Cry報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體提供了一種CRY報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。其是將Rabin8蛋白中與Rab8特異性結(jié)合的氨基酸序列RBD（如SEQ?ID?No.1所示）依次連入真核表達(dá)載體pECFP和pEYFP，構(gòu)成CFP-RBD-YFP序列，得到報(bào)告基因載體CRY。本發(fā)明利用報(bào)告基因載體CRY的報(bào)告基因所編碼的蛋白定位及識(shí)別Rab8GDP，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)的Rab8GDP進(jìn)行半定量分析和定位分析，從而特異性追蹤細(xì)胞內(nèi)Rab8GDP的變化。
【專利說明】CRY報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及CRY報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸存在自由擴(kuò)散與主動(dòng)運(yùn)輸兩種方式，后者顯然對(duì)生物分子在特定位置發(fā)揮特定的作用具有決定性意義。在細(xì)胞向外分泌物質(zhì)、細(xì)胞膜受體由高爾基體向細(xì)胞膜表面靶向運(yùn)輸及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間進(jìn)行物質(zhì)交換的過程中，膜泡運(yùn)輸具有重要地位。Rab蛋白是一類包含數(shù)十種成員的GTP酶家族，其主要功能在于接力式地引導(dǎo)處于運(yùn)輸不同階段中的膜泡，從而實(shí)現(xiàn)膜泡的定向運(yùn)輸。RabS蛋白主要調(diào)控膜泡向靶膜的錨定與融合過程，在膜泡由高爾基體向中心體的定向運(yùn)輸中具有重要作用。RabS蛋白的活性由其所結(jié)合的GTP/GDP狀態(tài)決定，因此參與到調(diào)控GTP/GDP分子在Rab8結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行交換的一系列蛋白均參與Rab8活性的調(diào)控。這些蛋白中，TBC1D1/4/30特異性水解GTP，而Rabin8和⑶12則分別催化GTP的裝載及抑制⑶P的解離。 [0003]現(xiàn)有研究表明，RabS蛋白對(duì)于纖毛的正常組裝具有重要調(diào)控作用:其不能水解GTP的突變體Rab8Q67L促進(jìn)纖毛組裝，而其處于⑶P結(jié)合狀態(tài)的模擬突變體Rab8T22N抑制纖毛組裝。纖毛這一細(xì)胞器在個(gè)體發(fā)育過程中左右對(duì)稱的形成、細(xì)胞對(duì)外界信號(hào)的感知以及細(xì)胞周期調(diào)控方面均具有重要作用。因此，對(duì)RabS功能的研究，將有助于闡明纖毛組裝與去組裝的分子機(jī)制及膜泡介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控，從而為纖毛病的治療提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供CRY報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種CRY報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟:
[0006](I)將Rabin8蛋白中與Rab8特異性結(jié)合的氨基酸序列RBD (101~300殘基，Rab8Binding Domain, RBD)連入真核表達(dá)載體 pECFP,構(gòu)成 CFP-RBD 序列(CR)；
[0007](2)將上述CFP-RBD序列進(jìn)行克隆，再連入真核表達(dá)載體pEYFP，構(gòu)成CFP-RBD-YFP序列(CRY)，得到報(bào)告基因載體CRY ；
[0008]所述Rabin8蛋白中與Rab8特異性結(jié)合的氨基酸序列RBD如SEQ ID N0.1所示。
[0009]將上述報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染目標(biāo)細(xì)胞(組裝或不組裝纖毛的細(xì)胞均可)，通過載體上的抗性基因，可以進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)系的篩選。
[0010]可選的，上述報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法可先構(gòu)建RY再構(gòu)建CRY,或構(gòu)建YFP-RBD-CFP (YRC)o
[0011]進(jìn)一步地，所述真核表達(dá)載體pECFP為pECFP-Cl/2/3或pECFP-Nl/2/3。
[0012]進(jìn)一步地，所述真核表達(dá)載體pEYFP為pEYFP-Cl/2/3或pEYFP-Nl/2/3。[0013]本發(fā)明還提供了按照上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的報(bào)告基因載體CRY。
[0014]進(jìn)一步地，所述報(bào)告基因載體CRY的報(bào)告基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0015]本發(fā)明還提供了前述報(bào)告基因載體在檢測細(xì)胞內(nèi)RabSeiip中的應(yīng)用，其利用報(bào)告基因載體CRY的報(bào)告基因所編碼的蛋白定位及識(shí)別Rab8eDP，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)的Rab8(:DP進(jìn)行半定量分析和定位分析，從而特異性追蹤細(xì)胞內(nèi)RabSaip的變化。
[0016]本發(fā)明的有益效果在于:
[0017]本發(fā)明提供一種便利的、能夠檢測細(xì)胞內(nèi)Rab8eDP動(dòng)態(tài)變化的方法。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的CRY報(bào)告基因所編碼的蛋白在定位及識(shí)別RabSaip方面與內(nèi)源RabinS蛋白無異，且能夠?qū)?xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)的RabSeiip進(jìn)行半定量分析和定位分析，從而可用于特異性追蹤細(xì)胞內(nèi)Rab8eDP的變化及功能研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為CRY報(bào)告基因的構(gòu)建流程圖。
[0019]圖2為CRY報(bào)告基因的工作原理，及其所編碼的蛋白與內(nèi)源Rabin8蛋白功能和定位的比較。
[0020]圖3為CRY報(bào)告基因所編碼蛋白對(duì)Rab8GDP含量的應(yīng)達(dá)。
[0021]圖4為CRY所示 干涉某基因?qū)?xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)Rab8?P含量的
[0022]影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0024]實(shí)施例1重組真核表達(dá)載體CRY的構(gòu)建
[0025]下述實(shí)驗(yàn)過程中所用DNA引物為華大基因(北京)合成。
[0026]CRY報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建流程見圖1。根據(jù)人Rabin8及ECFP蛋白編碼框的cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物如下表(劃線部分為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)):
[0027]
【權(quán)利要求】
1.CRY報(bào)告基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以下步驟: (1)將Rabin8蛋白中與Rab8特異性結(jié)合的氨基酸序列RBD連入真核表達(dá)載體pECFP，構(gòu)成CFP-RBD序列； (2)將上述CFP-RBD序列進(jìn)行克隆，再連入真核表達(dá)載體pEYFP，構(gòu)成CFP-RBD-YFP序列，得到報(bào)告基因載體CRY; 所述Rabin8蛋白中與Rab8特異性結(jié)合的氨基酸序列RBD如SEQ ID N0.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法可先將Rabin8蛋白中與Rab8特異性結(jié)合的氨基酸序列RBD連入真核表達(dá)載體pEYFP，構(gòu)成RBD-YFP序列；再將上述RBD-YFP序列進(jìn)行克隆，再連入真核表達(dá)載體pECFP，構(gòu)成CFP-RBD-YFP序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2 所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體pECFP為pECFP-Cl/2/3 或 pECFP-Nl/2/3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體pEYFP為pEYFP-Cl/2/3 或 pEYFP-Nl/2/3。
5.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的報(bào)告基因載體CRY。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的報(bào)告基因載體CRY,其特征在于,報(bào)告基因載體CRY的報(bào)告基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
7.權(quán)利要求5或6所述的報(bào)告基因載體在檢測細(xì)胞內(nèi)RabSeiip中的應(yīng)用，其特征在于，利用報(bào)告基因載體CRY的報(bào)告基因所編碼的蛋白定位及識(shí)別Rab8eDP，并對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)的RabSaip進(jìn)行半定量分析和定位分析，從而特異性追蹤細(xì)胞內(nèi)RabSaip的變化。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103937825SQ201410126537
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】張傳茂, 張博言 申請人:北京大學(xué)