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惡性瘧原蟲膠體金法檢測試劑盒的制作方法

文檔序號:12358750閱讀:277來源:國知局

本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域,特別是涉及一種惡性瘧原蟲膠體金檢測試劑盒及其制備方法和用途。



背景技術(shù):

瘧疾是經(jīng)按蚊叮咬或輸入帶瘧原蟲者的血液而感染瘧原蟲所引起的蟲媒傳染病。寄生于人體的瘧原蟲共有四種,即間日瘧原蟲,三日瘧原蟲,惡性瘧原蟲和卵形瘧原蟲。在我國主要是間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲;其他二種少見,近年偶見國外輸入的一些病例。不同的瘧原蟲分別引起間日瘧、三日瘧、惡性瘧及卵圓瘧。

瘧疾為世界五大寄生蟲病之一,有很高的發(fā)病率和死亡率,普遍存在于熱帶及亞熱帶地區(qū),位于赤道周圍的寬大帶狀區(qū)域。主要流行地區(qū)是非洲中部、南亞、東南亞及南美北部的熱帶地區(qū),這其中又以非洲的疫情最甚。就中國而言,瘧疾主要的流行地帶為華中華南的叢林多山地區(qū),但疫情遠(yuǎn)較非洲為輕。瘧疾是以周期性冷熱發(fā)作為最主要特征,脾腫大、貧血以及腦、肝、腎、心、腸、胃等受損引起的各種綜合征?;颊呙磕暝?億~5億之間,因患瘧疾而死亡的人數(shù)在1百萬~3百萬之間,其中大部分為兒童。

及早、快速有效地檢測瘧原蟲是有效防治瘧疾的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的檢測方法是通過血涂片顯微鏡檢查來判斷,這種方法簡便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確率高,缺點(diǎn)是判斷結(jié)果受檢驗(yàn)人員鏡檢水平和視力疲勞程度等因素的影響,易導(dǎo)致誤診和漏檢且檢查效率不高,不適合大規(guī)?,F(xiàn)場調(diào)查和短時(shí)間大批量處理樣本。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn),本發(fā)明的目的在于提供一種惡性瘧原蟲膠體金檢測試劑盒及其制備方法和用途,用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:

本發(fā)明的第一方面,提供一種惡性瘧原蟲膠體金檢測試劑盒,包括試紙卡,所述試紙卡包括底板、及位于底板表面的從加樣端開始依次排列的樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸 水墊,所述金標(biāo)墊上包含抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體,所述硝酸纖維素膜上包被有檢測線和質(zhì)控線,所述金標(biāo)墊上的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體采用膠體金標(biāo)記。

優(yōu)選的,所述金標(biāo)墊上的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體采用150nm膠體金標(biāo)記,具有信號受背景干擾小,檢測靈敏度高,結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

優(yōu)選的,所述底板為PVC底板。

優(yōu)選的,所述硝酸纖維素膜上,檢測線位于離加樣端較近一側(cè),質(zhì)控線位于離加樣端較遠(yuǎn)一側(cè)。

優(yōu)選的,所述檢測線上包被有抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體。所述金標(biāo)墊上的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體與檢測線上的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體可以是相同的抗體,也可以是不同的抗體。

優(yōu)選的,質(zhì)控線上包被羊抗鼠抗體。

優(yōu)選的,所述樣品墊采用緩沖液處理,所述緩沖液選自PBS緩沖液、Tris-HCl緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液和檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合,緩沖液的濃度為50-100mM。

優(yōu)選的,本發(fā)明所述的金標(biāo)墊還經(jīng)過預(yù)處理,預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液選自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合,緩沖液的濃度為10-40mM。

優(yōu)選的,所述緩沖液還包括反應(yīng)增強(qiáng)劑,所述反應(yīng)增強(qiáng)劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種,所述反應(yīng)增強(qiáng)劑的濃度為10~50g/L。

優(yōu)選的,所述緩沖溶液還包括表面活性劑,所述表面活性劑選自S-19 TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13 TRITON X-45、S-14 TRITON X-100、S-15 TRITON X305中的任意一種或多種的組合,所述表面活性劑的濃度為20~40g/L。

優(yōu)選的,為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和特異性,本發(fā)明所述的金標(biāo)墊在預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液包括下列組分:果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鈉和甘氨酸,且果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為4.5-6.5g/L,緩沖液的pH值為7.3-7.5。

優(yōu)選的,各組分在緩沖液中的濃度為:

果糖 1.0-2.0g/L;氫氧化鋁 0.25-0.75g/L;葡萄糖 1.0-1.5g/L;氯化鈉 0.25-0.5g/L;甘氨酸 2.0-2.25g/L。

所述預(yù)處理緩沖液的溶劑為水。

所述預(yù)處理的具體步驟為:將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸泡1.5~2h,取出放于36~38℃烘干。

所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。

優(yōu)選的,所述試劑盒還包括卡殼,所述卡殼包括背卡和上蓋,所述背卡設(shè)有試紙卡卡槽,所述試紙卡嵌于所述試紙卡卡槽內(nèi),所述上蓋設(shè)有測試窗和加樣孔,所述測試窗的位置與所述檢測線和質(zhì)控線的位置相配合,所述加樣孔的位置與所述樣品墊的位置相配合。

更優(yōu)選的,所述卡殼為塑料卡殼。

優(yōu)選的,所述檢測試劑盒用于檢測惡性瘧原蟲。

本發(fā)明所提供的惡性瘧原蟲膠體金檢測試劑盒,可配套免疫定量分析儀器使用。免疫分析儀器通過采集檢測線(T)和質(zhì)控線(C)條帶熒光信號,計(jì)算T/C信號值。使用前先將不同標(biāo)準(zhǔn)品滴加到試紙卡上,分析處理建立定標(biāo)曲線(T/C信號值與標(biāo)準(zhǔn)品真實(shí)值的關(guān)系),再將檢測樣品時(shí)獲得的T/C值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較,即可獲得檢測樣品中的惡性瘧原蟲抗原含量。

本發(fā)明第二方面提供所述惡性瘧原蟲膠體金檢測試劑盒的制備方法,包括如下步驟:

1)用膠體金標(biāo)記的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體溶液噴涂金標(biāo)墊,制得包含抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體的金標(biāo)墊;

2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴涂抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體及羊抗鼠抗體,制得包被后的硝酸纖維素膜;

3)將樣品墊、步驟1)制備金標(biāo)墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在底板上,切裁制得檢測試紙卡;最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。

優(yōu)選的,本發(fā)明所述的金標(biāo)墊還經(jīng)過預(yù)處理,預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液選自甘氨酸緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸鹽緩沖液的一種或多種的組合,緩沖液的濃度為10-40mM。

優(yōu)選的,所述緩沖液還包括反應(yīng)增強(qiáng)劑,所述反應(yīng)增強(qiáng)劑選自PEG4000、PEG6000、PEG8000和PEG20000中的任意一種,所述反應(yīng)增強(qiáng)劑的濃度為10~50g/L。

優(yōu)選的,所述緩沖溶液還包括表面活性劑,所述表面活性劑選自S-19 TWEEN 20、S-20TWEEN 80、S-13 TRITON X-45、S-14 TRITON X-100、S-15 TRITON X305中的任意一種或多種的組合,所述表面活性劑的濃度為20~40g/L。

優(yōu)選的,為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和特異性,本發(fā)明所述的金標(biāo)墊在預(yù)處理時(shí)所使用的預(yù)處理緩沖液包括下列組分:果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鈉和甘氨酸,且果糖、氫氧化鋁、葡萄糖、氯化鉀和甘氨酸的總濃度為4.5-6.5g/L,緩沖液的pH值為7.3-7.5。

優(yōu)選的,各組分在緩沖液中的濃度為:

果糖 1.0-2.0g/L;氫氧化鋁 0.25-0.75g/L;葡萄糖 1.0-1.5g/L;氯化鈉 0.25-0.5g/L;甘氨酸 2.0-2.25g/L。

所述預(yù)處理緩沖液的溶劑為水。

所述預(yù)處理的具體步驟為:將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸泡1.5~2h,取出放于36~38℃烘干。

所述預(yù)處理緩沖液可使用本領(lǐng)域各種常用的pH調(diào)節(jié)劑進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。

本發(fā)明第三方面提供所述惡性瘧原蟲膠體金檢測試劑盒在惡性瘧原蟲檢測領(lǐng)域的用途。

本發(fā)明的有益效果為:

本發(fā)明所提供的惡性瘧原蟲膠體金檢測試劑盒首次將惡性瘧原蟲通過膠體金免疫層析技術(shù)進(jìn)行檢測,兼具高靈敏性和高特異性,能夠快速檢測惡性瘧原蟲。此外,所述檢測試劑盒具有操作快速簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式,本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用,本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用,在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前,應(yīng)理解,本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案;還應(yīng)當(dāng)理解,本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案,而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍;在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中,除非文中另外明確指出,單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí),應(yīng)理解,除非本發(fā)明另有說明,每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義,本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外,根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載,還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明,本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明,具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。

實(shí)施例1 本發(fā)明試紙卡的制備

1)使用預(yù)處理緩沖液對金標(biāo)墊進(jìn)行預(yù)處理,預(yù)處理緩沖液為:果糖1.5g/L,氫氧化鋁0.5g/L,葡萄糖1.25g/L,氯化鈉0.3g/L,甘氨酸2.0g/L的水溶液,pH=7.4,預(yù)處理的具體步驟為:將金標(biāo)墊在預(yù)處理液中浸泡2h,取出放于37℃烘干;然后用膠體金標(biāo)記的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的金標(biāo)墊,制得包被抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體的金標(biāo)墊,溶液中膠體金與抗體的質(zhì)量比為5:1,溶液的濃度為10mg/ml,噴涂量為4ul/cm;

2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴涂1mg/ml的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體溶液和羊抗鼠抗體溶液,噴涂量為1ul/cm,制得包被后的硝酸纖維素膜;

3)將樣品墊、步驟1)制備金標(biāo)墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在PVC底板上,切裁制得寬3-5mm的檢測試紙卡;最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。

實(shí)施例2 對比試劑盒的制備

對比例試紙卡的制備:采用25mM甘氨酸緩沖液預(yù)處理金標(biāo)墊,其他試劑及實(shí)驗(yàn)方法均同實(shí)施例1。

1)采用25mM甘氨酸緩沖液預(yù)處理金標(biāo)墊,然后用膠體金標(biāo)記的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體溶液噴涂經(jīng)預(yù)處理的金標(biāo)墊,制得包被抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體的金標(biāo)墊,溶液中膠體金與抗體的質(zhì)量比為5:1,溶液的濃度為10mg/ml,噴涂量為4ul/cm;

2)在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上分別噴涂1mg/ml的抗惡性瘧原蟲組氨酸富集蛋白Ⅱ單克隆抗體溶液和羊抗鼠抗體溶液,噴涂量為1ul/cm,制得包被后的硝酸纖維素膜;

3)將樣品墊、步驟1)制備金標(biāo)墊、步驟2)制備的硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘貼在PVC底板上,切裁制得寬3-5mm的檢測試紙卡;最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。

實(shí)施例3 檢測試劑盒的特異性實(shí)驗(yàn)

檢測方法:

1.取實(shí)施例1制備的本發(fā)明試劑盒和實(shí)施例2的對比試劑盒,將試劑盒放置在水平臺面上。

2.待測樣品的制備:按表1的四類實(shí)驗(yàn)對象,取全血作為待測樣品。

3.每類實(shí)驗(yàn)對象為100人,檢測結(jié)果如表1:

表1檢測試劑盒特異性試驗(yàn)結(jié)果

由上表可知,本發(fā)明的檢測試劑盒對乙型肝炎及梅毒均無交叉反應(yīng),特異性良好。

綜上所述,本發(fā)明所提供的檢測試劑盒具有良好的抗干擾性和特異性,有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效,而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下,對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此,舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變,仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

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