一種消癥丸制劑的指紋圖譜檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，該方法包括供試品溶液的制備、對(duì)照品溶液的制備、各原料藥與成品之間的相關(guān)性的測(cè)定；用高效液相色譜儀測(cè)定，以參照峰保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算供試品相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，即得消癥丸制劑HPLC指紋圖譜。由此方法得到的消癥丸制劑HPLC指紋圖譜在254nm下歸屬于柴胡、香附、大黃、川芎、莪術(shù)、當(dāng)歸、白芍、浙貝母、王不留行和青皮的特征峰分別有4個(gè)、4個(gè)、17個(gè)、7個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、11個(gè)、4個(gè)、6個(gè)、11個(gè)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，本發(fā)明提供的指紋圖譜檢測(cè)方法，靈敏度和精密度高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，相似度高，可以客觀、全面、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)該消癥丸制劑的質(zhì)量，對(duì)保證臨床藥效具有重要意義。
【專利說(shuō)明】 一種消癥丸制劑的指紋圖譜檢測(cè)方法
[0001]優(yōu)先權(quán)
[0002]對(duì)于本申請(qǐng)， 申請(qǐng)人:要求在中國(guó)申請(qǐng)的專利，申請(qǐng)日為2013年7月30日，申請(qǐng)?zhí)枮?01310325229.8的優(yōu)先權(quán)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及一種中藥制劑的質(zhì)量檢測(cè)方法，具體涉及一種消癥丸制劑的指紋圖譜檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0004]消癥丸是由河南中醫(yī)學(xué)院老中醫(yī)趙俊學(xué)老師在明代張介賓《景岳全書》中柴胡疏肝散的基礎(chǔ)上，根據(jù)乳腺增生病的發(fā)病機(jī)理加減而成，在臨床中應(yīng)用幾十年，對(duì)乳腺增生癥的療效確切。該方由柴胡、香附、大黃、青皮、川芎、當(dāng)歸、白芍、莪術(shù)、土鱉蟲、浙貝母、王不留行十一味藥材組成，具有舒肝行氣、活血化痰、軟堅(jiān)散結(jié)的功效。主治氣滯血瘀痰凝所致的乳腺增生病。癥見乳房腫塊，乳房脹痛或刺痛，可伴胸脅疼痛，善郁易怒，胸悶，脘痞納呆，月經(jīng)量少色暗,經(jīng)行腹痛。舌暗紅或有瘀點(diǎn)、瘀斑，苔薄白或白膩。脈弦或潘。
[0005]現(xiàn)有檢測(cè)方法(專利ZL201110058699.3)對(duì)該產(chǎn)品中柴胡、香附、大黃、青皮、浙貝母、白芍6味藥材進(jìn)行薄層鑒別以及對(duì)大黃藥材中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚進(jìn)行HPLC含量測(cè)定。該方法步驟繁瑣，且消癥丸制劑由十一味藥材組成，僅僅測(cè)定其中的一味藥材含量不足以全面對(duì)該復(fù)方的制劑的質(zhì)量進(jìn)行控制?，F(xiàn)有方法沒(méi)有對(duì)其中主要多味藥材中的化學(xué)成分進(jìn)行全面、系統(tǒng)的檢測(cè)，因此不能全面監(jiān)控中間體、成品的質(zhì)量。
[0006]近年來(lái)，中藥指紋圖譜技術(shù)已日漸成熟，能夠很好的控制藥品的質(zhì)量，保證藥品的有效性和質(zhì)量可控性，已經(jīng)成為一種業(yè)內(nèi)公認(rèn)的、可靠的、高效的技術(shù)手段，是中藥質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢(shì)。
[0007]因此，為了更全面、有效的控制該消癥丸制劑的質(zhì)量，提高其質(zhì)量控制水平，讓臨床用藥安全及療效更加有所保證，很有必要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)之上研究設(shè)計(jì)出一種能客觀、準(zhǔn)確，全面檢測(cè)消癥丸制劑質(zhì)量的指紋圖譜測(cè)定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)HPLC指紋圖譜對(duì)消癥丸制劑進(jìn)行檢測(cè)的方法，本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種精密度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，能客觀、全面、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)消癥丸制劑質(zhì)量的指紋圖譜檢測(cè)方法，能更有效的保證成品的質(zhì)量，對(duì)控制消癥丸制劑的質(zhì)量具有重要作用。該方法采用HPLC梯度洗脫在一個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)首次同時(shí)檢出復(fù)方中十味藥材成分，從色譜峰的特征和相似度結(jié)果判斷消癥丸制劑的樣品合格與否,從整體上全面反映消癥丸所用藥材內(nèi)在質(zhì)量,不僅能全面反映消癥丸制劑成品的質(zhì)量，還可根據(jù)成品、半成品的指紋圖譜變化追根溯源尋找工藝操作中的問(wèn)題。本發(fā)明還提供了消癥丸制劑的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0009]技術(shù)的方案:為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的通過(guò)HPLC指紋圖譜對(duì)消癥丸制劑進(jìn)行檢測(cè)的方法包括如下步驟:
[0010](I)供試品溶液的制備:取消癥丸制劑內(nèi)容物細(xì)粉1.0g，精密稱定，置50ml錐形瓶中，精密加入濃度為90%乙醇溶液50ml，超聲處理(功率250W，頻率40kHz) 30分鐘，靜置放冷，過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇，濃縮，上AB-8大孔吸附樹脂柱，分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，按每小時(shí)3~4倍柱體積的流速洗脫,合并40%、60%、80%,95%乙醇洗脫液，減壓濃縮，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，過(guò)0.45 μ m濾膜，取續(xù)濾液，即得；
[0011](2)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚適量，加甲醇溶解，分別制成芍藥苷濃度為36μg/ml、阿魏酸濃度為56.31^/1111、橙皮苷濃度為421^/1111、大黃酸濃度為24.6 μ g/ml、大黃素濃度為29.8 μ g/ml、蘆薈大黃素濃度為51.6 μ g/ml、大黃素甲醚濃度為38.6 μ g/ml、大黃酚濃度為26 μ g/ml的對(duì)照品溶液；
[0012](3)消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的測(cè)定:分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各50 μ 1，進(jìn)樣，用高效液相色譜儀測(cè)定，以參照峰保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算供試品相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，即得消癥丸制劑HPLC指紋圖譜；
[0013]色譜條件為:色譜 柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相:Α相為乙腈，B相為0.3%磷酸水，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng):245nm~254nm ;柱溫35°C~45°C ;流速0.8ml/min ~lml/min。
[0014]色譜條件的篩選:本發(fā)明分別對(duì)色譜柱、洗脫系統(tǒng)、洗脫程序、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選。
[0015]色譜柱的篩選:分別篩選色譜柱1:XbridgeC18(4.6X250mm, 5 μ m,Waters);色譜柱 2:0DS HypersilC18 (4.6 X 250mm, 5 μ m, Thermo)；色譜柱 3:0DS-2C18(4.6X250mm, 5 μ m, Hedera) 0根據(jù)色譜峰的分離情況和總峰數(shù)，優(yōu)選色譜柱1:XbridgeC18 (4.6 X 250mm, 5 μ m, Waters)色譜柱。
[0016]洗脫系統(tǒng)的篩選:本發(fā)明分別篩選洗脫系統(tǒng):1:甲醇-水；2:乙腈-水；3:乙腈-0.1%磷酸；4:乙腈-0.2%磷酸；5:乙腈-0.3%磷酸。根據(jù)色譜峰分離效果和峰型等，優(yōu)選5:乙腈-0.3%磷酸為最終洗脫系統(tǒng)。
[0017]洗脫程序的篩選:本發(fā)明以乙腈-0.3%磷酸做流動(dòng)相，篩選了程序1-6的洗脫程序，以乙腈百分比表示，括號(hào)內(nèi)表示時(shí)間(min):
[0018]程序1:10% (O)~18.4% (9)~18.4% (23)~20.5% (26)~20.5% (33)~24.2% (39)~24.2% (46)~39.4% (55)~43% (68)~43% (77)~90% (87)
[0019]程序2:10% (O)~18.4% (23)~20.5% (26)~20.5% (33)~24.2% (39)~24.2% (43)~39.4% (52)~43% (70)~90% (80)
[0020]程序3:10% (O)~18.4% (23)~20.5% (26)~20.5% (33)~24.2% (39)~24.2% (43)~39.4% (52)~43% (90)~90% (95)
[0021]程序4:10% (O)~18.4% (23)~20.5% (26)~20.5% (33)~24.2% (39)~24.2% (43)~30% (49)~39.4% (63)~43% (73)~90% (90)[0022]程序5:10% (O)~14.4% (10)~14.4% (15)~18.4% (25)~20.5% (27)~20.5% (45)~24.2% (50)~30% (56)~39.4% (76)~43% (90)~90% (110)
[0023]程序6:10% (O)~12% (5)~12% (10)~16% (30)~19% (33)~19% (45)~24.2% (51)~24.2% (58)~30% (65)~38.5% (85)~38.5% (90)~65% (96)~68%
(101)~95% (105)~100% (110)
[0024]根據(jù)色譜圖的分離效果，優(yōu)選程序6:10% (O)~12% (5)~12% (10)~16% (30)~19% (33)~19% (45)~24.2% (51)~24.2% (58)~30% (65)~38.5% (85)~38.5%(90)~65% (96)~68% (101)~95% (105)~100% (110)為最終洗脫程序。
[0025]柱溫的篩選:本發(fā)明篩選了 35°C和40°C柱溫，根據(jù)色譜峰分離效果及分離時(shí)間，優(yōu)選40°C為最終柱溫。
[0026]檢測(cè)波長(zhǎng)的篩選:本發(fā)明篩選了 230nm、254nm、280nm、316nm和360nm的波長(zhǎng),根據(jù)色譜峰分離效果和峰數(shù)優(yōu)選254nm為最終檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0027]消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的測(cè)定:分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各
50μ 1，進(jìn)樣，用高效液相色譜儀測(cè)定，以參照峰保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算供試品相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，即得消癥丸制劑HPLC指紋圖譜；
[0028]作為優(yōu)選的方案，以上所述的消癥丸制劑的指紋圖譜檢測(cè)方法，步驟(4)所述的色譜柱為 XbridgeC18 (4.6 X 250mm, 5 μ m, Waters)色譜柱；
[0029]作為優(yōu)選的方案，以上所述的消癥丸制劑的指紋圖譜檢測(cè)方法，步驟(4)所述的洗脫系統(tǒng)為乙腈-0.3%磷酸；
[0030]作為優(yōu)選的方案，以上所述的消癥丸制劑的指紋圖譜檢測(cè)方法，步驟(4)所述的梯度洗脫程序如下表:
[0031]
【權(quán)利要求】
1.一種消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)供試品溶液的制備:取消癥丸制劑內(nèi)容物細(xì)粉1.0g，精密稱定，置50ml錐形瓶中，精密加入濃度為90%乙醇溶液50ml，超聲處理(功率250W，頻率40kHz) 30分鐘，靜置放冷，過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇，濃縮，上AB-8大孔吸附樹脂柱，分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，按每小時(shí)3~4倍柱體積的流速洗脫，合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脫液，減壓濃縮，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，過(guò)0.45 μ m濾膜，取續(xù)濾液，即得; (2)對(duì)照品溶液的制備:精密稱取芍藥苷、阿魏酸、橙皮苷、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、大黃酚適量，加甲醇使溶解，分別制成芍藥苷濃度為36μg/ml、阿魏酸濃度為56.3μ g/ml、橙皮苷濃度為42μ g/ml、大黃酸濃度為24.6 μ g/ml、大黃素濃度為29.8 μ g/ml、蘆薈大黃素濃度為51.6 μ g/ml、大黃素甲醚濃度為38.6 μ g/ml、大黃酚濃度為26μ/πι1的對(duì)照品溶液； (3)消癥丸制劑HPLC指紋圖譜的測(cè)定:分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各50μ 1，進(jìn)樣，用高效液相色譜儀測(cè)定，以參照峰保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算供試品相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，即得消癥丸制劑HPLC指紋圖譜； 色譜條件為:色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相:Α相為乙腈，B相為0.3%磷酸水，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng):245nm~254nm ;柱溫35°C~45°C ;流速0.8ml/min~lml/min。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)所述的色譜條件為:色譜柱:填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相:A相為乙腈，B相為0.3%磷酸水，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng):254nm ;柱溫40°C ;流速0.8ml/min。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于，所述的梯度洗脫條件為:___
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)檢測(cè)時(shí)間為110分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)參照峰為蘆薈大黃素峰；所述的供試品指紋圖譜采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版進(jìn)行評(píng)價(jià)，各檢測(cè)波長(zhǎng)下的相似度均大于0.9 ;在254nm下利用各對(duì)照品對(duì)主要峰進(jìn)行比較確定:4號(hào)峰為芍藥苷、5號(hào)峰為阿魏酸、10號(hào)峰為橙皮苷、23號(hào)峰為蘆薈大黃素、27號(hào)峰為大黃酸、31號(hào)峰為大黃素、32號(hào)峰為大黃酚、33號(hào)峰為大黃素甲醚。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的消癥丸制劑的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于，所述的色譜柱的規(guī)格為4.6X250mm,5ym的WatersXbridgeC18反相色譜柱。
7.消癥丸制劑的原料藥材的指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)分別取消癥丸制劑的原料藥材柴胡、香附、大黃、青皮、川芎、莪術(shù)、浙貝母、當(dāng)歸、白芍和王不留行，粉碎至細(xì)粉，過(guò)60目篩，分別取1.0g，精密稱定，置IOml量瓶中，精密加入90%乙醇50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30min，靜置放冷，過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇，濃縮，濃縮液上AB-8大孔吸附樹脂柱，分別用400ml水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，按每小時(shí)3-4倍柱體積的流速洗脫，合并40%、60%、80%、95%乙醇洗脫液，減壓濃縮，加甲醇定容至10ml，吸取溶液，過(guò)0.45 μ m濾膜，取續(xù)濾液，即得各原料藥材的供試品溶液； (2)各原藥材HPLC指紋圖譜測(cè)定:分別精密吸取步驟(1)各原料藥材的供試品溶液50μ 1，進(jìn)樣，用高效液相色譜儀測(cè)定各原料藥材的指紋圖譜； 色譜條件為:色譜柱:填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相:Α相為乙腈，B相為.0.3%磷酸水,梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng):254nm ;柱溫40°C ;流速0.8ml/min ;所述的梯度洗脫條件為:
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103983704SQ201410126546
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月30日
【發(fā)明者】狄留慶, 趙曉莉, 嚴(yán)燕青, 貢磊, 康安, 單進(jìn)軍, 李俊松, 李全 申請(qǐng)人:雷允上藥業(yè)有限公司