品置冰上，待樣品融化后(待測樣品僅可凍融1次)，根據(jù)樣品的蛋白含量，用MilliQ水稀釋至20μg/30μl。

◆向上述裝有20μg/30μl濃度樣品溶液的離心管中加入10μl的非還原樣品緩沖液，即得。(非還原態(tài)供試品蛋白含量為20μg/40μl)。

1.5.1.2 Marker溶液制備：直接從冰箱中取出，待其融化后即可使用。

1.5.2樣品處理

1.5.2.1供試品溶液：55℃水浴3分鐘后，立即置冰浴備用。

1.5.2.2 Marker溶液：100℃水浴3分鐘后，立即置冰浴備用。

1.5.3上樣

1.5.3.1上樣步驟

◆取經(jīng)過處理的供試品溶液和Marker溶液，8000rmp/min離心1min后置冰上，待上樣。

◆用微量注射器吸取樣品溶液，將微量注射器針頭插進(jìn)上樣孔，盡量接近上樣孔底端，緩緩?fù)迫霕悠?，使樣品沉降在上樣孔底端?/p>

◆注射器不可插入過深，以防刺破膠體，也不可過淺，在樣下沉?xí)r會(huì)發(fā)生擴(kuò)散；為避免邊緣效應(yīng)，最好選用中部的孔上樣。

1.5.3.2上樣量

◆供試品溶液：20μl(即上樣量10μg)

◆Marker溶液：根據(jù)mark說明書規(guī)定，確認(rèn)上樣量。

1.5.3.3上樣注意事項(xiàng)：Marker與樣品不宜上樣在相鄰泳道上(因?yàn)檫€原態(tài)樣品與非還原態(tài)樣品上樣在相鄰的泳道上會(huì)產(chǎn)生交互作用，從而影響電泳 結(jié)果)。

1.5.4電泳

1.5.4.1將電泳槽的蓋子蓋上，注意正、負(fù)極連接正確(紅接紅，黑接黑)，打開電泳儀，調(diào)節(jié)電壓到58v，按run鍵開始電泳。

1.5.4.2當(dāng)溴酚藍(lán)條帶跑到濃縮膠和分離膠接壤處，調(diào)整電壓到108v，當(dāng)溴酚藍(lán)條帶跑到凝膠下邊緣時(shí)，電泳結(jié)束。

1.5.5卸膠

1.5.5.1關(guān)閉電泳儀電源，取出電極室，倒掉室內(nèi)的電泳緩沖液。

1.5.5.2打開電極室取出電極和膠板。

1.5.5.3取出膠板，用撬膠板從兩塊玻璃板間的狹縫輕輕撬開兩塊玻璃板，并取出電泳后的凝膠。

1.5.6染色

1.5.6.1將凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R250染液中，在搖床上搖動(dòng)染色(染色用的容器應(yīng)能避光)過夜，染液的多少以搖動(dòng)時(shí)液面仍沒過凝膠為宜，期間要輕輕搖動(dòng)，同時(shí)避免染液溢出。

1.5.6.2當(dāng)Marker的各分子量條帶能清晰可見時(shí)，即可染色結(jié)束。

1.5.7脫色

1.5.7.150ml脫色液40min/次(一塊膠)，共計(jì)更換3次脫色液，共需120min。

1.5.7.2若膠增加，應(yīng)分別獨(dú)立脫色，不能混放于一個(gè)容器內(nèi)進(jìn)行，會(huì)影響脫色的均一性。

1.5.7.3當(dāng)Marker條帶清洗可見，凝膠底色幾乎無色時(shí)，脫色結(jié)束。

1.5.8清洗：脫色好的凝膠用milliQ注射水清洗干凈后，浸泡于milliQ水中。

1.5.10圖像采集

1.5.10.1將經(jīng)脫色清洗后的凝膠置于成像儀中成像，獲得凝膠圖像。

1.5.10.2拍照結(jié)束后，取出膠用塑封膜封存。

1.6凝膠電泳圖譜分析

采用QuantityOne分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，得出要報(bào)告的參數(shù)(分子量KD(Mol.Wt)、掃描豐度Int×mm(Trace Qty)、百分比％(Relative Qty)等。

1.7檢驗(yàn)結(jié)果分析及報(bào)告

重組人尿激酶原蛋白分子量為40.0～60.0KD。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1中所述的非還原樣品緩沖液、電泳緩沖液、15％分離膠溶液5、％濃縮膠溶液替換如下：

非還原樣品緩沖液是指稱取三羥基氨基甲烷0.2g、十二烷基硫酸鈉0.5g、溴酚藍(lán)0.001g，量取丙三醇2ml、鹽酸0.05ml，加MilliQ注射用水溶解并定容即可。

電泳緩沖液：稱取三羥基氨基甲烷10g、甘氨酸65g，十二烷基硫酸鈉4g、加MilliQ注射用水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5-9.0后，繼續(xù)用milliQ水定容，即得。

15％分離膠溶液包括MilliQ注射用水1ml、30％凝膠貯備液1.5ml、Tris-HCl緩沖液(PH8.8、1.5M)1ml、10％SDS0.02ml、10％AP 0.01ml、TEMED0.001ml；

所述5％濃縮膠溶液包括MilliQ注射用水1ml、30％凝膠貯備液0.2ml、Tris-HCl緩沖液(PH6.8、1.0M)0.1ml、10％SDS0.01ml、10％AP0.01ml、TEMED0.001ml。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1中所述的非還原樣品緩沖液、電泳緩沖液、15％分離膠溶液5、％濃縮膠溶液替換如下：

非還原樣品緩沖液是指稱取三羥基氨基甲烷0.5g、十二烷基硫酸鈉1g、溴酚藍(lán)0.003g，量取丙三醇6ml、鹽酸1ml，加MilliQ注射用水溶解并定容即可。

電泳緩沖液：稱取三羥基氨基甲烷20g、甘氨酸85g，十二烷基硫酸鈉8g、加MilliQ注射用水溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5-9.0后，繼續(xù)用milliQ水定容，即得。

所述的15％分離膠溶液包括MilliQ注射用水2.5ml、30％凝膠貯備液3.5ml、Tris-HCl緩沖液(PH8.8、1.5M)2.5ml、10％SDS0.02-0.1份、10％AP 0.01-0.05份、TEMED0.005ml；所述5％濃縮膠溶液包括MilliQ注射用水2ml、30％凝膠貯備液0.5ml、Tris-HCl緩沖液(PH6.8、1.0M)0.5ml、10％SDS0.04ml、10％AP0.04ml、TEMED0.005ml。