本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種沙門氏菌近紅外法熒光檢測(cè)試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

沙門氏菌(Salmonella)為沙門氏菌屬腸桿菌科，是一類條件性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性腸桿菌。菌體大小為(0.6～0.9)×(1～3)μm，無芽胞，一般無莢膜，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌外，大多有周身鞭毛。沙門氏菌是人畜共患病的病原體，不僅能導(dǎo)致雞白痢、仔豬副傷寒、流產(chǎn)等動(dòng)物疾病，還能使人類發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎和食物中毒，是細(xì)菌性食物中毒食物重要致病菌。

沙門氏菌病被認(rèn)為是目前世界范圍內(nèi)最重要的食源性致病菌之一，嚴(yán)重威脅著人畜健康，已經(jīng)成為公共衛(wèi)生所關(guān)注的問題。在人和畜禽體內(nèi)，腸炎沙門氏菌的分離率較高，該菌主要引起畜禽食物胃腸炎以及人類腸炎和食物中毒^[2]。食物傳播是人類感染沙門氏菌的主要途徑，肉類(尤其是禽肉)、蛋類及蛋制品、未經(jīng)巴氏消毒的牛奶及奶制品、海產(chǎn)品等很多食品都與沙門氏菌病有關(guān)。人類沙門氏菌病的特征是惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛或痙攣、發(fā)燒及頭痛。潛伏期從8h-72h不等?；颊咄ǔＴ谶M(jìn)食受污染的食物12h-36h后發(fā)病，癥狀可能長(zhǎng)達(dá)一個(gè)星期。

因此，及時(shí)檢測(cè)沙門氏菌抗原，為臨床診斷提供可靠地診斷依據(jù)，采取正確有效的治療措施是非常重要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種沙門氏菌近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒及其用途，用于建立高效可行的沙門氏菌近紅外熒光檢測(cè)技術(shù)，解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒結(jié)合近紅外熒光檢測(cè)技術(shù)，可快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)出人全血/血清/血漿中沙門氏菌。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面提供一種沙門氏菌近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒，包括位于背板上的試劑條，試劑條從加樣端開始依次為樣品墊、標(biāo)記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、包被有抗沙 門氏菌單克隆抗體的硝酸纖維素膜和吸水紙。

優(yōu)選的，所述免疫熒光探針為抗沙門氏菌單克隆抗體包被的近紅外熒光乳膠微球顆粒。

優(yōu)選的，硝酸纖維素膜上包被的抗沙門氏菌單克隆抗體和所述近紅外熒光乳膠微球顆粒上包被的抗沙門氏菌單克隆抗體可以為相同的抗沙門氏菌單克隆抗體，也可以為不同的抗沙門氏菌單克隆抗體。

更優(yōu)選的，所述硝酸纖維素膜上包被的抗沙門氏菌單克隆抗體為Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]，所述近紅外熒光乳膠微球顆粒上包被的抗沙門氏菌單克隆抗體為Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]，或所述硝酸纖維素膜上包被的抗沙門氏菌單克隆抗體為Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]，所述近紅外熒光乳膠微球顆粒上包被的抗沙門氏菌單克隆抗體為Anti-Salmonella typhi抗體[AC04]。

更優(yōu)選的，所述熒光乳膠微球顆粒的直徑為140-160nm。

近紅外光(NIR)，是介于可見光(VIS)和中紅外光(MIR)之間的電磁波，ASTM定義NIR為波長(zhǎng)在780nm-2526nm范圍內(nèi)的電磁波。在近紅外光區(qū)，生物體自吸收或熒光強(qiáng)度很小，可避免背景干擾。同時(shí)由于散射光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方呈反比，近紅外區(qū)的散射干擾大為減少。

本發(fā)明的第二方面提供所述沙門氏菌近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

1)用緩沖液將熒光乳膠微粒離心清洗并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒分散液中加入抗沙門氏菌單克隆抗體；加入EDCA使抗體與顆粒偶聯(lián)；再加入封閉液封閉乳膠顆粒上多余的基團(tuán)，制備獲得探針溶液；

2)將含有抗沙門氏菌單克隆抗體的緩沖溶液噴加到硝酸纖維素膜上，烘干備用；

3)將步驟1)制備獲得的探針溶液浸潤(rùn)玻璃纖維薄膜，干燥備用；

4)將步驟2)所得的硝酸纖維素膜、步驟3)所得的標(biāo)記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙及背板組裝制備成沙門氏菌近紅外熒光檢測(cè)試劑盒。

優(yōu)選的，所述步驟1)中，再加入封閉液封閉乳膠顆粒上多余的基團(tuán)，并加入冠醚，制備獲得探針溶液，所述冠醚選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一種或多種的組合。

更優(yōu)選的，步驟1)制備獲得的探針溶液中冠醚的濃度為0.1-20mg/ml，更優(yōu)選為4-8mg/ml。

優(yōu)選的，所述步驟1)中，緩沖液為磷酸鹽(PBS)緩沖液。

更優(yōu)選的，所述PBS緩沖液為0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的PBS緩沖液。

優(yōu)選的，所述步驟1)中，熒光乳膠微粒的直徑為140-160nm。

優(yōu)選的，所述步驟1)中，乳膠顆粒、抗沙門氏菌單克隆抗體、EDCA的重量比為9-11：0.9-1.1：0.9-1.1。

在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，乳膠顆粒、抗沙門氏菌單克隆抗體、EDCA的投料量分別為1mg、100ug、100ug。

優(yōu)選的，所述封閉液為乙醇胺，加入量為適量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整乙醇胺的用量。

優(yōu)選的，所述步驟2)中，所述緩沖溶液為PBS緩沖液。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可選取適當(dāng)濃度和pH的PBS緩沖液，更優(yōu)選為0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的PBS緩沖液。

優(yōu)選的，所述步驟2)中，含有抗沙門氏菌單克隆抗體的緩沖溶液中還含有冠醚，所述冠醚選自二環(huán)已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一種或多種的組合。

更優(yōu)選的，所述含有抗沙門氏菌單克隆抗體的緩沖溶液中冠醚的濃度為0.1-20mg/ml，更優(yōu)選為4-8mg/ml。

優(yōu)選的，所述步驟2)中，含有抗沙門氏菌單克隆抗體的緩沖溶液中抗沙門氏菌單克隆抗體的濃度為1.8-2.2mg/ml。

優(yōu)選的，所述步驟2)中，抗沙門氏菌單克隆抗體的緩沖溶液的噴加量為0.9-1.1ul/cm。

優(yōu)選的，所述步驟2)中，烘干的具體條件為36-38℃烘箱烘干。

所述噴加過程利用微量蛋白點(diǎn)膜系統(tǒng)。

優(yōu)選的，所述步驟1)中的抗沙門氏菌單克隆抗體為Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]，所述步驟2)中的抗沙門氏菌單克隆抗體為Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]，或所述步驟1)中的抗沙門氏菌單克隆抗體為Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]，所述步驟2)中的抗沙門氏菌單克隆抗體為Anti-Salmonella typhi抗體[AC04]。

優(yōu)選的，所述步驟3)中，干燥的具體條件為真空干燥機(jī)干燥。

本發(fā)明的第三方面提供了所述沙門氏菌近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒在沙門氏菌檢測(cè)領(lǐng)域的用途。

所述用途具體為使用所述沙門氏菌近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，所述樣品選自人全血、血清或血漿中的一種或多種的組合。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)試劑盒以人全血/血清/血漿為檢測(cè)樣本，結(jié)合近紅外熒光檢測(cè)技術(shù)，可快速，準(zhǔn)確的檢測(cè)出患者標(biāo)本中的沙門氏菌抗原。所述試劑盒采用免疫熒光層析法，其最小可測(cè)量可達(dá)1CFU/mL，檢測(cè)方便、成本低，靈敏度高，特異性好，比同類定量診斷試劑價(jià)格低20-30％，大大節(jié)約了社會(huì)醫(yī)療成本，檢測(cè)過程中樣品收集及處理簡(jiǎn)單，可快速準(zhǔn)確的獲得結(jié)果，非常適合突發(fā)事件現(xiàn)場(chǎng)和基層使用，并可應(yīng)用到臨床檢測(cè)中，為臨床治療提供定性依據(jù)。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本發(fā)明各實(shí)施例中試驗(yàn)樣品由浦東新區(qū)人民醫(yī)院提供。近紅外熒光檢測(cè)儀，由上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司開發(fā)提供。

實(shí)施例1

1.免疫熒光抗沙門氏菌抗體顆粒制備：

用0.01mol/L，PH7.3±0.05的磷酸鹽緩沖液將直徑為150nm的熒光乳膠微粒離心清洗2遍并將乳膠顆粒分散，在清洗好的乳膠顆粒中加入Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]；加入EDCA使抗體與顆粒偶聯(lián)；加入封閉液封閉乳膠顆粒上多余的基團(tuán)，再加入二環(huán)已基-18-冠-6。按每毫克微球乳膠100微克的待標(biāo)記抗體，100微克的EDCA用量標(biāo)記。每毫克的微球乳膠最后加相當(dāng)于20微克的乙醇胺當(dāng)量的封閉液進(jìn)行封閉，冠醚的終濃度為6mg/ml。

2.試劑盒的制備：

用0.01M pH7.2的PBS緩沖液稀釋Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]至濃度2.0mg/ml，并加入冠醚，冠醚的終濃度為6mg/ml，再利用微量蛋白點(diǎn)膜系統(tǒng)將溶液噴加到適當(dāng)孔徑的硝酸纖維素膜上，按1ul/cm的量進(jìn)行噴膜，37℃烘箱烘干備用。

用制備好的探針(步驟1制得的標(biāo)記有Anti-Salmonella typhimurium 0-4抗體[1E6]]的近紅外熒光乳膠微球)溶液浸潤(rùn)玻璃纖維薄膜，真空干燥機(jī)中干燥備用。

將包被抗沙門氏菌抗體的硝酸纖維素膜、標(biāo)記有免疫熒光探針的玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙及背板組裝制備成沙門氏菌近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒。

實(shí)施例2

試劑盒檢測(cè)：

以沙門氏菌和PBS緩沖液分別配置濃度為1CFU/ml、2CFU/ml、4CFU/ml、6CFU/ml、10CFU/ml、20CFU/ml、50CFU/ml、100CFU/ml、200CFU/ml、300CFU/ml、400CFU/ml、500CFU/ml、1000CFU/ml的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品，以0CFU/ml作為空白對(duì)照，空白對(duì)照及每個(gè) 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品均重復(fù)測(cè)定6次。標(biāo)準(zhǔn)品及試劑盒均平衡至室溫后再開始檢測(cè)，用滴管在每個(gè)試劑盒的加樣孔內(nèi)滴加3滴樣本(約120-150ul)。15分鐘時(shí)，用近紅外熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)，并用熒光儀器進(jìn)行判斷，分析儀的對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)范圍是AD值0-10000。以沙門氏菌濃度為橫坐標(biāo)，近紅外熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)(平均值)為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的升高，測(cè)得的熒光信號(hào)值也隨之升高。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可知，本試劑盒對(duì)1CFU/mL的樣品可以部分檢出，對(duì)2.0CFU/mL的樣品全部檢出，其最低檢出限≤2.0CFU/mL，并在2-10002.0CFU/mL的范圍具有良好的線性。

各濃度的批內(nèi)最大CVs為4.1％，平均CVs為3.55％(每個(gè)濃度的樣品同批進(jìn)行測(cè)試)，各濃度的批間最大CVs為5.6％，平均CVs為4.5％(每個(gè)濃度的樣品分5批進(jìn)行測(cè)試)表明本發(fā)明所提供的試劑盒具有良好的重復(fù)性。

選擇未檢測(cè)出沙門氏菌進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加入沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品，將沙門氏菌的濃度分別調(diào)整至10CFU/ml、20CFU/ml、50CFU/ml、100CFU/ml、200CFU/ml，空白對(duì)照及每個(gè)濃度的樣品均重復(fù)測(cè)定6次。各濃度的批內(nèi)最大CVs為4.1％，平均CVs為3.5％，各濃度的加標(biāo)回收率為97.6％-100.2％，表明本發(fā)明所提供的試劑盒具有良好的準(zhǔn)確度。

將本發(fā)明所提供的沙門氏菌近紅外熒光法檢測(cè)試劑盒密封保存，并存放于4℃及室溫(25℃左右)下，觀察不同存放溫度對(duì)試劑盒穩(wěn)定性的影響。保存于4℃的試劑盒每周取出4盒，分別檢測(cè)1CFU/ml、2CFU/ml、4CFU/ml、6CFU/ml、10CFU/ml、20CFU/ml、50CFU/ml、100CFU/ml的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品；保存于室溫(25℃)的試劑盒每3天取出4盒，分別檢測(cè)1CFU/ml、2CFU/ml、4CFU/ml、6CFU/ml、10CFU/ml、20CFU/ml、50CFU/ml、100CFU/ml的沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)品。經(jīng)驗(yàn)證，試紙盒在4℃下可保存24個(gè)月，且最低檢出限和重復(fù)性沒有明顯變化，在室溫下可保存18個(gè)月，且最低檢出限和重復(fù)性沒有明顯變化；在可保存的期限內(nèi)，試劑盒均可達(dá)到2.0CFU/ml的檢測(cè)靈敏度。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。