分子診斷檢測(cè)設(shè)備及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于分子診斷檢測(cè)的側(cè)向流動(dòng)裝置和使用方法。該方法適合檢測(cè)或監(jiān)測(cè)包括以非常低的濃度存在于生物樣品中的生物性、化學(xué)性和材料性的目標(biāo)物。本發(fā)明的方法和裝置適用于無(wú)能量源的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】分子診斷檢測(cè)設(shè)備及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、分子診斷、核酸檢測(cè)(NAT)、醫(yī)學(xué)科學(xué)和生物技術(shù)的綜合領(lǐng)域。本發(fā)明適合于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)以非常低的濃度存在于樣品中的痕量化學(xué)和/或生物目標(biāo)物，包括但不僅限于生物樣品、材料、有機(jī)或無(wú)機(jī)樣品。痕量化學(xué)和/或生物目標(biāo)物可以包括生物/化學(xué)產(chǎn)品、碎片或整個(gè)目標(biāo)物，如核酸序列、細(xì)胞、病毒、病原體、化學(xué)品，在諸如藥物基因組學(xué)、病原學(xué)體檢測(cè)和監(jiān)控、確定遺傳傾向易感性、進(jìn)行臨床試驗(yàn)的遺傳分類，、診斷學(xué)，、預(yù)測(cè)學(xué)，、傳染病診斷和監(jiān)測(cè)、生物防護(hù)、法醫(yī)分析、親子鑒定、動(dòng)物和植物育種、食品檢測(cè)、人體識(shí)別，遺傳修飾生物檢測(cè)、化學(xué)污染、食品安全、生產(chǎn)鏈的監(jiān)測(cè)和跟蹤以及生產(chǎn)的在線監(jiān)視/控制的領(lǐng)域中，關(guān)于現(xiàn)場(chǎng)/位點(diǎn)/興趣(point of care/site/interest)和實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]分子診斷已經(jīng)成為生物檢測(cè)和監(jiān)測(cè)中的常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室程序。一份來(lái)自不同生物來(lái)源的生物樣品的樣本通常含有化學(xué)物、代謝物、大分子、細(xì)胞、病毒粒子、微生物和核酸序列的混合物。典型地，進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控存在兩種常見(jiàn)的問(wèn)題:背景干擾和檢測(cè)極限(L0D)。也就是說(shuō)，與該生物樣品中其他背景成分相比，目標(biāo)生物樣品通常只以非常小的量存在。這樣的非目標(biāo)背景成分可能對(duì)下游的檢測(cè)造成干擾。當(dāng)樣品中目標(biāo)成分的拷貝不足時(shí)，LOD就成為了一個(gè)問(wèn)題。LOD問(wèn)題在化學(xué)分析中同樣存在，這通常需要高度精密的儀器進(jìn)行分析工作。例子包括用質(zhì)譜檢測(cè)在食品供應(yīng)鏈中的鄰苯二甲酸二(正丁基)酯塑化劑污染、牛奶中的三聚氰胺污染，土壤或食物中鎘及重金屬污染。背景干擾比污染物高一個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，沒(méi)有對(duì)實(shí)驗(yàn)室包括諸如氣相色譜儀或質(zhì)譜儀在內(nèi)的儀器的全面處理，現(xiàn)場(chǎng)分析通常是很困難的。
[0003]背景干擾通常通過(guò)在準(zhǔn)備階段純化樣品解決。通過(guò)一步或多步洗滌步驟捕獲目標(biāo)成分并將背景成分除去。典型的例子包括:酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和不同的層析方法。當(dāng)背景組分從已固定的目標(biāo)中移除時(shí)，側(cè)向流動(dòng)平臺(tái)也可以用來(lái)捕捉目標(biāo)。關(guān)于核酸目標(biāo)物純化程序的另一個(gè)例子是純化試劑盒，例如Qiagen QIAamp DSP DNA血液迷你試劑盒。
[0004]對(duì)于核酸的檢測(cè)極限問(wèn)題一般首先通過(guò)擴(kuò)增樣品目標(biāo)成分來(lái)解決，以允許后續(xù)的熒光發(fā)射、電的和電子的方法，例如伏安法、電流測(cè)量、電容測(cè)量或阻抗頻譜。在這些檢測(cè)或擴(kuò)增方法中，需要電力以提供光或進(jìn)行電/電子檢測(cè)。解決低豐度核酸目標(biāo)物檢測(cè)極限問(wèn)題的一個(gè)例子是，通過(guò)使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在體外擴(kuò)增核酸目標(biāo)物。與目標(biāo)序列的存在相關(guān)聯(lián)的信號(hào)可通過(guò)熒光方法來(lái)進(jìn)一步放大。每個(gè)被熒光標(biāo)簽標(biāo)記的PCR擴(kuò)增子，在使用熒光信標(biāo)或探針檢測(cè)擴(kuò)增子時(shí)，可以在單個(gè)激發(fā)/測(cè)定期間產(chǎn)生1000或10000多個(gè)質(zhì)子。另一個(gè)例子是彎曲菌屬狀生物體試驗(yàn)，其中幽門(mén)螺桿菌細(xì)胞在培養(yǎng)物增殖并由此被擴(kuò)增，其中擴(kuò)增細(xì)胞分泌的脲酶能在細(xì)胞的數(shù)量通過(guò)檢測(cè)閾值后可進(jìn)行檢測(cè)。另一實(shí)例是MRSA的篩選。這種檢測(cè)方法區(qū)分培養(yǎng)基中繁殖和擴(kuò)增的細(xì)胞的菌落。
[0005]然而，依賴于去除各種背景干擾和擴(kuò)增檢測(cè)組合的現(xiàn)有方法無(wú)法滿足對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)方法的有效、低成本、快速、簡(jiǎn)易使用的要求，這種使用的要求在資源有限環(huán)境中是兼容的。需要向設(shè)備供電或提供溫度孵育，現(xiàn)有試驗(yàn)需要電力能源，所以限制了這種技術(shù)在資源匱乏地區(qū)或情況下的使用。實(shí)施現(xiàn)有方法的時(shí)間很長(zhǎng)。為產(chǎn)生足夠的檢測(cè)信號(hào)，需要很多小時(shí)或很多天來(lái)生產(chǎn)足夠的生物目標(biāo)物。用于病原體檢測(cè)、代謝物測(cè)定或核酸序列檢測(cè)的擴(kuò)增步驟，通常需要昂貴的實(shí)驗(yàn)室儀器和訓(xùn)練有素的專業(yè)人員來(lái)使用儀器。對(duì)于PCR，需要小心處理不穩(wěn)定的試劑，必須特別謹(jǐn)慎以防止樣品間污染。另外，進(jìn)行PCR所需要的儀器昂貴又復(fù)雜。以上注意事項(xiàng)是阻礙POC (現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè))使用或30分鐘內(nèi)提供快速樣品-結(jié)果的苛刻的限制。本發(fā)明提供一種解決這些問(wèn)題和其它需要的解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了用于分子檢測(cè)或診斷分析的方法和裝置。本發(fā)明公開(kāi)的方法適用于檢測(cè)或監(jiān)測(cè)在樣品中以很低的濃度存在的一種或多種目標(biāo)物，樣品包括但不僅限于生物的、化學(xué)的和材料的，并且一般可以在缺少目標(biāo)物的復(fù)制或片段或部分目標(biāo)物的擴(kuò)增時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。本申請(qǐng)的方法和裝置適合于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)而不需要使用電源。
[0007]在一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)分析物的方法，通過(guò)執(zhí)行以下步驟i)提供一個(gè)包括層析介質(zhì)的側(cè)向流動(dòng)分析裝置，該裝置包括:(a)位于檢測(cè)區(qū)上游的上樣區(qū)；(b)位于上樣區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間的報(bào)告載體區(qū)，其中所述的報(bào)告載體區(qū)包括能和分析物形成復(fù)合物的報(bào)告載體，所述報(bào)告載體包括載體及一個(gè)或多個(gè)高效酶盒；和((3)檢測(cè)區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)包括分析物的捕獲組分和指示劑；ii)將測(cè)試樣品與點(diǎn)樣區(qū)接觸，其中測(cè)試樣品從上樣區(qū)沿層析介質(zhì)通過(guò)信號(hào)載體區(qū)到達(dá)檢測(cè)區(qū)，并跑出檢測(cè)區(qū)；iii)將底物加入檢測(cè)區(qū)，其中底物在含有報(bào)告載體的高效酶分析物存在下進(jìn)行反應(yīng)；以及iv)在檢測(cè)區(qū)，指示劑產(chǎn)生反應(yīng)，對(duì)應(yīng)于檢測(cè)樣品中分析物的存在或缺失。
[0008]另一個(gè)方面，本發(fā)明提供的一種用于檢測(cè)分析物的裝置，包括:層析介質(zhì)，其包括:位于檢測(cè)區(qū)上游的上樣區(qū)；位于上樣區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間的報(bào)告載體區(qū)，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括能與分析物形成復(fù)合物的報(bào)告載體，所述報(bào)告載體包括載體和一個(gè)或多個(gè)高效酶盒；及檢測(cè)區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)包括分析物的捕獲組分和指示劑，其中所述指示劑檢測(cè)底物在高效酶存在下的反應(yīng)，從而檢測(cè)分析物-酶-報(bào)告載體復(fù)合物的產(chǎn)物和底物，從而檢測(cè)分析物的存在。
[0009]在一方面，本發(fā)明提供的包含側(cè)向流動(dòng)裝置的用于檢測(cè)分析物的試劑盒，包括:多孔膜，包括:上樣區(qū)；位于上樣區(qū)下游的報(bào)告載體區(qū)，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括能與分析物形成復(fù)合物的信號(hào)載體；位于報(bào)告載體區(qū)下游的檢測(cè)區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)包括捕獲組分和指示劑；及高效酶的底物；其中，在測(cè)試樣品流經(jīng)側(cè)向流動(dòng)裝置后，在檢測(cè)區(qū)加入底物，酶和底物的產(chǎn)物可被檢測(cè)。
[0010]在一些【具體實(shí)施方式】中，也能夠用包括以下步驟的方法實(shí)施，這些步驟不是上面列出的順序。例如，可以是(a)固定懷疑含有分析物的樣品中的分析物，(b)連接報(bào)告載體和已經(jīng)固定的分析物以形成報(bào)告載體-分析物復(fù)合物，此復(fù)合物包含有高效酶，(C)提供高效酶的底物，以及(d)測(cè)定高效酶催化反應(yīng)的結(jié)果波動(dòng)，例如，反應(yīng)產(chǎn)物，由此測(cè)定分析物的存在。
[0011]在該方面的【具體實(shí)施方式】中，分析物是蛋白質(zhì)、核酸細(xì)胞、細(xì)胞或病原體的一部分、病原體、病毒顆粒、細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)的組分或小分子。在本方面的實(shí)施例中，報(bào)告載體包含抗體或核酸。
[0012]在該方面的某些【具體實(shí)施方式】中，高效酶可以是脲酶、磷酸膽堿磷酸酶、β -半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、新普魯蘭酶，枯草桿菌蛋白酶、4-肌醇六磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、細(xì)菌亮氨酰氨肽酶、三肽基肽酶1、凝血因子Vila、胰蛋白酶、呋喃果糖苷酶。
[0013]在該方面的【具體實(shí)施方式】中，抗體與高效酶通過(guò)非共價(jià)相互作用相結(jié)合?？蛇x擇地，抗體或核酸與高效酶共價(jià)連接。
[0014]在該方面的其他【具體實(shí)施方式】中，該方法進(jìn)一步使用一種或多種無(wú)活性的酶原。酶原是任何一組復(fù)合物，該復(fù)合物是酶的無(wú)活性前體，并需要一些改變(如覆蓋有活性酶的片段的水解)才有活性。
[0015]在該方面的另一【具體實(shí)施方式】中，高效酶產(chǎn)物的檢測(cè)是通過(guò)pH變化檢測(cè)的，這可能使用含有金納米顆粒的pH敏感水凝膠測(cè)定，該金納米顆粒能對(duì)pH變化進(jìn)行顏色改變應(yīng)答。
[0016]在該方面的進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，高效酶的產(chǎn)物的檢測(cè)是通過(guò)比色變化檢測(cè)的，其中比色變化是由于高效酶輔助反應(yīng)產(chǎn)生的波動(dòng)，例如，染料材料的質(zhì)子或脫質(zhì)子化及銀離子還原反應(yīng)。
[0017]在該方面的進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，高效酶的產(chǎn)物的檢測(cè)是通過(guò)高效酶-輔助反應(yīng)的沉淀檢測(cè)的，例如，可溶性組分的沉淀，可以是包括BSA的蛋白質(zhì)或pH敏感聚合物，由于PH的變化形成聚集體。pH值的變化導(dǎo)致聚合物表面電荷移位。作為表面電荷變化的結(jié)果，聚合物分子3-D結(jié)構(gòu)變化并且該聚合物的疏水部分被暴露出來(lái)。該聚合物的疏水區(qū)域的暴露增加了熵。聚合物的這些疏水部分將形成非共價(jià)相互作用，從而形成聚集體。PH敏感聚合物的例子包括:甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2- (二甲氨基)乙酯和N-羥甲基丙烯酰胺。
[0018]在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分子診斷裝置包括(a)上樣區(qū)，(b)報(bào)告載體區(qū)，其中所述報(bào)告載體區(qū)包含報(bào)告載體和高效酶，(c)高效酶底物的來(lái)源；和((1)檢測(cè)區(qū)，在檢測(cè)區(qū)中包含一個(gè)捕獲組分。
[0019]在該方面的一些【具體實(shí)施方式】中，該裝置還設(shè)有一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照區(qū)。
[0020]在該方面的一些【具體實(shí)施方式】中，上樣區(qū)為上樣板。
[0021]在該方面的一些【具體實(shí)施方式】中，報(bào)告載體區(qū)為結(jié)合板。
[0022]在該方面的一些【具體實(shí)施方式】中，檢測(cè)區(qū)包括多孔膜。
[0023]在該方面的一些【具體實(shí)施方式】中，該裝置具有剛性或彈性背襯材料。
[0024]在該方面的多種【具體實(shí)施方式】中，報(bào)告載體中包含有抗體或核酸。
[0025]在該方面的某些【具體實(shí)施方式】中，高效酶可以是脲酶、磷酸膽堿磷酸酶、β -半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、新普魯蘭酶、枯草桿菌蛋白酶、4-肌醇六磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、細(xì)菌亮氨酰氨肽酶、三肽基肽酶1、凝血因子Vila、胰蛋白酶、貝塔呋喃果糖苷酶。
[0026]在該方面的一【具體實(shí)施方式】中，抗體通過(guò)非共價(jià)相互作用與高效酶相連。可選擇地，抗體或核酸與高效酶共價(jià)連接。[0027]在該方面的其他【具體實(shí)施方式】中，該方法進(jìn)一步使用一種或多種無(wú)活性的酶原。
[0028]在該方面的另一【具體實(shí)施方式】中，高效酶產(chǎn)物的檢測(cè)是通過(guò)pH變化檢測(cè)的，這可能使用含有金納米顆粒的pH敏感水凝膠測(cè)定，該金納米顆粒能對(duì)pH變化進(jìn)行顏色改變應(yīng)答。
[0029]在該方面的進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，高效酶的產(chǎn)物的檢測(cè)是通過(guò)比色變化檢測(cè)的，其中比色變化是由于高效酶輔助反應(yīng)的影響，例如，染料材料的質(zhì)子或脫質(zhì)子化及銀離子還原反應(yīng)。
[0030]在該方面的進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，高效酶的產(chǎn)物的檢測(cè)是通過(guò)高效酶-輔助反應(yīng)的波動(dòng)產(chǎn)生的沉淀檢測(cè)的，例如，可溶性組分的沉淀，可以是包括BSA的蛋白質(zhì)或pH敏感聚合物。pH敏感聚合物的例子包括:甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2-( 二甲氨基)乙酯和N-羥甲基丙烯酰胺。
[0031]在進(jìn)一步的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分子診斷裝置，包括(a)上樣區(qū)，(b)前報(bào)告載體區(qū)，若有此區(qū)，所述前報(bào)告載體區(qū)包含報(bào)告載體和高效酶，(C)高效酶底物的來(lái)源和前報(bào)告載體的報(bào)告載體；和((1)檢測(cè)區(qū)，在檢測(cè)區(qū)中包含捕獲組分。
[0032]在進(jìn)一步的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分子診斷裝置，包括檢測(cè)區(qū)，該檢測(cè)區(qū)中包含一個(gè)捕獲組分。前報(bào)告載體、報(bào)告載體或底物可以順序地加入檢測(cè)區(qū)。
[0033]在進(jìn)一步的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分子診斷裝置，包括檢測(cè)區(qū)，該檢測(cè)區(qū)中包含一個(gè)捕獲組分。該檢測(cè)區(qū)可在多種試劑容器中安置或移動(dòng)，該試劑容器包含以下一種或多種:前報(bào)告載體、報(bào)告載體和底物。
[0034]在進(jìn)一步地另一方面，本發(fā)明提供了一種分子診斷裝置，該分子診斷裝置利用了段落[0031]、[0032]和[0033]突出的過(guò)程的結(jié)合。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1顯示了目標(biāo)物檢測(cè)的一般步驟，包括樣品制備、信號(hào)載體結(jié)合、信號(hào)載體固定、過(guò)量分子的去除及結(jié)果顯示。
[0036]圖2顯示了檢測(cè)核酸的一般步驟。
[0037]圖3顯示了在側(cè)向流動(dòng)裝置上的實(shí)施。
[0038]圖4A-4H顯示了側(cè)向流動(dòng)裝置的各種【具體實(shí)施方式】。
[0039]圖5A-5L顯示了側(cè)向流動(dòng)裝置功能的各種【具體實(shí)施方式】。
[0040]圖6A-6I顯示了檢測(cè)核酸目標(biāo)物的前報(bào)告載體的不同【具體實(shí)施方式】。
[0041]圖7舉例闡明了帶陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果的側(cè)向流動(dòng)裝置。
[0042]圖8舉例闡明了帶陰性測(cè)試結(jié)果的側(cè)向流動(dòng)裝置。
【具體實(shí)施方式】
[0043]本發(fā)明大體上提供了一種用于檢測(cè)在樣品中檢測(cè)極限(LOD)非常低的分析物和目標(biāo)物的方法和裝置，以減少或消除測(cè)定前對(duì)擴(kuò)增步驟的需求。在此所公開(kāi)的方法降低了樣品純度要求從而提供了非常少的復(fù)雜過(guò)程。本發(fā)明的方法和設(shè)備還提供了改進(jìn)的樣品制備過(guò)程，包括樣品富集、純化、標(biāo)記和檢測(cè)。
[0044]一種用于檢測(cè)試驗(yàn)樣品中分析物的側(cè)向流動(dòng)分子診斷裝置，包括層析介質(zhì)，層析介質(zhì)包括:(a)位于檢測(cè)區(qū)上游的上樣區(qū)；(b)位于上樣區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間的報(bào)告載體區(qū)，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括能同分析物形成復(fù)合物的報(bào)告載體；(C)高效酶的底物；和((1)檢測(cè)區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)包括分析物的捕獲組分和高效酶的底物；其中酶和底物的產(chǎn)物被檢測(cè)。
[0045]檢測(cè)試驗(yàn)樣品中分析物存在的側(cè)向?qū)哟畏肿釉\斷裝置還可以進(jìn)一步包括檢測(cè)區(qū)下游的陽(yáng)性對(duì)照區(qū)域。
[0046]對(duì)床旁環(huán)境中使用的核酸檢測(cè)裝置的開(kāi)發(fā)已經(jīng)在嘗試。一些產(chǎn)品通過(guò)將測(cè)試移至臨床實(shí)驗(yàn)室外部分滿足了上述需求。然而，這些方式并沒(méi)有(I)消除對(duì)擴(kuò)增步驟和相關(guān)設(shè)備的依賴，(2)降低檢測(cè)材料的存儲(chǔ)要求，(3)消除對(duì)能從擴(kuò)增中讀取光信號(hào)的復(fù)雜分析儀器的依賴；或(4)消除電力供應(yīng)的依賴。擴(kuò)增的核酸片段作為所述核酸擴(kuò)增試驗(yàn)的結(jié)果，從根本上增加了樣品之間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。
[0047]利用橫向流動(dòng)裝置取代掃描儀或分析儀已有描述，如在US2011086359、W02004092342、Anal.Chem, 2004，V76, P888 以及 Anal.Chem.2009，V81, P1660 中。然而，這些方法，雖然不需要復(fù)雜的分析儀，沒(méi)有預(yù)先擴(kuò)增的直接測(cè)定還是缺乏靈敏度。例如，病原體的核酸檢測(cè)一般需要1，000拷貝或更高以獲得足夠的靈敏度；其他報(bào)道描述了測(cè)定最少需要100，000，000拷貝的擴(kuò)增目標(biāo)物。這些方法需要擴(kuò)增設(shè)備和試劑，這些對(duì)存儲(chǔ)條件很敏感；需要專業(yè)人士進(jìn)行目標(biāo)核酸的擴(kuò)增；以及對(duì)重復(fù)使用同一擴(kuò)增設(shè)備的交叉污染的敏感。
[0048]檢測(cè)病原體也有快速試劑盒，如CLO (http://www.medicinenet.eom/helicobacter_py lor i/article, htm # 2diagnosis),但這些方法都需要(I)較長(zhǎng)的孵育時(shí)間(從幾小時(shí)到幾天)以倍增生物目標(biāo)物；(2)專業(yè)人士進(jìn)行活組織檢查；以及(3)專業(yè)人士
解釋結(jié)果。
[0049]如此處所詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供的方法和裝置，檢測(cè)前可最小化擴(kuò)增或不擴(kuò)增就可以檢測(cè)包括生物學(xué)的、化學(xué)的或材料的一種或多種目標(biāo)物。在某種程度上，這是通過(guò)使用穩(wěn)定和良好的高效酶系統(tǒng)完成的，該高效酶系統(tǒng)無(wú)需預(yù)擴(kuò)增就可以對(duì)生物學(xué)目標(biāo)物進(jìn)行直接測(cè)定。至于核酸檢測(cè)，則降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)槟繕?biāo)物并未復(fù)制，且整個(gè)裝置是一次性的。檢測(cè)時(shí)間大大減少，樣品-結(jié)果時(shí)間少于I小時(shí)或短短為15分鐘。在本發(fā)明中使用的酶在室溫下較穩(wěn)定。在一些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明能夠在沒(méi)有精密儀器情況下進(jìn)行檢測(cè)，從而使本發(fā)明適合應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)(POC )。
[0050]因此，本發(fā)明提供的方法和設(shè)備顯著地降低了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的設(shè)置成本和設(shè)備要求，并適合于應(yīng)用到一次性試劑盒中。這些特點(diǎn)允許消費(fèi)者或其他人士無(wú)需使用前的培訓(xùn)就能直接操作的【具體實(shí)施方式】。此外，本發(fā)明的方法和裝置可以與現(xiàn)有的工作流程相結(jié)合，以改善檢測(cè)極限(LOD)和/或檢測(cè)時(shí)間。
[0051]定義
[0052]需要理解的是，本發(fā)明并不限于特定方法、試劑、化合物、組成或生物系統(tǒng)，這些當(dāng)然可以改變。還需要理解的是，此處所使用的術(shù)語(yǔ)僅出于描述特定方面的目的，而不是為了進(jìn)行限制。如在本說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求書(shū)中使用的，單數(shù)形式“一”、“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)指代，內(nèi)容另有明確規(guī)定除外。
[0053]此處使用的詞語(yǔ)“約”，當(dāng)指可測(cè)量的值，如量、持續(xù)時(shí)間及類似物時(shí)，是指對(duì)額定值的包括±20%或± 10%,更優(yōu)選為±5%,甚至更優(yōu)選為± I %,甚至更優(yōu)選為±0.1 %的變化，因?yàn)檫@樣的變化合適于執(zhí)行所公開(kāi)的方法。
[0054]除非另有定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。雖然任何類似或等同于此處描述的方法和材料可以用于實(shí)踐本發(fā)明的試驗(yàn)中，但優(yōu)選的材料和方法是此處所描述的。
[0055]“分析物”或“目標(biāo)物”是指待檢測(cè)的化合物。這樣的化合物可包括細(xì)胞、部分細(xì)胞或病原體、病原體、病毒顆粒、細(xì)胞的或細(xì)胞外基質(zhì)、小分子、肽、蛋白質(zhì)、核酸以及其它化學(xué)個(gè)體。
[0056]層析介質(zhì)可以由任何測(cè)試樣品能夠通過(guò)的各種各樣的材料制成。例如,層析介質(zhì)可以是由合成的或天然存在的材料形成的多孔膜，如多糖(例如，纖維素材料，如紙和纖維素衍生物，如醋酸纖維素和硝酸纖維素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龍；聚偏二氟乙烯(PVDF);聚酯；聚丙烯；二氧化硅；無(wú)機(jī)材料，如失活氧化鋁、硅藻土、硫酸鎂或其他均勻分布在多孔聚合物基體中的無(wú)機(jī)有孔材料，該聚合物如氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；布，天然存在的(例如棉花)和合成的(例如，尼龍或人造絲)；多孔凝膠，如硅膠、瓊脂糖、葡聚糖和明膠；聚合物膜，如聚丙烯酰胺；等等。在一個(gè)特定的具體實(shí)施例中，層析介質(zhì)是由硝化纖維素和/或聚醚砜材料形成的。需要理解的是，術(shù)語(yǔ)“硝基纖維素”是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨(dú)的硝化纖維，或是硝酸和其他酸的混合酯，其他酸例如具有I至7個(gè)碳原子的脂肪族羧酸。
[0057]層析介質(zhì)的大小和形狀通?？梢宰兓?，如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到的。例如，多孔膜條帶可長(zhǎng)約10毫米至約100毫米，在一些【具體實(shí)施方式】中長(zhǎng)約20毫米至約80毫米，在一些【具體實(shí)施方式】中，長(zhǎng)約40毫米至約60毫米。膜條帶的寬度也可為約0.5毫米至約20毫米，一些【具體實(shí)施方式】中為約I毫米至約15毫米，以及一些【具體實(shí)施方式】中為約2毫米至約10毫米。同樣地，膜條帶的厚度通常要足夠小，以允許以透過(guò)為基礎(chǔ)的檢測(cè)。例如，膜條帶的厚度可小于約500微米，在一些【具體實(shí)施方式】中小于約250微米，以及在一些【具體實(shí)施方式】中，小于約150微米。
[0058]如上所述，支撐材料承載層析介質(zhì)。例如，支撐件21可相鄰于層析介質(zhì)直接放置，如圖3所示，或放置一個(gè)或多個(gè)介于層析介質(zhì)和支撐材料間的中間層。無(wú)論何種情況，支撐材料通?？捎扇魏文軌虺休d層析介質(zhì)的材料構(gòu)成。支撐材料可以由可透射光的材料制成，如透明的或光學(xué)漫射(例如，半透明)材料。此外，一般預(yù)期支撐材料是不透液的，使得流過(guò)介質(zhì)的流體不通過(guò)支撐材料泄漏。合適作為支撐的材料的實(shí)例包括但不僅限于玻璃；聚合物材料，如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯(例如邁拉RTM膜)、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚碳酸酯、環(huán)氧化物、甲基丙烯酸酯和聚三聚氰胺；等等。為了給層析介質(zhì)提供足夠的結(jié)構(gòu)支持，支撐材料的通常選取具有一定的最小厚度。同樣，支撐件8的厚度通常不應(yīng)大到對(duì)它的光學(xué)特性產(chǎn)生不利影響。因此，舉例來(lái)說(shuō)，支撐材料的厚度范圍可從約100微米至約5，000微米，在一些【具體實(shí)施方式】中為約150微米至約2，000微米，在一些實(shí)施例中為從約250微米至約1,000微米。
[0059]正如本領(lǐng)域眾所周知的，層析介質(zhì)可以加到(要層壓結(jié)合的)支撐材料上，其中產(chǎn)生的薄片制品可模切至所需的大小和形狀?？蛇x擇地，層析介質(zhì)可以簡(jiǎn)單地層壓到支撐材料上，例如用粘合劑。在一些【具體實(shí)施方式】中，硝化纖維素或尼龍多孔濾粘附于薄膜上。
[0060]側(cè)向流動(dòng)裝置還包含在遠(yuǎn)端安置的相鄰于層析介質(zhì)的吸收材料，該遠(yuǎn)端即離上樣區(qū)最遠(yuǎn)的層析介質(zhì)端部。吸收材料輔助于促進(jìn)通過(guò)層析介質(zhì)的毛細(xì)管作用和流體流動(dòng)。此夕卜，該吸收材料接收已通過(guò)整個(gè)層析介質(zhì)的流體，從而吸收任何未反應(yīng)的組分以遠(yuǎn)離檢測(cè)和對(duì)照區(qū)域，以幫助降低“假陽(yáng)性”的可能性。可以適用于本發(fā)明的吸收材料包括但不限于以下材料，硝化纖維素、纖維素材料、多孔聚乙烯板、玻璃纖維濾紙，等等。吸收材料在插入到裝置上之前可以是濕的或干的。預(yù)潤(rùn)濕可以有助于一些液體的毛細(xì)流動(dòng)，但通常不是必需的。此外，如本領(lǐng)域中公知的，該吸收材料可使用表面活性劑處理以幫助毛細(xì)作用過(guò)程。
[0061]上樣區(qū)可以由單獨(dú)的材料，如一塊襯板來(lái)形成。可用于形成這樣的樣品襯板的一些合適的材料包括但不限于硝化纖維素、纖維素、多孔聚乙烯板和玻璃纖維濾紙。如果需要的話，上樣區(qū)還可以含有一種或多種預(yù)處理試劑，可以是擴(kuò)散性或非擴(kuò)散性地附于上面。在圖示的【具體實(shí)施方式】中，測(cè)試樣品從上樣區(qū)流至與上樣區(qū)相連接的報(bào)告載體區(qū)。該報(bào)告載體區(qū)可以在層析介質(zhì)上形成?？蛇x擇地，如圖3所示，報(bào)告載體區(qū)由單獨(dú)的材料或襯板形成。這樣的試劑板可以由能讓測(cè)試樣品通過(guò)的任何材料形成，例如玻璃纖維。
[0062]“指示劑”是指任何各種各樣的物質(zhì)，如石蕊、酚酞、或溴麝香草酚藍(lán)、1-羥基-4-[l- (2-羥基乙基磺酰基)苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀、醋酸纖維素耦合1-羥基-4-[l- (2-羥基乙基磺?；?苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀及類似物，通過(guò)特征性變化，尤其是顏色變化來(lái)指示其他物質(zhì)的存在、缺失或濃度，或兩種或兩種以上物質(zhì)間的反應(yīng)程度。
[0063]“樣品”指的是懷疑含有分析物或目標(biāo)分子的任何來(lái)源?？衫帽景l(fā)明進(jìn)行試驗(yàn)的樣品的實(shí)例，除了別的外，包括有但不限于血液、血清、血漿、尿液、唾液、腦脊液、淋巴液、組織和組織及細(xì)胞的提取物、細(xì)胞培養(yǎng)上清、活檢樣本、石蠟包埋組織、土壤、水果、果汁、油、牛奶、食物、水。樣品可以被懸浮或溶解在液體材料中，如緩沖液、提取液、溶劑等。
[0064]“報(bào)告載體”是指與目標(biāo)物或分析物結(jié)合并形成復(fù)合物，并反應(yīng)目標(biāo)物或分析物存在情況的實(shí)體。報(bào)告載體包括蛋白或核酸或可以與分析物或目標(biāo)分子形成復(fù)合物的其他部分。報(bào)告載體與高效酶盒相連接，能包括酶與底物的結(jié)合，僅在存在目標(biāo)物或分析物時(shí)活化。酶盒包括有至少一種與報(bào)告載體連接的高效酶。
[0065]在一些【具體實(shí)施方式】中,載體為抗體或低聚核苷酸。
[0066]“高效酶”或“高產(chǎn)酶”是指可以在接近擴(kuò)散極限在高速率下生成產(chǎn)物的酶。
[0067]“捕獲組分”通常是指能夠特異性地識(shí)別及與目標(biāo)物或分析物復(fù)合的分子，該分子不影響報(bào)告載體與相同目標(biāo)物或分析物形成復(fù)合物的分子。一般地，捕獲元件被固定于層析膜上的基質(zhì)上。
[0068]“前-報(bào)告載體”通常是指在與報(bào)告載體結(jié)合前，與分析物特異性結(jié)合的分子。前-報(bào)告載體一般不含高效酶。
[0069]“高效酶結(jié)合物”通常是指與報(bào)告載體相連的高效酶。相互作用的本質(zhì)是共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合或二者的混合。
[0070]組分與方法
[0071]報(bào)告載體
[0072]A.載體
[0073]報(bào)告載體典型地包括兩種組分:第一種組分是能夠與目標(biāo)物或分析物形成特異性復(fù)合物的載體，它可以是生物性的、化學(xué)性的或其他類型的。另一種組分是一個(gè)或多個(gè)高效酶盒?？梢栽诒景l(fā)明中應(yīng)用的載體包括但不限于具有與至少部分目的核酸序列互補(bǔ)的序列的核酸、抗體、適體、固體或多孔微粒以及具有與目標(biāo)物的至少一部分互補(bǔ)的印壓結(jié)構(gòu)的合成聚合物。固體的、殼核的或多孔的微?？梢宰鳛檩d體的一部分，能提高對(duì)流動(dòng)的控制以引導(dǎo)載體流至反應(yīng)板。這可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)，改變載體的尺寸或密度或提供磁-驅(qū)動(dòng)的粒子運(yùn)動(dòng)的使用，如果顆粒是可磁化的，例如，順磁性粒子。
[0074]在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，不包括高效酶的前-報(bào)告載體形成前-報(bào)告載體-分析物復(fù)合物，稱復(fù)合物A。復(fù)合物A可以通過(guò)固定化劑捕捉和固定。單獨(dú)的前-報(bào)告載體不與固定化劑結(jié)合。若沒(méi)有分析物的存在，就不形成復(fù)合物，前-報(bào)告載體則被沖洗掉。
[0075]報(bào)告載體對(duì)分析物具有特異性。前-報(bào)告載體可被用于與分析物形成復(fù)合物。當(dāng)三種組分都存在于溶液中時(shí)就能產(chǎn)生這種結(jié)合。在一優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，前-報(bào)告載體可在樣品溶液加入到側(cè)向流動(dòng)裝置之前加入到樣品溶液中。分析物前-報(bào)告載體復(fù)合物在信號(hào)載體區(qū)接觸，在此報(bào)告載體與復(fù)合物結(jié)合。分析物在檢測(cè)區(qū)被表面捕獲劑所捕獲和固定。分析物和前-報(bào)告載體的結(jié)合并不會(huì)抑制分析物的固定。當(dāng)存在有分析物和前-報(bào)告載體時(shí)，所述二者的復(fù)合物通過(guò)檢測(cè)區(qū)中的分析物和表面捕捉劑的相互作用而被固定。隨后，報(bào)告載體與該復(fù)合物結(jié)合后就可以被固定。當(dāng)不存在分析物或前-報(bào)告載體分析物復(fù)合物時(shí)，報(bào)告載體則不能被固定，并隨溶劑流動(dòng)和選擇性洗滌而流出檢測(cè)區(qū)，在側(cè)向流動(dòng)裝置上向下移動(dòng)。
[0076]前-報(bào)告載體的作用是多重的。一是增加目標(biāo)分析物的特異性。酶與報(bào)告載體的結(jié)合可以限制背景非目標(biāo)物的影響，以最大化目標(biāo)分析物的結(jié)合選擇性。對(duì)于核酸，結(jié)合的酶的位阻或庫(kù)侖電荷效應(yīng)會(huì)影響雜交的選擇性。另一作用是通過(guò)級(jí)聯(lián)結(jié)合，以增加信號(hào)放大過(guò)程。一個(gè)例子就是對(duì)小的分析物的檢測(cè)。當(dāng)分析物的分子尺寸過(guò)小時(shí)，很難能有多個(gè)報(bào)告載體與一個(gè)分析物形成復(fù)合物。當(dāng)和前-報(bào)告載體形成復(fù)合物，即所述復(fù)合物A時(shí)，每個(gè)分析物分子有更大表面積。復(fù)合物A的形成產(chǎn)生了更大的表面積和官能團(tuán)。增加的表面積和官能團(tuán)能使得多于一個(gè)的報(bào)告載體連接到包括分析物的復(fù)合物上。更多的報(bào)告載體可以產(chǎn)生更多的信號(hào)，由此進(jìn)一步提高信噪比。使用前-報(bào)告載體增加了目標(biāo)物的表面積，以允許每個(gè)分析物發(fā)生更多的報(bào)告載體特異性結(jié)合。
[0077]另一個(gè)【具體實(shí)施方式】減少了報(bào)告載體設(shè)計(jì)的復(fù)雜性，并增加了目標(biāo)分析物的多樣性，例如:病毒基因多態(tài)性或多個(gè)核酸序列目標(biāo)物?？梢栽O(shè)計(jì)多種前-報(bào)告載體的混合物，以與每個(gè)特異性基因型或序列反應(yīng)。所有的前-報(bào)告載體都含有一個(gè)或一個(gè)以上的相對(duì)于報(bào)告載體特異性的標(biāo)記。當(dāng)使用相同的信號(hào)標(biāo)記時(shí)，報(bào)告載體與標(biāo)記特異性結(jié)合，但與前-報(bào)告載體沒(méi)有差異。當(dāng)使用不同的信號(hào)標(biāo)記時(shí)，若對(duì)每個(gè)標(biāo)記所設(shè)計(jì)的報(bào)告載體不同，可以分別地將多個(gè)目標(biāo)物分組。
[0078]圖6A-6I顯示出了檢測(cè)核酸目標(biāo)物時(shí)使用的前-報(bào)告載體的不同的例子。例如，如圖6B和6C所不,前-報(bào)告載體包括有唯一的目標(biāo)物結(jié)合區(qū)(例如，I到N),每一個(gè)都有唯一的標(biāo)記(例如，al到a3)。每一個(gè)唯一的標(biāo)記會(huì)由不同的報(bào)告載體所結(jié)合。這種變化的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，前-報(bào)告載體(因此，對(duì)相應(yīng)的報(bào)告載體也是)結(jié)合于不同的目標(biāo)物位點(diǎn)。這就減少了由于前-報(bào)告載體或報(bào)告載體同錯(cuò)誤的反應(yīng)點(diǎn)的錯(cuò)誤結(jié)合而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。圖6D顯示出的例子中，其唯一的目標(biāo)物結(jié)合區(qū)(1-N)每個(gè)都攜帶有相同的標(biāo)記(“a”)。如圖6E-6F中，每個(gè)前-報(bào)告載體可與同一目標(biāo)物的的部分雜交，而使用單一種類的結(jié)合有高效酶的報(bào)告載體檢測(cè)。在進(jìn)一步的例子中，擁有相同標(biāo)記(“a”)的每一個(gè)前-報(bào)告載體能結(jié)合到不同的目標(biāo)物，相對(duì)于相同目標(biāo)物的不同部分(圖6G-61)。
[0079]“抗體”是指任何的免疫球蛋白，或者是可以應(yīng)用于本發(fā)明實(shí)踐中的、能結(jié)合到特異的抗原表位的完整分子或其片段。這樣的抗體包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人源化的、單鏈的、Fab、Fab'、F (ab)'片段和/或整個(gè)抗體的F (V)部分和其變異型。該術(shù)語(yǔ)包括所有的同種型，并可以用于本發(fā)明的實(shí)踐中，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。
[0080]“抗體片段”特指抗體完整序列中的不完整的或分離的一部分，其保持了母源抗體的抗原結(jié)合功能,并也可以應(yīng)用于本發(fā)明中?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、Fab'、F (ah' )2和Fv片段；雙特異抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0081]應(yīng)用于本發(fā)明中的完整的“抗體”包括通過(guò)二硫鍵互相連接的至少兩個(gè)重鏈(H)和兩條輕鏈(L)。每條重鏈包括一個(gè)重鏈可變區(qū)(此處縮寫(xiě)為HCVR或VH)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈由一個(gè)輕鏈可變區(qū)(此處縮寫(xiě)為L(zhǎng)CVR或VL)和一個(gè)輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分成超變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，散布有更保守的區(qū)域，稱為框架區(qū)(FR)。每個(gè)VH和VL由三個(gè)⑶R和四個(gè)FR組成，從氨基末端至羧基末端以下述順序排列:FR1、⑶R1、FR2、OTR2、FR3、raR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白結(jié)合至宿主組織或因子上，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)。術(shù)語(yǔ)抗體包括完整抗體的抗原結(jié)合部分，保留結(jié)合的能力。結(jié)合的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；
(ii)F (ab' ) 2片段，在鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段組成的二價(jià)片段；(iii) Fd片段，由VH和CHl組成；(iv) Fv片段，由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成，(v)dAb片段(Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989)),其由VH結(jié)構(gòu)域組成，以及(vi)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
[0082]“單鏈抗體”或“單鏈Fv (scFv)”也可應(yīng)用在本發(fā)明中。此術(shù)語(yǔ)是指Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL及VH的抗體融合分子。盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VL及VH由不同基因編碼，它們可以通過(guò)重組方法結(jié)合，使用合成連接物將它們合成單個(gè)蛋白質(zhì)鏈，其中VL和VH區(qū)配對(duì)形成單價(jià)分子(稱為單鏈 Fv(scFv);見(jiàn),例如,Bird et al, Science, 242:423-426 (1988)；和 Huston et al, Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879-5883 (1988))。這樣的單鏈抗體通過(guò)引用包括在術(shù)語(yǔ)“抗體”片段中，它們可通過(guò)重組技術(shù)或完整抗體的酶或化學(xué)切割來(lái)制備。
[0083]“單克隆抗體”可應(yīng)用于本發(fā)明中。單克隆抗體是單一分子組成的抗體分子制劑。單克隆抗體的組成顯示了對(duì)特定抗原決定簇的單一結(jié)合特異性和親和性。
[0084]可以應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)踐中的抗體特異性的非限制性實(shí)例，除了其他的外，包括對(duì)特定抗原特異的抗體；檢測(cè)甲基化DNA的甲基化特異性抗體；以及檢測(cè)磷蛋白的磷酸化特異性抗體。例如，病毒特異性抗體可用于檢測(cè)樣品中病毒粒子的存在。以上描述的所有抗體和片段均可以被能使抗體或片段結(jié)合于高效酶的基團(tuán)所修飾。
[0085]在一些【具體實(shí)施方式】中，核酸可被作為載體。如果使用核酸，能使用與目標(biāo)核酸至少部分配對(duì)的序列的低聚核苷酸。合成核酸的方法是本領(lǐng)域公知的技術(shù)。本發(fā)明的核酸可以被能使核酸連接到高效酶上的基團(tuán)修飾。載體核酸可以引入一個(gè)或幾個(gè)選定的堿基與目標(biāo)物的錯(cuò)配。利用人工引入的錯(cuò)配時(shí)，結(jié)合能量能根據(jù)焓和熵變結(jié)果調(diào)整至載體對(duì)于不同樣品的設(shè)計(jì)或工程選擇性。
[0086]除了包括天然堿基的低聚核苷酸，也可使用包含核苷酸類似物的低聚核苷酸，如肽核酸(PNAs)或鎖核酸(LNAs)。相對(duì)于DNA和RNA，PNA的主鏈?zhǔn)怯呻逆I連接的重復(fù)的N- (2-氨基乙基)-甘氨酸單元組成的。鎖核酸(LNA)是經(jīng)修飾的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分由一個(gè)連接2’氧和4’碳的額外化學(xué)鍵修飾。此化學(xué)鍵“鎖定”了 3'-內(nèi)切(北)構(gòu)象的核糖，此核糖往往出現(xiàn)在A型雙鏈體中。根據(jù)需要，LNA核苷酸能夠與低聚核苷酸中的DNA或RNA殘基混合。這樣的低聚物可以化學(xué)合成和商業(yè)購(gòu)買。
[0087]B.高效酶或載體酶
[0088]本發(fā)明的實(shí)踐中，上文所述載體可以與各種高效酶或載體酶非共價(jià)或共價(jià)地相連。酶，尤其是在本發(fā)明實(shí)踐中有用的酶，特征在于反應(yīng)速率接近底物擴(kuò)散極限。本發(fā)明的高效酶典型地具有IO3/秒/酶到IO8/秒/酶或更高的轉(zhuǎn)化常量。
[0089]適合的高效酶或載體酶的實(shí)例包括但不限于下列EC類，氧化還原酶(EC1)、水解酶(EC3)、裂解酶(EC4)、或連接酶(EC6)、或酶、類似酶的核酸、或催化產(chǎn)質(zhì)子濃度反應(yīng)的酶樣催化劑。
[0090]這些酶的例子是本領(lǐng)域公知的?？蓱?yīng)用于本發(fā)明的酶及其特征和底物包括但不限于如下所示。
[0091]1.脲酶
[0092]EC 編號(hào):3.5.1.5，水解酶
[0093]a.轉(zhuǎn)化率:2.97x103S_1
[0094]b.底物:尿素
[0095]參考文獻(xiàn)1:PDB =Ifwj0
[0096]參考文獻(xiàn)2:Pearson, Μ.A.et al,〈Kinetic and Structural Characterizationof Urease Active Site Variants>Biochemistry, 2000, 39(29)p8575-8584
[0097]2.磷酸膽堿磷酸酶
[0098]EC號(hào):3.1.3.75又名磷酸乙醇胺
[0099]產(chǎn)品規(guī)格:銅綠假單胞菌ΡΑ5292基因PAOl基因野生型(通過(guò)質(zhì)粒構(gòu)建進(jìn)行截?cái)嗪托薷?
[0100]a.轉(zhuǎn)化率:5-7x106S-1
[0101]b.底物:對(duì)硝基苯磷酸
[0102]c.產(chǎn)物:對(duì)硝基酚
[0103]參考文獻(xiàn)1:Beassoni, P.R.et al.Current Microbiology, 200652 (6), p534~539
[0104]3.半乳糖苷酶
[0105]EC號(hào):3.2.1.23來(lái)自馬克思克魯維酵母
[0106]a.轉(zhuǎn)化率:2.7x106S-1
[0107]b.底物:4-硝基苯基-β-D-半乳糖昔
[0108]參考文獻(xiàn)1:0Connell, S.et.a 1.Applied Biochemistry andBiotechnology2007V14I(I)pl-13
[0109]4.木糖還原酶
[0110]EC號(hào):1.1.1.307來(lái)自愛(ài)默生籃狀菌[0111]a.轉(zhuǎn)化率:1-3x105S-1
[0112]b.底物:D-木糖、NADPH
[0113]參考文獻(xiàn)1:Fernandes, S，et al.J.Biosc1.34 (6) 2009p881-890
[0114]5.莽草酸脫氫酶
[0115]ECl.1.1.25 大腸桿菌
[0116]種類:野生型(莽草酸)、突變體3224、￥39?、01074、3674、1106八
[0117]a.轉(zhuǎn)化率:lxlOt1
[0118]b.底物:莽草酸、或奎尼酸、或NAD+
[0119]參考文獻(xiàn)I =Lindner, H.A.J.Bi0.Chem.2004V280, P7162-7169
[0120]6.蘋(píng)果酸脫氫酶
[0121]EC號(hào):1.1.1.37小麥或愛(ài)默生籃狀菌
[0122]a.轉(zhuǎn)化率:lxlOS—1
[0123]b.底物:NADH
[0124]參考文獻(xiàn)I:Maloney, A.P.et al.Eur.J.Biochem2712004p3115-3126·[0125]7.新普魯蘭酶
[0126]EC號(hào):3.2.1.135來(lái)自嗜熱脂肪土芽孢桿菌
[0127]a.轉(zhuǎn)化率:lxlOt1
[0128]b.底物:淀粉(普魯蘭多糖膜又稱E1204)
[0129]參考文獻(xiàn)1:Zareian, S et al., Enzyme Microb.Technol.201046p57-63
[0130]8.枯草桿菌蛋白酶
[0131]EC號(hào):3.4.21.62來(lái)自芽抱桿菌屬
[0132]a.轉(zhuǎn)化率:lxlOS—1
[0133]b.底物:Suc-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對(duì)硝基苯胺
[0134]參考文獻(xiàn)1:Toogood, H.S.Biochem.J.2000250，p321_328
[0135]9.4-植物磷酸酶
[0136]EC號(hào):3.1.3.26來(lái)自煙曲霉菌
[0137]a.轉(zhuǎn)化率:3.5-4.1xlO5S-1
[0138]b.4-硝基苯基磷酸鹽或肌醇六磷酸
[0139]參考文獻(xiàn)1:Rodriguez, E.et al.Biochem Biophys Res Commun.2000268 (2)P373-378
[0140]10.乙酰膽堿酯酶
[0141]EC 號(hào):3.1.1.7
[0142]a.轉(zhuǎn)化率:1.4x105S<
[0143]b.底物:乙酰膽堿
[0144]參考文獻(xiàn)I =Rothenberg M.A.et al.J.Biol.Chem.168 (I) p223_231
[0145]11.漆酶
[0146]EC號(hào):1.10.3.2來(lái)自擔(dān)子菌綱提取
[0147]a.轉(zhuǎn)化率:0.6x105S-1
[0148]b.底物:2，2'-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[0149]參考文獻(xiàn)I: Jordaan, J.et.al., Enzyme Microb.Technol.2004V34, P635-641
[0150]12.細(xì)菌亮氨酰氨肽酶
[0151]EC號(hào):3.4.11.10來(lái)自肝片形吸蟲(chóng)
[0152]a.轉(zhuǎn)化率:0.3x106S-1
[0153]b.底物:L_半胱氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素
[0154]參考文獻(xiàn)l:Acosta，D.et al.Molecular and Biochem.Parasitology2008, V158(I)p52_64.[0155]13.三肽基肽酶I
[0156]EC號(hào):3.4.14.9來(lái)自盤(pán)基網(wǎng)柄菌
[0157]a.轉(zhuǎn)化率:0.55x106S-1
[0158]b.底物:丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-對(duì)硝基苯胺
[0159]參考文獻(xiàn)1:Krimper，R.P.Biochem and Molecular BiologyInternational199947(6)p1079-1088
[0160]14.凝血因子 Vila
[0161]EC 號(hào):3.4.21.21 來(lái)自人類
[0162]a.轉(zhuǎn)化率:0.35x106S_1·[0163]b.底物:N-甲磺?；?D-苯丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-對(duì)硝基苯胺
[0164]參考文獻(xiàn)1:Neuenschwander, P.F.et al.Biochemistry200241p3364-3371
[0165]15.胰蛋白酶
[0166]EC號(hào):3.4.21.4來(lái)自美洲大蠊
[0167]a.轉(zhuǎn)化率:0.91x106S4
[0168]b.底物:0_氨基苯甲?；?AGSRGAGQ- (2，3_ 二硝基苯基-乙二胺)
[0169]參考文獻(xiàn)一:Marana, S.R.et al.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications2002290p494_497
[0170]16.β-呋喃果糖苷酶
[0171]EC號(hào):3.2.1.26來(lái)自海棲熱袍菌
[0172]a.轉(zhuǎn)化率:0.73x106S-1
[0173]b.底物:鹿糖
[0174]參考文獻(xiàn)1:Dipasquale, L.et al.Extremophiles200913p345-354
[0175]分析物檢測(cè)的靈敏度和特異性可以通過(guò)利用溫度躍變或溫度梯度進(jìn)一步改善。一些最穩(wěn)定的酶需要較高的溫度以達(dá)到最佳活性或作為激活酶的觸發(fā)器。因此，反應(yīng)溫度可以是高于室溫，在該溫度下，反應(yīng)仍可進(jìn)行。當(dāng)溫度低于最佳溫度范圍時(shí)，酶的活性大大降低。樣品中的反應(yīng)的污染物或背景分子可以在溫度升至最佳區(qū)間之前先除去或中和。有一種反應(yīng)污染物是可以被溶解溶液中的二氧化碳，這是對(duì)PH變化的干擾。升高溫度會(huì)降低二氧化碳的溶解度，因此減少了這種干擾。提高溫度可以通過(guò)物理方法如集中式太陽(yáng)能、或通過(guò)放熱化學(xué)方法如硫酸鎂或氯化鈣溶劑化的焓變化、或電學(xué)方法如熱泵。熱泵的一個(gè)例子是珀?duì)栙N元件。出于同樣的原因，通過(guò)降低溫度，反應(yīng)速率也可以被刻意降低來(lái)優(yōu)化反應(yīng)。化學(xué)方法的例子是硝酸銨的溶解。熱泵通過(guò)切換電極性可用于降低溫度。在一些【具體實(shí)施方式】中，反應(yīng)溫度為從約 4°C、10°C、20°C、30°C、40°C、50 V、60°C、70 V、80°C、90 V至約95°C，或能仍能保持酶活性的更高溫度，或所述溫度之間的任何溫度。
[0176]除了上述的酶和底物系統(tǒng)，本發(fā)明可利用一個(gè)或兩個(gè)或更多額外的酶原(B、C、D或更多)。在這種【具體實(shí)施方式】中，酶原B可以作為底物被報(bào)告組的酶盒A激活。一旦酶B被激活，酶B可以進(jìn)一步激活酶C，酶C將激活酶D，以此類推。在此種連接的系統(tǒng)中的有效轉(zhuǎn)化常數(shù)是單個(gè)激活的酶原的轉(zhuǎn)化常數(shù)的數(shù)倍。例如，每種酶(B、C、D及更多)的轉(zhuǎn)化常數(shù)可以低至10/秒/酶或102/秒/酶。然而，倍增的轉(zhuǎn)化常數(shù)可超過(guò)104/秒/酶。實(shí)施例包括血液凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中活化的因子X(jué)a激活凝血酶，凝血酶催化血纖維蛋白原成為纖維蛋白?；罨哪敢餐ㄟ^(guò)因子VIIIa和IXa激活因子X(jué)a。
[0177]C.報(bào)告載體的形成
[0178]載體可以通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)方式與高效酶或載體酶連接。結(jié)合的實(shí)施例包括但不限于克隆和表達(dá)的嵌合蛋白質(zhì)作為載體；化學(xué)修飾碳二亞胺-NHS反應(yīng)、硫-金復(fù)合物、甲苯磺?；?胺反應(yīng)、甲醛連接，二硫鍵結(jié)合、分子印跡和使用上述任何方法的位點(diǎn)導(dǎo)向的結(jié)合或隨機(jī)結(jié)合的使用；和非共價(jià)的:通過(guò)生物素-親和素或凝血酶-水蛭素的嵌合連接。
[0179]進(jìn)一步的實(shí)施例是可用于連接一個(gè)過(guò)程中的兩個(gè)目的分子的偶聯(lián)或交聯(lián)化學(xué)過(guò)程，一般被稱為生物偶聯(lián)，這是本領(lǐng)域公知的。常見(jiàn)的耦合化學(xué)過(guò)程利用胺偶聯(lián)賴氨酸殘基(典型的是通過(guò)胺反應(yīng)性琥珀酰亞氨酯)和巰基偶聯(lián)半胱氨酸殘基(通過(guò)巰基反應(yīng)性馬來(lái)酰亞胺)。其他的連接可以通過(guò)環(huán)加成反應(yīng)或“點(diǎn)擊化學(xué)，，產(chǎn)生° 例如，見(jiàn) Bioconjugation Techniques, Greg.T.Hermanson, AcademicPress,1996; " Advances in Bioconjugation " , Kalia, J.and Raines, R.T., CurrentOrganic Chemistry, 14:138-147(2010)。
[0180]可替換地，如果兩種蛋白質(zhì)能結(jié)合，載體可以使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)純化技術(shù)做成融合蛋白。編碼所需融合蛋白的序列準(zhǔn)備好后，即可克隆到任何合適的載體或復(fù)制子中。許多克隆載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，選擇合適的克隆載體是問(wèn)題。用于克隆的重組DNA的載體和其轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的實(shí)施例包括噬菌體λ (大腸桿菌)、pBR322(大腸桿菌)、pACYC177 (大腸桿菌)、pKT230 (革蘭氏陰性菌)、pGV1106 (革蘭氏陰性菌)、pLAFRl (革蘭氏陰性菌)、pME290 (非大腸桿菌革蘭氏陰性菌)、pHV14 (大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、pBD9(芽孢桿菌屬)、pIJ61 (鏈霉菌屬)、pUC6 (鏈霉菌屬)、?ρ5 (酵母菌屬)、YCpl9 (酵母菌屬)和牛乳頭狀瘤病毒(哺乳動(dòng)物細(xì)胞)。見(jiàn)上文Sambrook等；上文DNA克??；上文B.Perbal?；蚩杀粏?dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(用于細(xì)菌表達(dá))和可選擇地，操縱子(在本文中統(tǒng)稱為“控制”的元素)所控制，使得編碼所需蛋白質(zhì)的DNA序列，在轉(zhuǎn)化了包含該表達(dá)構(gòu)建體的載體的宿主細(xì)胞中被轉(zhuǎn)錄成RNA。編碼序列能或不能含有信號(hào)肽或前導(dǎo)序列。前導(dǎo)序列可以在翻譯后程序中被宿主去除。參見(jiàn)，例如，專利號(hào)為4，431，739 ;4，425，437 ;4，338，397的美國(guó)專利。
[0181]表達(dá)載體隨后用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域公知的，并且包括從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)可獲得的永生化細(xì)胞系，例如但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、海拉細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(C0S)、人肝癌細(xì)胞(例如，HepG2)、Madin-Darby牛腎(“MDBK”)細(xì)胞，以及其他細(xì)胞。同樣地，細(xì)菌宿主如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈球菌亞種，也可用于現(xiàn)有表達(dá)構(gòu)建體。本發(fā)明可應(yīng)用的的酵母宿主包括但不限于釀酒酵母、白色念珠菌、麥芽糖假絲酵母、多形漢遜酵母、脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、季也蒙氏畢赤酵母、巴斯德畢赤酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母。桿狀病毒表達(dá)載體使用的昆蟲(chóng)細(xì)胞包括但不限于埃及伊蚊、苜蓿銀紋夜蛾、家蠶、果蠅、草地夜蛾和粉紋夜蛾。
[0182]捕獲組分
[0183]捕獲組分可以被固定在膜表面以捕獲報(bào)告載體-目標(biāo)物復(fù)合物。捕獲分子可以識(shí)別并與目標(biāo)物形成復(fù)合物，且不阻礙報(bào)告載體與同一目標(biāo)分子形成復(fù)合物。只有與目標(biāo)物形成復(fù)合物的報(bào)告載體才會(huì)被捕獲組分所固定。如圖1所示，報(bào)告載體-目標(biāo)物捕獲組分的固定產(chǎn)生了三明治結(jié)構(gòu)的形成。非該結(jié)構(gòu)一部分的報(bào)告載體是可溶的并會(huì)被液體流動(dòng)或沖洗去除，例如，在側(cè)向流動(dòng)方式中。當(dāng)應(yīng)用洗滌溶液時(shí)，優(yōu)選PH約8至約9.5的緩沖液。當(dāng)使用質(zhì)子生成酶和底物時(shí)，緩沖液的緩沖能力必須不大于預(yù)期PH值的變化。典型的洗滌緩沖液的濃度約0.03mM到約0.1禮。含有三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)和磷酸鹽的水溶液、醇水溶液和鹽水緩沖液，是此類合適的緩沖溶液的非限制性實(shí)施例。在一般情況下，捕捉組分為蛋白質(zhì)或核酸。捕獲組分可使用本領(lǐng)域中已知的方法固定到層析介質(zhì)表面。參見(jiàn)，例如，Nakanishi et al., Current Proteomics, 5:161-197 (2008).將核酸固定到表面的方法也是已知的。參見(jiàn)，例如，Wu et al, J.Biomater.Sc1.Polymer.Edn., 19:725-753 (2008) ?在一個(gè)測(cè)試中可采用多種類型的捕獲組分和報(bào)告載體，以檢測(cè)多重目標(biāo)物。例如，多重目標(biāo)物可以是多個(gè)核酸或核酸和非核酸(如蛋白目標(biāo)物)的組合。在本領(lǐng)域中公知的，包括共價(jià)和非共價(jià)的多種固定方法中的任何一種，都可以應(yīng)用在本發(fā)明的實(shí)踐中。
[0184]常規(guī)檢測(cè)方法
[0185]圖1顯示了常規(guī)的目標(biāo)物檢測(cè)的各個(gè)階段，包括樣品制備、報(bào)告載體與目標(biāo)物的結(jié)合、信號(hào)載體-目標(biāo)物固定化、洗滌出去過(guò)量試劑及結(jié)果顯示。
[0186]制備樣品:作為第一步，制備樣品以用于本發(fā)明的方法和設(shè)備中。本領(lǐng)域技術(shù)人員所可知，此階段的可能步驟會(huì)根據(jù)實(shí)施和目標(biāo)分子類型而變化。應(yīng)用于本階段的步驟的實(shí)施例包括但不限于:提高目標(biāo)分子濃度的`方法、從細(xì)胞中提取核酸及樣品純化。在一些【具體實(shí)施方式】中，樣品應(yīng)用前不需要大量準(zhǔn)備樣品(例如，像血液或尿液的液體樣品)。
[0187]結(jié)合報(bào)告載體:如圖1所示，該步驟使用了包含酶盒的報(bào)告載體。該報(bào)告載體將與想要測(cè)定的目標(biāo)分子形成復(fù)合物。
[0188]固定報(bào)告載體:捕獲組分構(gòu)成的固定劑陣列用于捕獲生物目標(biāo)物。如圖1所示，由于固定劑捕獲了與報(bào)告載體已形成復(fù)合物的目標(biāo)物，就形成了固定劑-生物目標(biāo)物-報(bào)告載體的三明治結(jié)構(gòu)。在不同的【具體實(shí)施方式】中，針對(duì)不同的目標(biāo)分子，在陣列中可以有多種固定劑(或捕獲組分)。
[0189]洗去過(guò)量分子:此可選步驟能洗去其它分子、過(guò)量樣品、報(bào)告載體或其他未被固定劑陣列所捕獲的分子。沖洗溶液從檢測(cè)區(qū)上游加入，通過(guò)毛細(xì)作用遷移穿過(guò)檢測(cè)區(qū)，如果存在對(duì)照區(qū)，也穿過(guò)對(duì)照區(qū)，到達(dá)測(cè)試條遠(yuǎn)端的吸收板?？蛇x的洗滌溶液的量取決于測(cè)試條的尺寸和測(cè)試的性質(zhì)，并很容易由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。
[0190]顯示結(jié)果:在這個(gè)階段被固定的報(bào)告載體與試劑、一般的底物混合，他們與載體上的高效酶或高產(chǎn)酶反應(yīng)，快速生成可被觀測(cè)的產(chǎn)物。也可加入一種或多種酶以加速產(chǎn)物的生成，從而形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)。根據(jù)酶和試劑的選擇，能采用不同的檢測(cè)方法。這些包括但不限于例如PH值的變化、顏色變化、顏色密度的變化或發(fā)光，等等。應(yīng)用于層析測(cè)試條的底物一般以噴霧、涂抹、滴入或傾倒方式加入。
[0191]圖2顯示了本發(fā)明在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用。當(dāng)應(yīng)用于核酸目標(biāo)分子時(shí)，一般的工作流程類似于圖1所示。
[0192]制備樣品:在本應(yīng)用中，樣品制備可以包括常規(guī)步驟，例如核酸提取、樣品濃縮、RNA提取和核酸酶抑制。在一些應(yīng)用中，DNA，如基因組DNA，可能需要打斷到一定尺寸，例如，在使用之前進(jìn)行剪切。
[0193]結(jié)合報(bào)告載體:在本應(yīng)用中，高效酶或高產(chǎn)酶結(jié)合到形成為報(bào)告載體或酶盒的合成的多核苷酸上。在一些【具體實(shí)施方式】中，一個(gè)核酸目標(biāo)物可以存在多于一個(gè)的多核苷酸。報(bào)告載體中的多核苷酸可以與目標(biāo)核酸雜交。
[0194]固定報(bào)告載體:如圖2所示，固定劑陣列能包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)目標(biāo)核酸特異的多核苷酸。若存在匹配，則固定劑將與目標(biāo)核酸雜交以形成報(bào)告載體-目標(biāo)物-固定劑復(fù)合物。該復(fù)合物的形成鎖定了報(bào)告載體。報(bào)告載體和固定劑中多核苷酸的選擇可用于多種應(yīng)用，包括但不限于檢測(cè)單核苷酸變異、甲基化或目標(biāo)物測(cè)序。
[0195]洗去過(guò)量分子:在此階段，過(guò)量分子和酶盒被洗去，留下結(jié)合的報(bào)告載體-目標(biāo)物復(fù)合物。
[0196]顯示結(jié)果:報(bào)告載體隨后與底物試劑發(fā)生反應(yīng)，形成可觀測(cè)產(chǎn)物。在一些【具體實(shí)施方式】中，可添加一種或多種附加酶以加速反應(yīng)。
[0197]側(cè)向流動(dòng)平臺(tái)
[0198]圖3顯示了本發(fā)明在側(cè)向流動(dòng)平臺(tái)上的實(shí)施。為獲得最佳性能，它的實(shí)施可以根據(jù)不同樣品類型，相對(duì)于平臺(tái)不同部分的不同組分的位置而變化。在圖3中，樣品板I在結(jié)合板2上游，結(jié)合板2在層析膜3上游，層析膜3在檢測(cè)區(qū)(測(cè)試線)4上游，檢測(cè)區(qū)4在對(duì)照區(qū)(對(duì)照線)5上游，對(duì)照區(qū)5在吸收板6上游。整個(gè)裝置置于支撐材料8上。
[0199]類似于其他形式的側(cè)向流動(dòng)，樣品可以在樣品板處進(jìn)入裝置，并最終通過(guò)背襯材料頂部的膜行進(jìn)到達(dá)吸收板。報(bào)告載體可置于結(jié)合板上，且固定劑陣列可在感應(yīng)線和對(duì)照線處。容易理解的是，對(duì)照線和感應(yīng)線的順序可以不同，在一些【具體實(shí)施方式】中，可以有多條感應(yīng)線。底物試劑和附加酶(如果需要)也可存在于對(duì)照和感應(yīng)線處。
[0200]樣品穿過(guò)結(jié)合板，報(bào)告載體和目標(biāo)物的復(fù)合物形成。當(dāng)樣本前端到達(dá)感應(yīng)線，已與報(bào)告載體形成復(fù)合物的目標(biāo)物將被陣列所固定。然后發(fā)生反應(yīng)以形成足夠的可被監(jiān)測(cè)的產(chǎn)物。如果固定探針(捕獲組分)與樣品中的目標(biāo)物不匹配，那么樣品核酸會(huì)流過(guò)膜，在檢測(cè)線留下極小濃度的酶。對(duì)照線作為裝置上的陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照表明測(cè)試條是有功能的，從而最小化假陰性測(cè)試結(jié)果。
[0201]圖7顯示了一個(gè)陽(yáng)性的測(cè)試結(jié)果。檢測(cè)區(qū)4顯示了酶的存在，表明分析物-報(bào)告載體復(fù)合物在檢測(cè)區(qū)已被捕獲。陽(yáng)性指示劑反應(yīng)是測(cè)試樣品遷移出檢測(cè)區(qū)后，底物加入檢測(cè)條的結(jié)果。對(duì)照區(qū)5也顯示了酶的存在，表明未結(jié)合的報(bào)告載體遷移經(jīng)過(guò)了檢測(cè)裝置，并在對(duì)照區(qū)被捕獲，加入酶底物后產(chǎn)生指示劑的變化，檢測(cè)到未結(jié)合報(bào)告載體的存在。
[0202]圖8顯示了在檢測(cè)區(qū)由于沒(méi)有形成或捕獲分析物報(bào)告載體復(fù)合物的陰性測(cè)試結(jié)果。對(duì)照區(qū)的陽(yáng)性結(jié)果證明測(cè)試條功能正常，并且酶和報(bào)告載體都存在并有活性。
[0203]以下特定方面的實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施例僅出于描述性目的，而非以任何方式限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0204]實(shí)施例
[0205]實(shí)施例1:側(cè)向流動(dòng)裝置【具體實(shí)施方式】
[0206]圖4顯示了各種可用于本發(fā)明的實(shí)踐中的側(cè)向流動(dòng)裝置的【具體實(shí)施方式】。提供了上樣區(qū)I。箭頭方向的流動(dòng)產(chǎn)生了樣品與報(bào)告載體上樣區(qū)2中的報(bào)告載體7的結(jié)合。檢測(cè)區(qū)4含有捕獲組分(向上指向的實(shí)線箭頭)和顯示結(jié)果的材料，如底物，如果有必要，還含有附加酶原以進(jìn)一步放大信號(hào)。提供了陽(yáng)性對(duì)照區(qū)5。如果有供樣品移動(dòng)的支撐腳手架基質(zhì)，可以為化學(xué)涂層或多孔基質(zhì)的膜或支鏈聚合物。如圖4B-4D中，腳手架基質(zhì)可以安裝于固體無(wú)孔支持物8上，其可以是柔性的或多孔的。在一些【具體實(shí)施方式】中，檢測(cè)區(qū)I，可以包含一種類型的固定劑陣列8 (如抗體、抗原、核酸等)或多種類型的固定劑陣列，該陣列置于檢測(cè)區(qū)內(nèi)的不同空間位置4a，4b和4c上。圖4E闡明了，無(wú)活性的酶原9，可以置于固定劑陣列中，當(dāng)它被激活時(shí)可導(dǎo)致系統(tǒng)的高的總體轉(zhuǎn)化率。在進(jìn)一步的【具體實(shí)施方式】中，在固定劑陣列周圍的支撐腳手架基質(zhì)可以包括PH敏感材料，如pH敏感水凝膠10，例如金納米顆粒IOa0這樣的pH敏感材料可以用來(lái)檢測(cè)酶的反應(yīng)，該酶的催化活性產(chǎn)生pH變化。如圖4G和4H所示，可用于實(shí)施本發(fā)明的表面pH敏感顯示分子包括吖啶橙、花青、脂質(zhì)體或熒光右旋糖酐11或可溶性分子例如BSA12。
[0207]實(shí)施例2:側(cè)向流動(dòng)裝置的【具體實(shí)施方式】的操作
[0208]圖5顯示了本發(fā)明不同【具體實(shí)施方式】的操作。樣品目標(biāo)物13被引入上樣區(qū)I (步驟A)。如箭頭所指示的方向的側(cè)向流動(dòng)攜帶樣品目標(biāo)物13與報(bào)告載體7接觸(步驟B)。進(jìn)一步的側(cè)向流動(dòng)攜帶樣品目標(biāo)物與報(bào)告載體14的復(fù)合物進(jìn)入檢測(cè)區(qū)5 (步驟C)。檢測(cè)區(qū)的捕獲組分(向上指向的實(shí)線箭頭)固定樣品目標(biāo)物和報(bào)告載體15的復(fù)合物(步驟D和4-E)。在各種【具體實(shí)施方式】中，捕獲組分可以是單一或多個(gè)變體(比較步驟D和E向上指向的箭頭)。沿著捕獲組分和固定的樣品目標(biāo)物和報(bào)告載體復(fù)合物的側(cè)向流動(dòng)移除諸如未結(jié)合的報(bào)告載體、未結(jié)合的樣品目標(biāo)物等等過(guò)量材料，并作為洗滌步驟(步驟F)。在步驟G中，酶底物和其它可溶性分子可以應(yīng)用于固定劑陣列區(qū)域。在各種【具體實(shí)施方式】中，酶可以是能將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物17，18 的單一高效酶，或者也可以使用多重連接的酶原19。一些可能的其他顯示選擇如步驟J-L所示。例如，反應(yīng)產(chǎn)物17可以通過(guò)水凝膠顏色變化來(lái)測(cè)定，該水凝膠如含有金納米粒子的pH敏感水凝膠10、10b、21、22 (步驟J)。其他顯示選擇可以是基于顏色變化(比如，銀還原反應(yīng))11、23、24 (步驟K)。在另一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，可溶性分子如BSA的pH敏感沉淀可用于顯示結(jié)果12、25 (步驟L)。
[0209]在當(dāng)前公開(kāi)的一個(gè)優(yōu)選【具體實(shí)施方式】中，該裝置也可以是一個(gè)側(cè)向流動(dòng)單元。整個(gè)裝置成本非常低、便于攜帶、無(wú)需其他儀器以及敏感性高。該裝置特征在于不同的方面。一是酶連接于結(jié)合物，另一個(gè)是，指示劑被涂抹或固定在檢測(cè)區(qū)。酶促反應(yīng)的產(chǎn)物與指示劑反應(yīng)，在檢測(cè)區(qū)產(chǎn)生可見(jiàn)的差異。
[0210]指示劑可以是pH敏感的，當(dāng)指示劑質(zhì)子化狀態(tài)改變時(shí)，該指示劑會(huì)改變顏色或熒光。在一【具體實(shí)施方式】中，PH指示劑與載體膜分子發(fā)生反應(yīng)，載體膜分子諸如醋酸纖維素。在另一【具體實(shí)施方式】中，所述pH指示劑被包裹于質(zhì)子透過(guò)性塑料中["Full-rangeoptical pH sensor based on imaging techniques " , Capel-Cuevas, S., Cuellar, M.P.，de Orbe-Payaj 1.，PegalajarjM.C.，Capitan-ValIvey, L.F.，Analytica ChimicaActa, 681 (2010) 71-81] ?在這兩種情況下，所述pH指示劑在膜上的沉積不干擾在側(cè)向流動(dòng)裝置中的結(jié)合。
[0211]在一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，指示劑被印或噴涂在結(jié)合板下游的膜上，形成一條線或一個(gè)區(qū)域。每條線或區(qū)域通過(guò)沒(méi)有指示劑的膜的緩沖區(qū)域與另一線或區(qū)域分開(kāi)。緩沖區(qū)域也能包括一層固定的緩沖成分以阻止不同的線/區(qū)域之間的交叉反應(yīng)。
[0212]在一【具體實(shí)施方式】中，染料(溴麝香草酚藍(lán))是混合溴百里酚藍(lán)2.1mg ;三十二烷基甲基氯化銨(TDMAC) 2.8mg ;癸二酸二辛酯(DOS) 19.6mg ;乙二醇19.6毫克和四氫呋喃(THF) Iml而制備的。溴百里酚溶液的pH值為約8至約9.5。指示劑聚合物溶液用氣噴槍噴涂在膜上。氣噴槍是巖田制作的高性能C PLUS氣噴槍。只有側(cè)向流動(dòng)條上的對(duì)照/檢測(cè)線才被聚合物/指示劑包被。噴灑后，在使用前整個(gè)條形物要置于干燥器中16小時(shí)。
[0213]一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，pH指示劑可以與聚合物如纖維素共價(jià)連接(US4，029，597)。在一【具體實(shí)施方式】中，為染料分子和纖維素的共價(jià)化學(xué)，特別設(shè)計(jì)了有羥基磺酰末端基團(tuán)的PH敏感染料。PH敏感的染料分子用硫酸在室溫下處理，以形成末端為磺基酯基團(tuán)。然后，硫酸中的染料溶液在去離子水中稀釋，并用氫氧化鈉中和。醋酸纖維素在此階段加入到該溶液中。5分鐘后，溶液中加入碳酸鈉，再過(guò)5分鐘加入氫氧化鈉。在強(qiáng)堿性條件下，磺基酯基團(tuán)形成乙烯砜末端基團(tuán)，且醋酸纖維素水解以形成具有末端羥基基團(tuán)的纖維素。在相同堿性條件下，染料分子中的乙烯砜基團(tuán)與纖維素的羥基基團(tuán)反應(yīng)，形成pH指示劑染料與纖維素之間的共價(jià)連接。最終的反應(yīng)產(chǎn)物用去離子水洗滌。pH敏感纖維素溶解在溶劑中以制備重量比為10%的溶液。優(yōu)選水溶液。指示劑溶液噴涂在硝化纖維素膜上，以使PH指示劑染料固定于側(cè)向流動(dòng)裝置上。
[0214]羧酸酯酶的優(yōu)選的底物溶液包括下列組分:
[0215]IOM己酸烯丙酯
[0216]0.1mM Tris pH8.5
[0217]5%異丙醇
[0218]底物為己酸烯丙酯。水解后，一個(gè)己酸烯丙酯分子產(chǎn)生一個(gè)己酸和一個(gè)2-丙烯醇。反應(yīng)起始PH值是由0.1mM Tris限定為pH8.5。底物溶液的緩沖能力將小于50微摩爾。整體質(zhì)子平衡在PH8.5，將產(chǎn)生質(zhì)子過(guò)剩，因此水解會(huì)導(dǎo)致pH值下降。
[0219]水解產(chǎn)生的pH值的變化將導(dǎo)致指示劑例如上述的溴百里酚藍(lán)的從藍(lán)色變?yōu)辄S色。
[0220]在一個(gè)優(yōu)選的【具體實(shí)施方式】中，裝置與空氣中二氧化碳隔離，這將緩慢地改變?nèi)芤旱腜H值至pH6.5。隔離可以通過(guò)層壓或加外殼來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0221]優(yōu)選的載體是直徑為約IOnm到約500nm的微顆粒。優(yōu)選地,顆粒直徑為約IOnm到約lOOnm。顆粒優(yōu)選為乳膠的或金的。顆粒被涂覆有可與高效酶結(jié)合或復(fù)合的材料。優(yōu)選的涂層為鏈霉親和素。優(yōu)選的顆粒為具有鏈霉親和素涂層的20nm金粒子。優(yōu)選的酶是羧酸酯酶。羧酸酯酶的優(yōu)選底物是存于5%異丙醇中的，在pH8的0.1mM Tris緩沖液中的苯乙基丁酸酯和在PH8.5的0.1mM Tris緩沖液中的IOmM己酸烯丙酯。
[0222]優(yōu)選的顆粒組成是40nm Innovacoat金顆粒,用以下方法涂覆鏈霉親和素:
[0223]1.在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中制備0.2mg/mL的鏈霉親和素溶液
[0224]2.將42μ L取自Innovacoat金試劑盒中的反應(yīng)緩沖液<http://www.1nnovabiosciences.com/gold-conjugation-kits/innovacoat-gold.html> (200D40nm),與12 μ L鏈霉親和素溶液混合
[0225]3.將混合物45 μ L轉(zhuǎn)移到部分Innovacoat金上。
[0226]4.在使用5 μ L試劑盒中猝滅劑中止前，在室溫下孵育10分鐘。
[0227]5.離心沉降顆粒并去除上清
[0228]6.用100 μ L PBS緩沖液重懸
[0229]7.重復(fù)步驟5
[0230]8.用50 μ L PBS重懸，并加入終濃度0.1 %的BSA和終濃度0.01% (20KMW)的聚乙二醇溶液
[0231]9.混合IyL生物素化抗體(大約12yg/mL)、2yL生物素化的羧酸酯酶(約700ug/ml)>2 μ L鏈霉親和素修飾的Innovacoat金以形成報(bào)告載體合物即偶聯(lián)物。
[0232]盡管本發(fā)明特定方面已經(jīng)進(jìn)行了描述和圖示，這些方面應(yīng)僅被視為說(shuō)明性的，并不限制本發(fā)明按照所附權(quán)利要求書(shū)的解釋。
[0233]本說(shuō)明書(shū)中所引用的所有的出版物和專利申請(qǐng)都全文引入作為參考，就如每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)囟ǖ?、單?dú)地全文引入作為參考。
[0234]雖然前面的發(fā)明為了清楚理解的目的，通過(guò)圖示和舉例的方式進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，不背離所附權(quán)利要求書(shū)的精神和范圍的一定變化和修飾的啟示是容易想到的。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的方法，所述方法包括； i)提供一個(gè)包括層析介質(zhì)的側(cè)向流動(dòng)分析裝置，所述裝置包括: Ca)位于檢測(cè)區(qū)上游的上樣區(qū)； (b)位于上樣區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間的報(bào)告載體區(qū)，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括報(bào)告載體，所述報(bào)告載體能和所述分析物形成復(fù)合物，所述報(bào)告載體包括一個(gè)載體及一個(gè)或多個(gè)高效酶盒；和 (c)檢測(cè)區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)包括分析物的捕獲組分和指示劑； ii)將測(cè)試樣品與點(diǎn)樣區(qū)接觸，其中所述測(cè)試樣品從所述上樣區(qū)沿所述層析介質(zhì)通過(guò)所述報(bào)告載體區(qū)到達(dá)所述檢測(cè)區(qū)并超過(guò)所述檢測(cè)區(qū)； iii)將底物加入所述檢測(cè)區(qū)，其中所述底物與含有報(bào)告載體的分析物在高效酶存在下發(fā)生反應(yīng)；和 iv)在所述檢測(cè)區(qū)產(chǎn)生所述指示劑的應(yīng)答，所述應(yīng)答對(duì)應(yīng)于所述測(cè)試樣品中所述分析物存在與缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述側(cè)向流動(dòng)裝置還包括一個(gè)檢測(cè)區(qū)下游的對(duì)照區(qū)，且所述對(duì)照區(qū)包括報(bào)告載體的捕獲組分和指示劑； 在所述對(duì)照區(qū)加入底物，其中所述底物在含有報(bào)告載體的高效酶的存在下發(fā)生反應(yīng)；并且 在所述檢測(cè)區(qū)產(chǎn)生所述指·示劑的應(yīng)答，所述應(yīng)答對(duì)應(yīng)于所述報(bào)告載體的存在與缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括維持反應(yīng)溫度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分析物是蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述被測(cè)物是小分子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述被測(cè)物是核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高效酶結(jié)合物包含抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高效酶結(jié)合物包括核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的所述方法，其中所述高效酶結(jié)合物包括高效酶，所述高效酶選自以下酶組成的組:脲酶、磷酸膽堿磷酸酶、半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、羧酸酯酶、新普魯蘭酶、枯草桿菌蛋白酶、4-肌醇六磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、細(xì)菌亮氨酰氨肽酶、三肽基肽酶1、凝血因子Vila、胰蛋白酶、β -呋喃果糖苷酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中反應(yīng)溫度維持在約4°C至約95°C，或更高的仍能保持酶活性的溫度。
11.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體與高效酶非共價(jià)的相互作用形成所述高效酶結(jié)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述核酸共價(jià)的結(jié)合高效酶形成所述高效酶結(jié)合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述抗體共價(jià)的結(jié)合高效酶形成所述高效酶結(jié)合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在檢測(cè)區(qū)進(jìn)一步提供一種或多種無(wú)活性的酶原。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高效酶結(jié)合物的活性通過(guò)監(jiān)測(cè)高效酶輔助反應(yīng)的效果而測(cè)定。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述高效酶輔助反應(yīng)的效果是質(zhì)子釋放。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述質(zhì)子釋放產(chǎn)生pH變化。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述pH變化使用固定于膜上的pH敏感的1-羥基-4-[l- (2-羥基乙基磺?；?苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀指示劑聚合物測(cè)定。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述pH變化使用pH敏感的醋酸纖維素偶聯(lián)染料測(cè)定。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高效酶結(jié)合物的活性通過(guò)比色變化檢測(cè)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高效酶結(jié)合物的活性通過(guò)熒光發(fā)射檢測(cè)。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高效酶結(jié)合物的活性通過(guò)電化學(xué)方法檢測(cè)。
23.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述比色變化是由于銀離子還原。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高效酶結(jié)合物的活性通過(guò)可溶性組分的沉淀檢測(cè)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述可溶性組分是蛋白質(zhì)或pH敏感的聚合物。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述pH敏感的聚合物選自由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2- (二甲氨基)乙酯和N-羥甲基丙烯酰胺組成的組。`
28.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在所述測(cè)試樣品接觸所述樣品應(yīng)用區(qū)之前，將前-報(bào)告載體加入所述測(cè)試樣品中。
29.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括在層析介質(zhì)遠(yuǎn)端的吸收板。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述底物是己酸烯丙酯，且所述高效酶為羧酸酯酶。
31.一種檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物的存在的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，所述側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置包括: 層析介質(zhì)，所述層析介質(zhì)包括: 位于檢測(cè)區(qū)上游的上樣區(qū)； 位于上樣區(qū)和檢測(cè)區(qū)之間的報(bào)告載體區(qū)，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括能與分析物形成復(fù)合物的報(bào)告載體，所述報(bào)告載體包括載體和一個(gè)或多個(gè)高效酶盒；及 檢測(cè)區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)包括分析物的捕獲組分和指示劑，其中所述指示劑檢測(cè)底物在高效酶催化下的反應(yīng)，從而檢測(cè)所述分析物的存在。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，還包括一個(gè)對(duì)照區(qū)，其中所述對(duì)照區(qū)包括所述報(bào)告載體的捕獲組分和檢測(cè)高效酶存在下底物反應(yīng)的指示劑；其中檢測(cè)酶報(bào)告載體復(fù)合物和底物的產(chǎn)物，從而檢測(cè)所述報(bào)告載體的存在。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述高效酶結(jié)合物包括抗體。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述高效酶結(jié)合物包括核酸。
35.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中高效酶結(jié)合物包括選自以下組中的高效酶:脲酶、磷酸膽堿磷酸酶、半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、羧酸酯酶、新普魯蘭酶、枯草桿菌蛋白酶、4-肌醇六磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、細(xì)菌亮氨?；彪拿?、三肽基肽酶1、凝血因子Vila、胰蛋白酶、β -呋喃果糖苷酶。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述抗體與高效酶非共價(jià)相互作用形成高效酶結(jié)合物。
37.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述核酸與高效酶共價(jià)結(jié)合形成高效酶結(jié)合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，在檢測(cè)區(qū)進(jìn)一步提供一種或多種無(wú)活性酶原。
39.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述高效酶結(jié)合物的活性通過(guò)監(jiān)測(cè)高效酶輔助反應(yīng)的效果而測(cè)定。
40.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述指示劑為pH敏感指示劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述pH敏感指示劑為1-羥基-4-[1- (2-羥基乙基磺酰基)苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀。
42.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述pH敏感指示劑為是pH敏感的醋酸纖維素偶聯(lián)染料。
43.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括結(jié)合物板。
44.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述上樣區(qū)包括上樣板。
45.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，還包括一個(gè)剛性或彈性的背襯材料。
46.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述抗體與高效酶通過(guò)非共價(jià)相互作用連接。
47.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述抗體或核酸共價(jià)連接于所述高效酶。·
48.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，還包括一種或多種無(wú)活性酶原的來(lái)源。
49.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)檢測(cè)pH變化檢測(cè)所述聞效酶的廣物。
50.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述pH變化使用pH敏感水凝膠測(cè)定。
51.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)比色變化檢測(cè)高效酶的產(chǎn)物。
52.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)熒光放射檢測(cè)高效酶的產(chǎn)物。
53.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)電化學(xué)方法檢測(cè)高效酶的產(chǎn)物。
54.根據(jù)權(quán)利要求51所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述比色變化是由于銀離子還原。
55.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)可溶性組分的沉淀檢測(cè)高效酶的產(chǎn)物。
56.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述可溶性組分是蛋白質(zhì)或pH敏感聚合物。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白。
58.根據(jù)權(quán)利要求56所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述pH敏感聚合物選自甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2- (二甲氨基)乙基酯和N-羥甲基丙烯酰胺的組。
59.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，還包括在層析介質(zhì)遠(yuǎn)端的吸收板。
60.根據(jù)權(quán)利要求31所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述底物是己酸烯丙酯，且所述高效酶為羧酸酯酶。
61.一種用于檢測(cè)測(cè)試樣品中分析物存在的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，所述側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置包括: 多孔膜，所述多孔濾膜包括: 上樣區(qū)； 位于上樣區(qū)下游的報(bào)告載體區(qū)，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括能與分析物形成復(fù)合物的報(bào)告載體； 位于報(bào)告載體區(qū)下游的檢測(cè)區(qū)，其中所述檢測(cè)區(qū)包括捕獲組分和指示劑；及 高效酶的底物；其中所述底物在所述測(cè)試樣品流過(guò)所述側(cè)向流動(dòng)裝置后加入所述檢測(cè)區(qū)，并且酶和底物的產(chǎn)物被檢測(cè)。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，還包括一個(gè)對(duì)照區(qū)，其中所述對(duì)照區(qū)包括所述報(bào)告載體的捕獲組分和在高效酶存在時(shí)檢測(cè)底物的反應(yīng)的指示劑；其中檢測(cè)酶報(bào)告載體復(fù)合物和底物的產(chǎn)物，從而檢測(cè)報(bào)告載體的存在。
63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述高效酶結(jié)合物包括抗體。
64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述高效酶結(jié)合物包括核酸。
65.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中高效酶結(jié)合物包括選自以下組中的高效酶:脲酶、磷酸膽堿磷酸酶、半乳糖苷酶、木糖還原酶、莽草酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、羧酸酯酶、新普魯蘭酶、枯草桿菌蛋白酶、4-肌醇六磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、漆酶、細(xì)菌亮氨?；彪拿?、三肽基肽酶1、凝血因子Vila、胰蛋白酶、β -呋喃果糖苷酶。
66.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述抗體與高效酶非共價(jià)結(jié)合形成所述高效酶結(jié)合物。
67.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述核酸與高效酶共價(jià)結(jié)合形成所述高效酶結(jié)合物。
68.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，在檢測(cè)區(qū)進(jìn)一步提供一種或多種無(wú)活性酶原。
69.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述高效酶結(jié)合物的活性通過(guò)監(jiān)測(cè)所述高效酶輔助反應(yīng)的效果而測(cè)定。
70.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述指示劑為pH敏感指示劑。
71.根據(jù)權(quán)利要求70所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述pH敏感指示劑為1-羥基-4-[1- (2-羥基乙基磺酰基)苯偶氮基]-萘-2-磺酸鉀。
72.根據(jù)權(quán)利要求70所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述pH敏感指示劑為pH敏感的醋酸纖維素偶聯(lián)染料。
73.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述報(bào)告載體區(qū)包括結(jié)合物板。
74.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述上樣區(qū)包括上樣板。
75.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，還包括一個(gè)剛性或彈性背襯材料。
76.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述抗體與所述高效酶通過(guò)非共價(jià)相互作用連接。
77.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述抗體或核酸共價(jià)連接于所述高效酶。
78.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，還包括一種或多種無(wú)活性酶原的來(lái)源。
79.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)檢測(cè)pH變化檢測(cè)所述高效酶的產(chǎn)物。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述pH變化使用pH敏感水凝膠測(cè)定。
81.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)比色變化檢測(cè)所述聞效酶的廣物。
82.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)熒光放射檢測(cè)所述聞效酶的廣物。
83.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)電化學(xué)方法檢測(cè)所述高效酶的產(chǎn)物。
84.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)試劑盒，其中所述比色變化是由于銀離子還原。 83.根據(jù)權(quán)利要求61所述的側(cè)向流動(dòng)檢`測(cè)裝置中，所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)可溶性組分的沉淀檢測(cè)所述高效酶的產(chǎn)物。 84.根據(jù)權(quán)利要求83所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述可溶性組分是蛋白質(zhì)或pH敏感聚合物。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白。
86.根據(jù)權(quán)利要求84所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述pH敏感聚合物選自甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸2- (二甲氨基)乙基酯和N-羥甲基丙烯酰胺的組。
87.根據(jù)權(quán)利要求60所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，還包括在層析介質(zhì)遠(yuǎn)端的吸收板。
88.根據(jù)權(quán)利要求60所述的側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)裝置，其中所述底物是己酸烯丙酯，且所述高效酶為羧酸酯酶。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK103858009SQ201280041999
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月16日
【發(fā)明者】溫斯頓·王, 斯蒂芬·昌-智·卡奧 申請(qǐng)人:克里多生物醫(yī)藥私人有限公司