非結(jié)合膽紅素的熒光探針的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明描述了熒光標(biāo)記的蛋白的鑒定和應(yīng)用，所述熒光標(biāo)記的蛋白在與膽紅素結(jié)合時(shí)產(chǎn)生熒光指標(biāo)的改變。公開(kāi)了在半胱氨酸或賴(lài)氨酸殘基處標(biāo)記的探針，還公開(kāi)了在半胱氨酸和賴(lài)氨酸兩處用兩種不同的熒光團(tuán)標(biāo)記的探針。這些探針可用于確定流體樣品中的非結(jié)合膽紅素的水平。
【專(zhuān)利說(shuō)明】非結(jié)合膽紅素的熒光探針的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考
[0002] 本申請(qǐng)要求于2011年8月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/527, 849的優(yōu)先權(quán)，所 述申請(qǐng)通過(guò)引用結(jié)合在本文中。
[0003] 關(guān)于聯(lián)邦資助的研究和開(kāi)發(fā)的聲明
[0004] 本工作部分是由全國(guó)衛(wèi)生研究所的R33 DK070314號(hào)Roadmap基金和R44 DK073535號(hào)SBIR基金支持的。因此，美國(guó)政府可以對(duì)本發(fā)明具有特定的權(quán)益。
[0005] 涉及序列表
[0006] 在說(shuō)明書(shū)的最后包含序列表。 發(fā)明領(lǐng)域
[0007] 本發(fā)明的領(lǐng)域涉及非結(jié)合膽紅素的探針的鑒定和應(yīng)用，所述探針為熒光標(biāo)記的蛋 白，在與膽紅素結(jié)合時(shí)產(chǎn)生熒光指標(biāo)的改變，并且所述探針用于測(cè)量非結(jié)合膽紅素的水平。 在確定非結(jié)合膽紅素的水平的流體中通常存在的其他分析物的存在下，這些探針不顯著結(jié) 合或者進(jìn)行顯著的熒光改變。這些非結(jié)合膽紅素的探針可以用于診斷和治療高膽紅素血癥 (hyperbilirubinemia)和導(dǎo)致高膽紅素血癥的疾病。
[0008] 發(fā)明背景
[0009] 膽紅素是血紅蛋白周轉(zhuǎn)的產(chǎn)物，其在水中溶解性差，并且因此主要與血漿中的白 蛋白締合。然而，少部分總血漿膽紅素在水相中是可溶的。該非結(jié)合或游離的級(jí)分能夠 透過(guò)血腦屏障，并且在升高的水平是有神經(jīng)毒性的[Ahlfors CE，Wennberg RP，Ostrow JD and Tiribelli C.Unbound(free)Bilirubin ：improving the paradigm for evaluating neonatal jaundice(非結(jié)合（游離）膽紅素：改進(jìn)評(píng)估新生兒黃疸的范例）· Clin Chem(臨 床化學(xué)）55 :1288-1299, 2009]。在正常條件下，總血清膽紅素通過(guò)在膽紅素產(chǎn)生和分泌 之間的調(diào)節(jié)的平衡維持在低水平。然而，在新生兒中，調(diào)節(jié)機(jī)制可能還沒(méi)有充分成熟，使 得產(chǎn)生-分泌平衡通常偏向累積，這在約60%的新生兒中產(chǎn)生黃疸（jaundice)的黃色 [Maisels MJ 和 McDonagh AF. Phototherapy for neonatal jaundice (新生兒黃痕的光 療法）.N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)藥雜志）358 :920-928,2008]。在大部分情形中，這 種不平衡是良性的，或者實(shí)際上可能是有益的，并且對(duì)于大部分的新生兒能夠自然解決 [Wennberg RP,Ahlfors CE,Bhutani VK,Johnson LH和Shapiro SM. Toward understanding kernicterus ：a challenge to improve the management of jaundiced newborns ( 了角軍 核黃疸：改善患黃疸病新生兒的管理的挑戰(zhàn)）.Pediatrics (兒科學(xué)）117 :474-485, 2006 ; Gopinathan V, Miller NJ, Milner AD 和 Rice-Evans CA. Bilirubin and ascorbate antioxidant activity in neonatal plasma (新生兒血楽中的膽紅素和抗壞血酸抗氧化劑 活性）.FEBS Lett (FEBS通信）349 :197-200,1994]。然而，非結(jié)合膽紅素的濃度可能升高 至有神經(jīng)毒性的水平，導(dǎo)致從可逆的聽(tīng)力缺陷到更嚴(yán)重的核黃疸神經(jīng)學(xué)后遺癥（sequelae of kernicterus)范圍內(nèi)的缺陷，其在極少數(shù)情形中包括死亡[Ahlfors CE，Wennberg RP, Ostrow JD 和 Tiribelli C.Unbound(free)bilirubin ：improving the paradigm for evaluating neonatal jaundice(非結(jié)合（游離）膽紅素：改進(jìn)評(píng)估新生兒黃疸的范 例）.Clin Chem(臨床化學(xué)）55 :1288-1299,2009]。
[0010] 使用光療法或交換輸血的早期干預(yù)能夠治療新生兒中的膽紅素介導(dǎo)的神經(jīng)毒性
[Maisels MJ 和 McDonagh AF. Phototherapy for neonatal jaundice (用于新生兒黃痕的 光療法）.N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）358 :920-928,2008 ;Morris BH，Oh W，Tyson JE,Stevenson DK,Phelps DL,0/ Shea TM,McDavid GE,Perritt RL,Van Meurs KP,Vohr BR，Grisby C，Yao Q，Pedroza C，Das A，Poole WK，Carlo WA，Duara S，Laptook AR，Salhab WA,Shankaran S，Poindexter BB，F(xiàn)anaroff AA，Walsh MC，Rasmussen MR，Stoll BJ，Cotten CM, Donovan EF, Ehrenkranz RA,Guillet R 和 Higgins RD. Aggressive vs. conservative phototherapy for infants with extremely low birth weight (用于出生體重極低的嬰 兒的強(qiáng)化光療法與保守光療法）.N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）359 :1885-1896,2008 ; Kuzniewicz MW， Escobar GJ 和 Newman TB Impact of universal bilirubin screening on severe hyperbilirubinemia and phototherapy use (普遍的膽紅素篩查對(duì)嚴(yán)重的 高膽紅素血癥和光療法應(yīng)用的影響）.Pediatrics(兒科學(xué)）124 :1031-1039,2009]。干 預(yù)的指導(dǎo)主要取決于總膽紅素水平，也考慮孕齡和危險(xiǎn)因素 [Bhutani VK，Johnson L和 Sivieri EM. Predictive ability of a predischarge hour-specific serum bilirubin for subsequent significant hyperbilirubinemia in healthy term and near-term newborns (分娩前小時(shí)特異性的血清膽紅素對(duì)于足月新生兒和接近足月新生兒中后繼的顯 著的高膽紅素血癥的預(yù)測(cè)能力）.Pediatrics (兒科學(xué)）103 :6-14,1999]。然而，基礎(chǔ)生化 和增加的臨床證據(jù)預(yù)測(cè)，更準(zhǔn)確地，應(yīng)該是非結(jié)合膽紅素而不是總膽紅素與膽紅素介導(dǎo)的 神經(jīng)毒性相關(guān)[Ahlfors CE，Wennberg RP，Ostrow JD and Tiribelli C. Unbound (free) bilirubin ：improving the paradigm for evaluating neonatal jaundice (非結(jié)合（游 離）膽紅素：改進(jìn)評(píng)估新生兒黃疸的范例）.Clin Chem(臨床化學(xué)）55 :1288-1299,2009 ; Wennberg RP， Ahlfors CE 和 Aravkin AY.Intervention guidelines for neonatal hyperbilirubinemia :an evidence based quagmire (新生兒高膽紅素血癥的干預(yù)指導(dǎo)：有 據(jù)可依的困境）.Curr Pharm Des(當(dāng)代藥物設(shè)計(jì)）15 :2939_2945, 2009 ;Ahlfors CE，Amin SB和Parker AE. Unbound bilirubin predicts abnormal automated auditory brainstem response in a diverse newborn population (非結(jié)合膽紅素預(yù)測(cè)各種新生兒群體中的異 常的自動(dòng)聽(tīng)覺(jué)腦干反應(yīng)）· JPerinatol (胎兒醫(yī)學(xué)雜志）29 :305-309, 2009 ;0h W，Stevenson DK,Tyson JE,Morris BH,Ahlfors CE,Bender GJ,Wong RJ,Perritt R,Vohr BR,Van Meurs KP，Vreman HJ，Das A，Phelps DL, 0f Shea TM 和 Higgins RD. Influence of clinical status on the association between plasma total and unbound bilirubin and death or adverse neurodevelopmental outcomes in extremely low birth weight infants(臨 床狀態(tài)對(duì)血漿總的和非結(jié)合膽紅素與極低體重嬰兒中的死亡或嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育結(jié)果之間 的相關(guān)性的影響）.Acta Paediati* 99:673-678,2010]。因此，對(duì)于鑒別有膽紅素神經(jīng)毒 性風(fēng)險(xiǎn)的新生兒，非結(jié)合膽紅素應(yīng)該優(yōu)于總膽紅素 [Ahlfors CE. Predicting bilirubin neurotoxicity in jaundiced newborns (在患有黃疸的新生兒中預(yù)測(cè)的膽紅素神經(jīng)毒 性）.Curr Opin Pediatr(現(xiàn)代兒科學(xué)觀(guān)點(diǎn)）22:129-133,2010]。
[0011] 設(shè)計(jì)早產(chǎn)兒中的強(qiáng)化光療法保持總膽紅素在5mg/dL以下[Moiris BH，0h W，Tyson JE,Stevenson DK,Phelps DL,0/ Shea TM,McDavid GE,Perritt RL,Van Meurs KP,Vohr BR,Grisby C,Yao Q,Pedroza C,Das A,Poole WK,Carlo WA,Duara S,LaptookAR, Salhab WA,Shankaran S,Poindexter BB,Fanaroff AA,Walsh MC,Rasmussen MR,Stoll BJ,Cotten CM,Donovan EF,Ehrenkranz RA,Guillet R 和 Higgins RD. Aggressive vs.conservative phototherapy for infants with extremely low birth weight (用于出生體重極低的 嬰兒的強(qiáng)化光療法與保守光療法）.N Engl J Med(新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）359 :1885-1896, 2008]。然而，Moiris等發(fā)現(xiàn)對(duì)于治療維持總膽紅素低于5mg/dL的患者和維持低于8mg/ dL的那些患者，結(jié)果（死亡和神經(jīng)發(fā)育損害）沒(méi)有區(qū)別。然而，這些研究者的隨訪(fǎng)研究發(fā) 現(xiàn)結(jié)果與非結(jié)合膽紅素充分相關(guān)，而不是與總膽紅素相關(guān)[0h W，Stevenson DK，Tyson JE， Morris BH, Ahlfors CE, Bender GJ,Wong RJ,Perritt R, Vohr BR, Van Meurs KP, Vreman HJ，Das A，Phelps DL，0' Shea TM 和 Higgins RD. Influence of clinical status on the association between plasma total and unbound bilirubin and death or adverse neurodevelopmental outcomes in extremely low birth weight infants (臨床狀態(tài)對(duì) 血漿總的和非結(jié)合膽紅素與極低體重嬰兒中的死亡或嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育結(jié)果之間的相關(guān)性 的影響）.Acta Paediati* 99:673-678,2010]。這表明，由于總膽紅素的水平不與非結(jié)合膽 紅素（即，膽紅素的毒性部分）偶聯(lián)，因此使用總膽紅素來(lái)確定何時(shí)遞送光療法可能是誤導(dǎo) 的?？偰懠t素與非結(jié)合膽紅素的解偶聯(lián)可能由顯著干擾膽紅素與白蛋白結(jié)合的分子的存在 而引起。例如，即使總膽紅素低至lmg/dL，但是通過(guò)干擾分子僅置換0. 2%的總膽紅素將導(dǎo) 致非結(jié)合膽紅素=34nM。這是超過(guò)該水平就認(rèn)為對(duì)足月新生兒有毒的非結(jié)合膽紅素水平， 并且通常認(rèn)為對(duì)于早產(chǎn)兒，低得多的非結(jié)合膽紅素水平也是有毒的，諸如在Morris等的實(shí) 驗(yàn)中的那些[Morris BH，Oh W，Tyson JE，Stevenson DK，Phelps DL，0' Shea TM，McDavid GE, Perritt RL, Van Meurs KP, Vohr BR, Grisby C, Yao Q, Pedroza C, Das A, Poole WK, Carlo WA，Duara S，Laptook AR，Salhab WA，Shankaran S，Poindexter BB，F(xiàn)anaroff AA， Walsh MC，Rasmussen MR，Stoll BJ，Cotten CM，Donovan EF，EhFenkranz RA，Guillet R和 Higgins RD. Aggressive vs.conservative phototherapy for infants with extremely low birth weight (用于出生體重極低的嬰兒的強(qiáng)化光療法與保守光療法）.N Engl J Med (新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志）359 :1885-1896, 2008]。
[0012] 多種藥物和代謝物能夠結(jié)合白蛋白，并且結(jié)果將膽紅素從其在白蛋白上的結(jié)合狀 態(tài)置換下來(lái)，由此不管總膽紅素濃度是否增加，非結(jié)合膽紅素濃度增加 [Spear ML，Stahl GE,Paul MH，Egler JM，Pereira GR和 Pol in RA. The effect of 15-hour fat infusions of varying dosage on bilirubin binding to albumin(不同劑量的 15 小時(shí)脂肪輸注 對(duì)膽紅素結(jié)合白蛋白的影響）.JPEN J Parenter Enteral Nutr 9 :144-147,1985 ;Amin SB. Effect of free fatty acids on bilirubin-albumin binding affinity and unbound bilirubin in premature infants(游離脂肪酸對(duì)早產(chǎn)兒中的膽紅素-白蛋白結(jié)合親和力 和非結(jié)合膽紅素的影響）.JPEN J Parenter Enteral Nutr 34:414-420,2010]。特別重 要的膽紅素置換代謝物是游離脂肪酸（FFA)。FFA -直存在，但是維持在低水平，并且對(duì)健 康的足月新生兒沒(méi)有顯著影響。然而，在應(yīng)激條件下，如例如由于敗血癥（sepsis)，F(xiàn)FA水 平可能顯著升高[Nogueira AC，Kawabata V，Biselli P，Lins MH，Valeri C，Seckler M， Hoshino W, Junior LG, Bernik MM, de Andrade Machado JB， Martinez MB， Lotufo PA, Caldini EG, Martins E, Curi R 和 Soriano FG. Changes in plasma free fatty acid levels in septic patients are as sociated with cardiac damage and reduction in heart rate variability(敗血癥患者中血楽游離脂肪酸水平的改變與心肌損害和心 率變異性減少相關(guān)）.Shock(休克）29 :342-348,2008]。除了疾病和應(yīng)激之外，NICU中的 早產(chǎn)嬰兒由于接受腸胃外營(yíng)養(yǎng)和油乳劑如Intralipid㊣產(chǎn)生FFA水平的極大升高[Spear ML, Stahl GE, Paul ΜΗ, Egler JM, Pereira GR 和 Polin RA. The effect of 15-hour fat infusions of varying dosage on bilirubin binding to albumin(不同劑量的 15 小 時(shí)脂肪輸注對(duì)膽紅素結(jié)合白蛋白的影響）.JPEN J Parenter Enteral Nutr 9:144-147， 1985 ；Amin SB.Effect of free fatty acids on bilirubin-albumin binding affinity and unbound bilirubin in premature infants(游離脂肪酸對(duì)早產(chǎn)兒中的膽紅素-白 蛋白結(jié)合親和力和非結(jié)合膽紅素的影響）.JPEN J Parenter Enteral Nutr 34:414-420, 2010]。FFA以與膽紅素相似的高親和力結(jié)合白蛋白。與膽紅素不同，F(xiàn)FA具有多個(gè)高親和 性結(jié)合位點(diǎn)，這使得僅當(dāng)可測(cè)部分的白蛋白結(jié)合位點(diǎn)被FFA占據(jù)時(shí)，膽紅素置換才能變得 明顯[Spear ML，Stahl GE，Paul MH，Egler JM，Pereira GR 和 Polin RA. The effect of 15-hour fat infusions of varying dosage on bilirubin binding to albumin(不同劑 量的15小時(shí)脂肪輸注對(duì)膽紅素結(jié)合白蛋白的影響）.JPEN J Parenter Enteral Nutr 9: 144-147,1985 ；Amin SB. Effect of free fatty acids on bilirubin-albumin binding affinity and unbound bilirubin in premature infants (游離脂肪酸對(duì)早產(chǎn)兒中的膽 紅素-白蛋白結(jié)合親和力和非結(jié)合膽紅素的影響）.JPEN J Parenter Enteral Nutr 34: 414-420,2010]。不能容易地預(yù)測(cè)哪個(gè)接受Intralipid.?的新生兒將產(chǎn)生足夠多量的FFA， 原因在于這取決于孕齡，并且可能取決于諸如酶活性、肥胖以及其他因素 [Spear ML，Stahl GE, Paul ΜΗ,Egler JM, Pereira GR和 Polin RA. The effect of 15-hour fat infusions of varying dosage on bilirubin binding to albumin(不同劑量的 15 小時(shí)脂肪輸注 對(duì)膽紅素結(jié)合白蛋白的影響）.JPEN J Parenter Enteral Nutr 9 :144_147,1985 ;Amin SB. Effect of free fatty acids on bilirubin-albumin binding affinity and unbound bilirubin in premature infants(游離脂肪酸對(duì)早產(chǎn)兒中的膽紅素-白蛋白結(jié)合親和力 和非結(jié)合膽紅素的影響）.JPEN J Parenter Enteral Nutr 34:414-420,2010]。在脂質(zhì)輸 注過(guò)程中監(jiān)測(cè)非結(jié)合FFA的濃度（FFAu)是至關(guān)重要的，原因在于升高的FFAu水平可能引 起免疫抑制、心肌損害和心率變異性減少，以及升高水平的非結(jié)合膽紅素。另外，由于這些 代謝物的非結(jié)合水平取決于多種患者特異性因素，因此只有通過(guò)在Intralipid?輸注過(guò)程 中直接監(jiān)測(cè)非結(jié)合膽紅素才能鑒別出那些有膽紅素神經(jīng)毒性風(fēng)險(xiǎn)的嬰兒。由于通過(guò)增加 Intralipid ?濃度引起的升高的FFA血漿水平產(chǎn)生升高的非結(jié)合膽紅素濃度，而不改變總 膽紅素濃度，因此，對(duì)于膽紅素這是特別正確的。
[0013]細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白（intracellular lipid binding proteins，iLBP)屬于低 分子量單鏈多肽家族。存在四個(gè)公認(rèn)的亞家族。亞家族I包含對(duì)維生素 A衍生物如視黃酸 和視黃醇特異性的蛋白。亞家族II包含具有針對(duì)膽酸、類(lèi)花生酸和血紅素的特異性的蛋 白。亞家族III包含腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs)和亞家族IV包含所有其它類(lèi)型的脂肪 酸結(jié)合蛋白[Haunerland NH和Spener F. Fatty acid-binding proteins-insights from genetic manipulations (脂肪酸結(jié)合蛋白一遺傳操作觀(guān)點(diǎn)）· Prog Lipid Res (脂質(zhì)研究 進(jìn)展）43 :328-349, 2004]，包括以低親和力結(jié)合膽紅素的FABP[Di Pietro SM和Santome JA. Isolation, characterization and binding properties of two rat liver fatty acid-binding protein isoforms (兩種大鼠肝脂肪酸-結(jié)合蛋白異構(gòu)體的分離、表征和結(jié) 合特性）.Biochim Biophys Acta 1478:186-200, 2000]。整個(gè)家族特征在于共有的三維 折疊。不同亞家族的配體結(jié)合特性重合得相當(dāng)多。亞家族I的野生型蛋白[Richieri GV， Ogata RT, Zimmerman AW, Veerkamp JH 和 Kleinfeld AM. Fatty acid binding proteins from different tissues show distinct patterns of fatty acid interactions (來(lái)自 不同組織的脂肪酸結(jié)合蛋白表現(xiàn)出不同的脂肪酸相互作用模式）.Bi0ChemiSt ry(生物化 學(xué)）39 :7197-7204, 2000]和亞家族II的野生型蛋白均與其天然配體一樣好地結(jié)合脂肪酸。 并且，單氨基酸置換能夠使亞家族I和II的蛋白的配體結(jié)合特性互換[Jakoby MG，Miller KR, Toner JJ, Bauman A, Cheng. L, Li E 和 Cistola DP.Ligand-protein electrostatic interactions govern the specificity of retinol-and fatty acid-binding proteins (配體-蛋白靜電相互作用調(diào)節(jié)視黃醇和脂肪酸結(jié)合蛋白的特異性）.Biochemistry (生物 化學(xué)）32 :872-878,19931。
[0014] 美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5, 470, 714, U. S. 6, 444, 432, US7, 601，510 和美國(guó)公布 2010/0298162 通過(guò)引用結(jié)合在本文中，它們描述了產(chǎn)生探針的方法和用于確定非結(jié)合分析物的探針。 這些探針使用來(lái)自iLBP家族的蛋白的天然形式或突變形式構(gòu)建而成。如上文所討論 的，該家族包括 FABPs[Banaszak L，Winter N，Xu Z，Bernlohr DA，Cowan S 和 Jones ΤΑ. Lipid-binding proteins A family of fatty acid and retinoid transport proteins (脂質(zhì)-結(jié)合蛋白：脂肪酸和類(lèi)視黃酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族）.Adv Protein Chem(蛋 白質(zhì)化學(xué)進(jìn)展）45 :89_151，1994 ;Bernlohr DA，Simpson MA，Hertzel AV和 Banaszak LJ. Intracellular lipid-binding proteins and their genes (細(xì)胞內(nèi)月旨質(zhì)-結(jié)合蛋白 及其基因 ）.Annu Rev Nutr (營(yíng)養(yǎng)學(xué)年度綜述）17 :277-303,1997]。FABPs是分子量約為 15kDa的細(xì)胞內(nèi)蛋白，并且具有結(jié)合位點(diǎn)，所述結(jié)合位點(diǎn)在野生型蛋白中結(jié)合1或2FFA以及 其他的代謝物。
[0015] 發(fā)明概述
[0016] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及高度特異性針對(duì)非結(jié)合膽紅素的探針的鑒定和使用所述 探針確定樣品中非結(jié)合膽紅素的濃度的方法，所述樣品從簡(jiǎn)單的水溶液到復(fù)雜的生物學(xué)樣 品，包括人的液體（血液，csf,尿液,組織液），所述方法包括一個(gè)或多個(gè)下述步驟：
[0017] 使用US7, 601，510和US公布2010/0298162的方法和產(chǎn)生放射性膽紅素探針的 方法，使用第二游離的熒光團(tuán)或連接在或包埋在固體基底或聚合物如例如蛋白、聚葡聚糖 (polydextran)、或聚苯乙烯上的第二熒光團(tuán)，產(chǎn)生探針，并且校準(zhǔn)所述探針，以使用方程 (1-3)確定解離常數(shù)，
[0018] 鑒定連接探針與固體基底的方法，并且描述所述探針在裝置中的特性，并且描述 在所述裝置中準(zhǔn)確和精確確定非結(jié)合膽紅素水平的方法[要確定的特性包括：與溶液、溶 液與固體測(cè)量的關(guān)系相比，探針解離的作用、白蛋白緩沖、膽紅素與珠子而非探針的結(jié)合、 珠子上的平衡率]，
[0019] 通過(guò)組合在限定水溶液中針對(duì)一組潛在干擾物的測(cè)試和進(jìn)一步的突變而精制膽 紅素探針，所述潛在的干擾物包括常見(jiàn)的代謝物、藥物、膽紅素光致異構(gòu)體和綴合的膽紅素 以及其他的突變，以獲得與等價(jià)于小于InM非結(jié)合膽紅素或一些醫(yī)學(xué)上適當(dāng)水平的其他分 析物貢獻(xiàn)一致的特異性，
[0020] 通過(guò)檢測(cè)摻加（spiked) 了膽紅素（以保證針對(duì)人血液樣品中的非結(jié)合膽紅素的 特異性）的限定的人血漿中的非結(jié)合膽紅素來(lái)測(cè)試定量，
[0021] 使用在溶液中的或結(jié)合到固體表面上的探針，并且如方程（4和5)的描述計(jì)算非 結(jié)合膽紅素濃度。
[0022] 優(yōu)選的實(shí)施方案涉及基于iLBP的探針，所述iLBP諸如對(duì)應(yīng)于包含一個(gè)或多個(gè)氨 基酸置換和熒光團(tuán)的SEQ ID N0 :3的脂質(zhì)結(jié)合蛋白。優(yōu)選地，所述熒光團(tuán)連接到賴(lài)氨酸殘 基，iLBP的N端氨基酸或連接到半胱氨酸置換上。優(yōu)選地，所述探針與膽紅素結(jié)合，但是不 顯著地與脂肪酸結(jié)合。
[0023] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針包含下述置換：14R，18L，25C，27A，38V，60R，73F， 106L，115R，117D，任選地與羅丹明 B(BL22P1B11)組合。
[0024] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針包含下述置換：14R，18L，38V，60R，73F， 106C，115R和117D，任選地與羅丹明B(L24P19C7)組合。
[0025] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針對(duì)應(yīng)SEQ ID N0 :3的脂質(zhì)結(jié)合蛋白，在選自14， 18, 23, 25, 27, 31，36, 38, 55,60, 72, 73, 74, 78,102,104,106,115 和 117 的位置具有一個(gè)或 多個(gè)氨基酸置換。
[0026] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)連接在位置22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 33， 54, 74, 76,97或98處的半胱氨酸置換上。
[0027] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述熒光團(tuán)連接在位置22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 33， 54, 74, 76,97或98處的賴(lài)氨酸置換上。
[0028] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針在位置7R 20R 46R 100R 125R和130R(KR6) 被置換，更優(yōu)選地，在位置 7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R 100R 125R 129R 和130R(KR14)被置換。
[0029] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針包含至少一個(gè)接頭。所述接頭可以是選自下述的 一種或多種：ACSGGG，SAGCGG，GGGCCG，GSGGCG，DTAGCG，⑶CGGG，GCSGAG，GGDGCG，SSNSCG， SDCAYG, DTNCGG, GSGCSG, GCGCGG, ANACGG,GGACGG,GNCGGG,CGGSCG,GSTSCG,DGGCSG,ATSCGG, ASCGYG, DGACGG, GGSGSGSGG, GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA, SRAWRHPQFGG, RAFIASRRIRRP, RLLLRRLRR，RIIIRRIRR，AAS，NDN，PSNTNHNSNSN，SHRATPNTSPH 及其組合。
[0030] 優(yōu)選地，多核苷酸模板編碼具有可切割的或不可切割的親和標(biāo)簽的iLBP突變蛋 白。更優(yōu)選地，模板多核苷酸模板編碼具有具組氨酸親和標(biāo)簽的iLBP突變蛋白，并且固體 基質(zhì)包含固定的金屬螯合物。
[0031] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，iLBP突變蛋白在小于8的pH(使得所述熒光團(tuán)優(yōu)先與半胱 氨酸側(cè)鏈反應(yīng)）用單個(gè)突光團(tuán)標(biāo)記。優(yōu)選地，所述突光團(tuán)是acrylodan，丹酰氮丙陡（danzyl az iridine)，4- [N- [ (2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二 唑酯（IANBDE)，4-[N-[(2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧雜-l，3-二 唑（IANBDA)，德克薩斯紅C2-馬來(lái)酰亞胺，螢光黃碘乙酰胺，Alexafluor680馬來(lái)酰亞胺， Kodak X-Sight 670 LSS染料，德克薩斯紅，C5-溴乙酰胺，Alexa Fluor 750 C5-馬來(lái)酰亞 胺或 B0DIPY 577/618。
[0032] 在第二優(yōu)選的實(shí)施方案中，iLBP突變蛋白在大于8的pH(以使所述熒光團(tuán)優(yōu)先與 胺如蛋白氨基端或賴(lài)氨酸側(cè)鏈反應(yīng)）用單個(gè)突光團(tuán)標(biāo)記。優(yōu)選地，所述突光團(tuán)是acrylodan 或是吸收和發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光團(tuán)，如Alexa Fluor染料，Bodipy染料，熒光素衍生物，羅 丹明衍生物，德克薩斯紅，Biotium CF750 SE，Kodak X-Sight 670 LSS 染料，LiCor IRDye 680 LT 或 LiCor IRDye 700DX。
[0033] 在備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，iLBP突變蛋白用第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)標(biāo)記。優(yōu) 選地，一個(gè)突光團(tuán)是acrylodan,丹酰氮丙陡，4-[N-[ (2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨 基]-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑酯（IANBDE)，或4-[N-[(2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基 氨基-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑（IANBDA)。優(yōu)選地，另一個(gè)熒光團(tuán)是較長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收和 發(fā)射的熒光團(tuán)，如Alexa Fluor染料，Bodipy，熒光素衍生物，羅丹明衍生物或德克薩斯紅。 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記包括使半胱氨酸與第一熒光團(tuán)在低于或等于8的pH下反 應(yīng)；并且使賴(lài)氨酸與第二熒光團(tuán)在大于8的pH下反應(yīng)。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記包括 使半胱氨酸與第一熒光團(tuán)在低于或等于8的pH下反應(yīng)；并且使iLBP突變蛋白的氨基端與 第二熒光團(tuán)在大于8的pH下反應(yīng)。
[0034] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，通過(guò)向每個(gè)iLBP突變蛋白添加接受體蛋白或肽結(jié) 構(gòu)域而提供第二熒光團(tuán)。優(yōu)選地，所述接受體蛋白或肽結(jié)構(gòu)域選自SNAP-標(biāo)簽，CLIP-標(biāo)簽 和ACP-標(biāo)簽等。在一些實(shí)施方案中，文庫(kù)中的多核苷酸突變體包含編碼熒光蛋白的核苷酸 片段。優(yōu)選地，與所述探針的iLBP突變蛋白部分相比，在暴露于膽紅素時(shí)發(fā)射的熒光的強(qiáng) 度和/或波長(zhǎng)方面，所述接受體蛋白結(jié)構(gòu)域或熒光蛋白具有零強(qiáng)度和/或波長(zhǎng)或顯著降低 的反應(yīng)。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，所述第一熒光團(tuán)連接到賴(lài)氨酸置換上，并且所述第二熒光團(tuán) 連接到半胱氨酸置換上，所述置換選自位置22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 33, 54, 74, 76,97或 98 〇
[0036] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及具有標(biāo)記有第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)的iLBP突變蛋白的 組合物。優(yōu)選地，所述第二熒光團(tuán)在溶液中是游離的，或者連接在不與膽紅素結(jié)合的蛋白 上。優(yōu)選地，第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)能夠在相同的波長(zhǎng)激發(fā)，并且第一熒光團(tuán)和第二熒光 團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)是不同的。優(yōu)選地，第二熒光團(tuán)不受響應(yīng)膽紅素與iLBP突變蛋白結(jié)合的影響 (不改變其發(fā)射）。優(yōu)選地，第一熒光團(tuán)是acrylodan，并且第二熒光團(tuán)選自羅丹明B，NBD， 螢光黃，德克薩斯紅，Bodipy染料和Alexa Fluor染料。更優(yōu)選地，第一熒光團(tuán)是LiCor 700DX，并且第二熒光團(tuán)是，例如，德克薩斯紅或Alexa fluor染料，或Bodipy染料。
[0037] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在兩個(gè)不同的波長(zhǎng)處測(cè)量熒光指數(shù)比率的改變，并且用來(lái) 確定非結(jié)合膽紅素濃度。
[0038] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與本文所述的探針連接的熒光團(tuán)的發(fā)射強(qiáng)度不受血液成分 (諸如膽紅素和血紅蛋白）的吸光度的影響。
[0039] 在一些實(shí)施方案中，第一突光團(tuán)連接在半胱氨酸上，并且選自acrylodan,丹酰 氮丙啶，4- [N- [ (2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑酯 (IANBDE)和4-[N-[(2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑 (IANBDA)，第二熒光團(tuán)選自Alexa Fluor染料，Bodipy，熒光素衍生物，羅丹明衍生物和德克 薩斯紅。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，第一突光團(tuán)連接在賴(lài)氨酸上，并且選自acrylodan，Biotium CF750SE，Kodak X-Sight 670 LSS 染料，Licor IR 染料 680 LT 和 Licor IR 染料 700DX，第 二熒光團(tuán)選自Alexa Fluor染料，Bodipy，熒光素衍生物，羅丹明衍生物和德克薩斯紅。
[0041] 在本文所述的本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施方案中，第二不同的熒光團(tuán)提供為在溶液中 游離的可溶分子。所述探針響應(yīng)針對(duì)探針的蛋白部分的膽紅素結(jié)合，具有在兩個(gè)不同波長(zhǎng) 測(cè)量的熒光指數(shù)的比率改變。這允許通過(guò)使用不表現(xiàn)出針對(duì)膽紅素顯著反應(yīng)的第二但是不 連接的熒光團(tuán)將不顯示響應(yīng)于膽紅素結(jié)合的比率熒光指數(shù)改變的探針容易地轉(zhuǎn)換為比率 探針（ratioprobe)。第二游離熒光團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)于或短于第一（蛋白結(jié)合的）熒光團(tuán)， 但是這兩種熒光團(tuán)必須具有共有的激發(fā)波長(zhǎng)。例如，在一些實(shí)施方案中，第一（蛋白連接 的）熒光團(tuán)是acrylodan，并且第二的實(shí)例包括但不限于羅丹明B，NBD，螢光黃和德克薩斯 紅，其是在溶液中游離的或連接到或包埋在另一種聚合物或固體基底上。這種安排具有下 述優(yōu)點(diǎn)：游離熒光團(tuán)的濃度可以進(jìn)行調(diào)節(jié)，以使得甚至當(dāng)?shù)诙晒鈭F(tuán)的最大激發(fā)波長(zhǎng)不同 于第一熒光團(tuán)時(shí)，兩種熒光團(tuán)的發(fā)射強(qiáng)度仍然是相似的。使用不與探針連接的第二不同的 熒光團(tuán)的這種類(lèi)型的比率探針消除了由另一種熒光團(tuán)淬滅這兩種熒光團(tuán)中的一種的能量 轉(zhuǎn)移的問(wèn)題，其在當(dāng)這兩種熒光團(tuán)位于相同的大分子上，如蛋白上時(shí)是典型的。
[0042] 在一些實(shí)施方案中，第二熒光團(tuán)與探針上的接受體蛋白或肽結(jié)構(gòu)域連接。優(yōu)選地， 所述接受體蛋白或肽結(jié)構(gòu)域選自SNAP-標(biāo)簽，CLIP標(biāo)簽和ACP-標(biāo)簽。優(yōu)選地，所述探針包 含下述置換：7R 20R 46R 100R 125R和130R(KR6)。更優(yōu)選地，所述探針包含下述置換：7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R 100R 125R 129R 和 130R(KR14)。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，對(duì)于上述任一種探針，N端MAFD可以置換為例如MGIFD，MGCFD 或 MGGSATGIFD。
[0044] 在一些實(shí)施方案中，所述探針包含至少一個(gè)接頭，如：ACSGGG，SAGCGG，GGGCCG， GSGGCG， DTAGCG， GDCGGG， GCSGAG， G⑶GCG， SSNSCG， SDCAYG， DTNCGG， GSGCSG， GCGCGG， ANACGG, GGACGG, GNCGGG, CGGSCG, GSTSCG, DGGCSG, ATSCGG, ASCGYG, DGACGG, GGSGSGSGG, GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA, SRAWRHPQFGG, RAFIASRRIRRP, RLLLRRLRR, RIIIRRIRR, AAS, NDN，PSNTNHNSNSN，SHRATPNTSPH 其組合。
[0045] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及熒光團(tuán)連接在半胱氨酸殘基上的探針。優(yōu)選地，所述熒 光團(tuán)選自acrylodan，丹酰氮丙陡，4-[N-[(2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基 苯-2-氧雜-1，3-二唑酯（IANBDE)，4-[N-[(2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨基-7-硝 基苯-2-氧雜-1，3-二唑（IANBDA)，德克薩斯紅C2-馬來(lái)酰亞胺，螢光黃碘乙酰胺， Alexafluor 680馬來(lái)酰亞胺，Kodak X-Sight 670 LSS染料，德克薩斯紅C2-馬來(lái)酰亞胺， 德克薩斯紅C5-溴乙酰胺，Alexa Fluor 750 C5-馬來(lái)酰亞胺和B0DIPY 577/618。
[0046] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及熒光團(tuán)連接在賴(lài)氨酸殘基上的探針。優(yōu)選地，所述熒光團(tuán) 選自acrylodan，Alexa Fluor染料，Bodipy，突光素衍生物，羅丹明衍生物，德克薩斯紅， Biotium CF750 SE，Kodak X-Sight 670 LSS 染料，LiCor IRDye 680 LT 和 LiCor IRDye 700DX。
[0047] 在一些實(shí)施方案中，上述任一種探針可以在探針的C或N端包含兩個(gè)以上的標(biāo)簽， 以及用以與固體支持物連接的一個(gè)或多個(gè)接頭。
[0048] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針包含在位置25的LI-C0R 700DX標(biāo)記的賴(lài)氨酸。
[0049] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針使用兩個(gè)His-標(biāo)簽和兩個(gè)接頭連接在固體 支持物上。
[0050] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述探針包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽，優(yōu)選地,所述標(biāo)簽選自 his-標(biāo)簽和PS_標(biāo)簽。
[0051] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包含一個(gè)或多個(gè)上文所述的探針的組合物。
[0052] 其他優(yōu)選的實(shí)施方案包括連接在固體基底上的膽紅素探針，所述固體基底包括但 不限于，聚苯乙烯或膠乳珠，并且所述珠子可以固定在表面上。使用這樣固定的顆粒的實(shí)例 包括但不限于粘附在用于高通量測(cè)量的多孔板的底表面上或在一次性微流體裝置的通道 中。設(shè)計(jì)成固定在表面上的膽紅素探針的實(shí)例包括通過(guò)與半胱氨酸或賴(lài)氨酸（表8的前兩 個(gè)基團(tuán)）的化學(xué)反應(yīng)與固體支持物表面上的適當(dāng)?shù)幕鶊F(tuán)連接的探針以及通過(guò)非共價(jià)相互 作用（表8的第三個(gè)基團(tuán)和實(shí)施例6和7)連接的探針。另外，第二熒光團(tuán)可以連接到或包 埋在固體支持物表面中，由此使這兩種熒光團(tuán)分開(kāi)，從而消除能量轉(zhuǎn)移，并且由此獲得針對(duì) 膽紅素結(jié)合的比率反應(yīng)（ratio response)。另外，第二突光團(tuán)可以與另一種蛋白（如iLBP) 連接，或與另一種類(lèi)型的不與膽紅素結(jié)合或反應(yīng)的聚合物（如葡聚糖）連接。
[0053] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及包括連接到固體基底上的上述任一種探針的固體基底。優(yōu) 選地，所述固體基底為聚苯乙烯或膠乳珠，Ni-瓊脂糖珠，任選地具有鐵核，和/或微流體裝 置或多孔板。選擇連接到固體基底上的探針可以包含上述任一種單獨(dú)的修飾或組合，包括 但不限于，N端修飾，接頭和表面賴(lài)氨酸置換（KR6和KR14)。
[0054] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，探針被加標(biāo)簽以與固體基底連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo) 簽包括下述中的一種或多種：His-標(biāo)簽，生物素，F(xiàn)lag-表位，c-myc表位，HA-標(biāo)簽，谷胱甘 肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)，殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)，硫氧還蛋白，β-半 乳糖昔酶，VSV -糖蛋白，f丐調(diào)蛋白結(jié)合蛋白，聚本乙?。≒S)疏水性標(biāo)簽和金屬未和標(biāo)簽。
[0055] 在一些實(shí)施方案中，所述固體基底包括第二熒光團(tuán)。第二熒光團(tuán)可以連接到不與 膽紅素結(jié)合的蛋白上。
[0056] 優(yōu)選的實(shí)施方案涉及一種固體基底，其中探針具有標(biāo)簽，并且所述固體基底包括 針對(duì)所述標(biāo)簽的受體。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽是聚組氨酸標(biāo)簽，并且所述固體基底包括固定的金 屬螯合物。
[0057] 本發(fā)明的實(shí)施方案涉及具有被熒光染料標(biāo)記的單個(gè)半胱氨酸或賴(lài)氨酸的iLBP突 變蛋白。優(yōu)選地，在半胱氨酸/賴(lài)氨酸標(biāo)記條件下具有熒光標(biāo)記活性的任意表面賴(lài)氨酸或 任意其他半胱氨酸被替換為另一種氨基酸，優(yōu)選替換為丙氨酸或精氨酸。在使用對(duì)應(yīng)SEQ ID N0 :3的iLBP突變蛋白模板的優(yōu)選實(shí)施方案中，位置27的賴(lài)氨酸是高度反應(yīng)性的，并且 被突變，典型地突變?yōu)楸彼帷?br> [0058] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膽紅素與諸如白蛋白、脂質(zhì)結(jié)合蛋白、脂質(zhì)小泡或環(huán)糊精的 載體大分子復(fù)合。膽紅素與所述載體大分子的復(fù)合緩沖非結(jié)合膽紅素的濃度，這提供非結(jié) 合膽紅素水平的鉗制（clamping)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體大分子是白蛋白。在其 他優(yōu)選的實(shí)施方案中，白蛋白是人血清白蛋白，其具有的針對(duì)膽紅素的親和力大于例如牛 血清白蛋白，并且，因此，在一些實(shí)施方案中是更優(yōu)選的白蛋白緩沖劑。
[0059] 在一些實(shí)施方案中，膽紅素吸光度與膽紅素探針的熒光團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)重合，并且 在小杯中進(jìn)行校準(zhǔn)，其中徑長(zhǎng)d足夠大，足以使得內(nèi)濾吸光度（inner filter absorbance) 是顯著的。在這種情形中，所以熒光團(tuán)的發(fā)射強(qiáng)度必須針對(duì)針對(duì)膽紅素探針滴定數(shù)據(jù)擬合 校準(zhǔn)方程之前或在用方程4或5確定游離的（非結(jié)合）膽紅素濃度[Bf]時(shí)在激發(fā)波長(zhǎng)以 及可能的在發(fā)射波長(zhǎng)的膽紅素吸光度的內(nèi)濾吸光度進(jìn)行校正。用于校正的發(fā)射強(qiáng)度(Igf) 的方程為：
[0060]
【權(quán)利要求】
1. 包含（iLBP)的探針，其中所述iLBP對(duì)應(yīng)于包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換和熒光團(tuán)的 SEQ ID NO :3,其中所述熒光團(tuán)連接到賴(lài)氨酸殘基，iLBP的N端氨基基團(tuán)或半胱氨酸置換， 并且所述探針結(jié)合膽紅素而不顯著結(jié)合脂肪酸。
2. 權(quán)利要求1的探針，其還包含下述置換：14R，18L，25C，27A，38V，60R，73F，106L， 115R，117D，任選地與羅丹明B(BL22P1B11)組合。
3. 權(quán)利要求1的探針，其還包含下述置換：141?，181^，38￥，601?，73?，106(：，1151?和1170， 任選地與羅丹明B(L24P19C7)組合。
4. 權(quán)利要求1的包含iLBP的探針，其中脂質(zhì)結(jié)合蛋白對(duì)應(yīng)于包含選自14,18, 23, 25， 27, 31，36, 38, 55,60, 72, 73, 74, 78,102,104,106,115 和 117 的位置處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸 置換的 SEQ ID NO :3。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其中所述熒光團(tuán)連接到半胱氨酸置換上，并且其中 所述半胱氨酸置換選自由位置22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 33, 54, 74, 76,97和98組成的組。
6. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其中所述熒光團(tuán)連接到賴(lài)氨酸置換上，并且其中所 述賴(lài)氨酸置換選自由位置22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 33, 54, 74, 76,97和98組成的組。
7. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其還包含下述置換：7R 20R 46R 100R 125R和 130R(KR6)。
8. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其還包含下述置換：7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R 100R 125R 129R和 130R(KR14)。
9. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其中N端MAFD被置換為MGIFD。
10. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其中N端MAFD被置換為MGCFD。
11. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其中N端MAFD被置換為MGGSATGIFD。
12. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其還包含至少一個(gè)接頭。
13. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其還包含選自下述的一個(gè)或多個(gè)接頭： ACSGGG，SAGCGG，GGGCCG，GSGGCG，DTAGCG，⑶CGGG，GCSGAG，GGDGCG，SSNSCG，SDCAYG， DTNCGG, GSGCSG, GCGCGG, ANACGG, GGACGG, GNCGGG, CGGSCG, GSTSCG, DGGCSG, ATSCGG, ASCGYG, DGACGG, GGSGSGSGG, GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA, SRAWRHPQFGG, RAFIASRRIRRP, RLLLRRLRR，RIIIRRIRR，AAS，NDN，PSNTNHNSNSN，SHRATPNTSPH 及其組合。
14. 包含權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的探針的組合物。
15. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其包含兩個(gè)熒光團(tuán)，其中第一熒光團(tuán)連接到賴(lài)氨 酸置換上，并且其中第二熒光團(tuán)連接到半胱氨酸置換上，所述半胱氨酸置換選自由位置22， 24, 25, 26, 27, 29, 30, 33, 54, 74, 76,97 和 98 組成的組。
16. 包含用第一熒光團(tuán)和第二熒光團(tuán)標(biāo)記的iLBP突變蛋白的組合物，其中所述第二 熒光團(tuán)是在溶液中游離的或與不結(jié)合膽紅素的蛋白連接，其中所述第一熒光團(tuán)和所述第二 熒光團(tuán)能夠在相同的波長(zhǎng)激發(fā)，并且其中所述第一熒光團(tuán)和所述第二熒光團(tuán)的發(fā)射波長(zhǎng)不 同，并且其中所述第二熒光團(tuán)不受響應(yīng)膽紅素與所述iLBP蛋白結(jié)合的影響（不改變其發(fā) 射）。
17. 權(quán)利要求16的組合物，其中所述第一突光團(tuán)是acrylodan，所述第二突光團(tuán)選自由 羅丹明B，NBD，螢光黃，德克薩斯紅，Bodipy染料和Alexa Fluor染料組成的組。
18. 權(quán)利要求16的組合物，其中所述第一熒光團(tuán)是LiCor 700DX，所述第二熒光團(tuán)是例 如德克薩斯紅或Alexa f luor染料，或Bodipy染料，
19. 權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的組合物，其中在兩個(gè)不同的波長(zhǎng)處測(cè)量熒光指數(shù)比率 的改變，并且用來(lái)確定非結(jié)合膽紅素濃度。
20. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針或權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)的組合物，其中所述熒光 團(tuán)的發(fā)射強(qiáng)度不受選自膽紅素和血紅蛋白的血液成分的吸光度的影響。
21. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其還包含第二熒光團(tuán)。
22. 權(quán)利要求21的探針，其中所述第一熒光團(tuán)連接到半胱氨酸上，并且選自由 acrylodan，丹酰氮丙陡，4-[N_[ (2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧 雜-1，3-二唑酯（IANBDE)，和4-[N-[(2-碘乙酰氧）乙基]-N-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧 雜-1，3-二唑（IANBDA)組成的組，并且所述第二熒光團(tuán)選自由Alexa Fluor染料，Bodipy， 熒光素衍生物，羅丹明衍生物和德克薩斯紅組成的組。
23. 權(quán)利要求21的探針，其中所述第一熒光團(tuán)連接到賴(lài)氨酸上，并且選自由 acrylodan，Biotium CF750SE，Kodak X-Sight 670 LSS染料，Licor IR染料680 LT和 Licor IR染料700DX組成的組，并且所述第二熒光團(tuán)選自由Alexa Fluor染料，Bodipy，熒光素衍 生物，羅丹明衍生物和德克薩斯紅組成的組。
24. 權(quán)利要求21的探針，其中所述第二熒光團(tuán)是在溶液中游離的或連接到所述探針上 的接受體蛋白或肽結(jié)構(gòu)域。
25. 權(quán)利要求24的探針，其中所述接受體蛋白或肽結(jié)構(gòu)域選自SNAP-標(biāo)簽，CLIP-標(biāo)簽 和ACP-標(biāo)簽。
26. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的探針，其還包含下述置換：7R 20R 46R 100R 125R和 130R(KR6)。
27. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的探針，其還包含下述置換：7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R 100R 125R 129R和 130R(KR14)。
28. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的探針，其中N端MAFD被置換為MGIFD。
29. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的探針，其中N端MAFD被置換為MGCFD。
30. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的探針，其中N端MAFD被置換為MGGSATGIFD。
31. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的探針，其還包含至少一個(gè)接頭。
32. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的探針，其還包含選自下述的一個(gè)或多個(gè)接頭： ACSGGG，SAGCGG，GGGCCG，GSGGCG，DTAGCG，⑶CGGG，GCSGAG，GGDGCG，SSNSCG，SDCAYG， DTNCGG, GSGCSG, GCGCGG, ANACGG, GGACGG, GNCGGG, CGGSCG, GSTSCG, DGGCSG, ATSCGG, ASCGYG, DGACGG, GGSGSGSGG, GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA, SRAWRHPQFGG, RAFIASRRIRRP, RLLLRRLRR，RIIIRRIRR，AAS，NDN，PSNTNHNSNSN，SHRATPNTSPH 及其組合。
33. 包含至少一種選自權(quán)利要求15和20-32中任一項(xiàng)的探針的組合物。
34. -種固體基底，其包括連接到所述固體基底上的權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其 中所述固體基底優(yōu)選是聚苯乙烯或膠乳珠，Ni-瓊脂糖珠，任選地具有鐵核，和/或微流體 裝置或多孔板。
35. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針的N端MAFD被置換為MGIFD。
36. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針的N端MAFD被置換為MGCFD。
37. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針的N端MAFD被置換為MGGSATGIFD。
38. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針還包含下述置換：7R 20R 46R 100R 125R 和 130R(KR6)。
39. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針還包含下述置換：7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R 100R 125R 129R 和 130R(KR14)。
40. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針還包含至少一個(gè)接頭。
41. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針還包含選自下述的一個(gè)或多個(gè)接頭： ACSGGG，SAGCGG，GGGCCG，GSGGCG，DTAGCG，⑶CGGG，GCSGAG，GGDGCG，SSNSCG，SDCAYG，DTNCGG， GSGCSG,GCGCGG,ANACGG,GGACGG,GNCGGG,CGGSCG,GSTSCG,DGGCSG,ATSCGG,ASCGYG,DGACGG, GGSGSGSGG, GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA, SRAWRHPQFGG, RAFIASRRIRRP, RLLLRRLRR, RIIIRRIRR，AAS，NDN，PSNTNHNSNSN，SHRATPNTSPH 及其組合。
42. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針被加標(biāo)簽用于連接到所述固體基底上，并 且其中所述標(biāo)簽包括下述中的一種或多種：His-標(biāo)簽，生物素，F(xiàn)lag-表位，c-myc表位， HA-標(biāo)簽，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)，殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)，硫 氧還蛋白，β-半乳糖苷酶，VSV-糖蛋白，鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白，聚苯乙烯（PS)疏水性標(biāo)簽和 金屬未和標(biāo)簽。
43. 權(quán)利要求34的固體基底，其還包括第二熒光團(tuán)，所述第二熒光團(tuán)任選地連接到不 與膽紅素結(jié)合的蛋白上。
44. 權(quán)利要求34的固體基底，其中所述探針包含標(biāo)簽，并且所述固體基底包含針對(duì)所 述標(biāo)簽的受體。
45. 權(quán)利要求44的固體基底，其中所述標(biāo)簽是聚組氨酸標(biāo)簽，并且所述固體基底包括 固定的金屬螯合物。
46. 權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)的固體基底，其中所述熒光團(tuán)連接到半胱氨酸殘基上，并 且其中所述突光團(tuán)選自由下述組成的組：acrylodan,丹酰氮丙陡,4-[Ν_[(2-碘乙酰氧）乙 基]-N-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧雜-l，3-二唑酯（IANBDE)，4-[N-[(2-碘乙酰氧）乙 基]-Ν-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑（IANBDA)，德克薩斯紅C2-馬來(lái)酰亞胺， 螢光黃碘乙酰胺，Alexafluor 680馬來(lái)酰亞胺，Kodak X-Sight 670 LSS染料，德克薩斯紅 C2-馬來(lái)酰亞胺，德克薩斯紅C5-溴乙酰胺，Alexa Fluor 750 C5-馬來(lái)酰亞胺，和B0DIPY 577/618。
47. 權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)的固體基底，其中所述熒光團(tuán)連接到賴(lài)氨酸殘基上，并且 其中所述突光團(tuán)選自由下述組成的組：acrylodan，Alexa Fluor染料，Bodipy，突光素衍生 物，羅丹明衍生物，德克薩斯紅，Biotium CF750 SE，Kodak X-Sight 670 LSS染料，LiCor IRDye 680 LT，和 LiCor IRDye 700DX。
48. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其還包含與一個(gè)或多個(gè)用于與固體支持物連接的 接頭組合的在所述探針的C或N端的兩個(gè)以上的標(biāo)簽。
49. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的探針，其包含在位置25用LI-C0R700DX標(biāo)記的賴(lài)氨酸。
50. 權(quán)利要求49的探針，所述探針用兩個(gè)His-標(biāo)簽和兩個(gè)接頭連接到固體支持物上。
51. 權(quán)利要求1的探針，其還包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽，其中所述標(biāo)簽選自his-標(biāo)簽和 PS-標(biāo)簽。
52. 權(quán)利要求1的探針，其還包含至少一個(gè)接頭，其中所述接頭選自由下述組成的組： ACSGGG，SAGCGG，GGGCCG，GSGGCG，DTAGCG，⑶CGGG，GCSGAG，GGDGCG，SSNSCG，SDCAYG，DTNCGG， GSGCSG,GCGCGG,ANACGG,GGACGG,GNCGGG,CGGSCG,GSTSCG,DGGCSG,ATSCGG,ASCGYG,DGACGG, G,GGSGSGSGG,GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA, SRAWRHPQFGG, RAFIASRRIRRP, RLLLRRLRR, AAS, NDN, PSNTNHNSNSN, SHRATPNTSPH
53. 權(quán)利要求1的探針，其中所述固體支持物是聚苯乙烯或膠乳珠。
54. -種校準(zhǔn)用于確定Kd的膽紅素探針的方法，所述方法包括： 將所述探針與已知膽紅素濃度Bt的水性樣品混合， 測(cè)量熒光，和 通過(guò)用下述方程2或3擬合由所述測(cè)量的熒光確定校準(zhǔn)參數(shù)：
(2)
⑶， 其中Ιλ"是減去空白后所述樣品中所述探針的熒光強(qiáng)度，I。是不存在膽紅素時(shí)所述探 針的強(qiáng)度，Ρτ是總膽紅素探針濃度，Βτ是總膽紅素濃度，R是測(cè)量的熒光比率（Ιλ1/Ι λ2)，其 中Ιλ1是第一熒光團(tuán)在波長(zhǎng)λ 1的熒光強(qiáng)度，Ιλ2是第二熒光團(tuán)在波長(zhǎng)λ 2的熒光強(qiáng)度，R。 是不存在膽紅素時(shí)的比率，r是不存在第二熒光團(tuán)時(shí)所述探針的Ιλ2/Ιλ1比率，K d是解離常 數(shù)。
55. -種測(cè)量游離膽紅素的濃度[Bf]的方法，所述方法包括： 任選地，測(cè)量樣品的熒光， 將探針與樣品混合，并且 測(cè)量熒光，并且 任選地，從探針與樣品的熒光中減去所述樣品的熒光，并且 由所述測(cè)量的熒光確定[Bf]的濃度。
56. 權(quán)利要求55的方法，其中使用下述方程4-5中的至少一個(gè)來(lái)校準(zhǔn)所述探針和/或 測(cè)量[Bf]:
(4) (5， 其中，Ιλ?是減去空白后所述樣品中所述探針的熒光強(qiáng)度，I。是不存在膽紅素時(shí)所述探 針的強(qiáng)度，R是測(cè)量的熒光比率（(Ιλ1/?Λ2)，其中Ιλ1是第一熒光團(tuán)在波長(zhǎng)λ 1的熒光強(qiáng)度， Ιλ2是第二熒光團(tuán)在波長(zhǎng)λ 2的熒光強(qiáng)度，R。是不存在膽紅素時(shí)的比率，r是不存在第二熒 光團(tuán)時(shí)所述探針的?Λ2/Ιλ1比率，K d是解離常數(shù)，并且Is是膽紅素飽和時(shí)所述探針的發(fā)射 強(qiáng)度。
57. 權(quán)利要求55的方法，其中所述探針包含兩個(gè)熒光團(tuán)或包含一個(gè)熒光團(tuán)的探針與溶 液中游離的第二熒光團(tuán)或連接到不與膽紅素結(jié)合的蛋白上的第二熒光團(tuán)的組合。
58. 權(quán)利要求55的方法，其中所述探針包含單個(gè)熒光團(tuán)，并且所述方法還包括校正內(nèi) 濾激發(fā)。
59. 權(quán)利要求54-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品與選自由白蛋白、脂質(zhì)結(jié)合蛋白、 脂質(zhì)小泡和環(huán)糊精組成的組的用于膽紅素的載體大分子混合。
60. 權(quán)利要求54-59中任一項(xiàng)的方法，其中所述探針連接到固體支持物上。
61. 權(quán)利要求54-60中任一項(xiàng)的方法，其中使用一次性微流體裝置確定Bf濃度，所述一 次性微流體裝置任選地允許測(cè)量未稀釋的血液樣品。
62. 權(quán)利要求54-61中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品來(lái)自人、動(dòng)物或植物。
63. 權(quán)利要求54-62中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品選自由下述組成的組：全血、血漿、 血清、尿、CSF、唾液、胃液、間質(zhì)液和淋巴。
64. 權(quán)利要求54-63中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品來(lái)自接受油乳劑靜脈內(nèi)輸注的患 者。
65. 權(quán)利要求54-64中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品來(lái)自正在接受將膽紅素從白蛋白 上置換下來(lái)的藥物的患者，和/或所述患者由于輸注的油乳劑、疾病或應(yīng)激可正在產(chǎn)生將 膽紅素從白蛋白上置換下來(lái)的分子。
66. 權(quán)利要求54-65中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品來(lái)自正在進(jìn)行光療法、輸血或減少 膽紅素水平的其他治療的患者。
67. 用于測(cè)量接受油乳劑靜脈內(nèi)輸注的患者的血液樣品中非結(jié)合FFA濃度的方法，所 述方法包括下述步驟： 任選地，測(cè)量樣品的熒光， 將所述樣品與FFAu探針混合。 測(cè)量所述探針的熒光， 任選地，從所述樣品的熒光中減去所述探針與樣品的熒光，并且 計(jì)算FFAu濃度。
68. 權(quán)利要求67的方法，其還包括基于所述FFAu濃度確定對(duì)所述患者的損害并且提供 校正所述損害的治療。
69. -種試劑盒，其包括： 一個(gè)或多個(gè)用于收集來(lái)自患者的樣品的收集裝置， 一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的探針或權(quán)利要求15的組合物，所述組合物 包含在適當(dāng)?shù)妮d體中的一種或多種探針，和 任選地，包含已知濃度的非結(jié)合膽紅素的參比標(biāo)準(zhǔn)品。
70. 表2, 3,4, 5,6, 7,8和10中任一個(gè)中定義的探針。
71. 確定接受脂肪乳劑（Intralipid?)的患者中的非結(jié)合膽紅素和/或非結(jié)合FFA 毒性的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括： 獲得來(lái)自所述患者的樣品， 使所述樣品接觸一種或多種選自由下述組成的組的探針：ADIFAB2, L19CP10C7， L138P1H8N24C，L22P5E11，L61P8B12, L4BP4B9 和 L119P3E5,從而確定一種或多種 FFAu 的水 平， 確定非結(jié)合膽紅素的水平，并且 將FFAu和非結(jié)合膽紅素的水平與由正常群體獲得的水平相比較，從而確定毒性的風(fēng) 險(xiǎn)。
72. 包含含有iLBP的探針的固體基底，其中脂質(zhì)結(jié)合蛋白對(duì)應(yīng)于包含一個(gè)或多個(gè)氨基 酸置換和熒光團(tuán)的SEQ ID NO :3,其中所述熒光團(tuán)連接到賴(lài)氨酸殘基，iLBP的N端氨基基團(tuán) 或半胱氨酸置換上，并且其中所述探針與連接到所述固體基底上的脂肪酸結(jié)合，其中所述 固體基底優(yōu)選是聚苯乙烯或膠乳珠，Ni-瓊脂糖珠，任選地具有鐵核，微流體裝置或多孔板。
73. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針的N端MAFD被置換為MGIFD。
74. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針的N端MAFD被置換為MGCFD。
75. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針的N端MAFD被置換為MGGSATGIFD。
76. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針還包含下述置換：7R 20R 46R 100R 125R 和 130R(KR6)。
77. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針還包含下述置換：7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R 100R 125R 129R 和 130R(KR14)。
78. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針還包含至少一個(gè)接頭。
79. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針還包含選自下述的一個(gè)或多個(gè)接頭： ACSGGG，SAGCGG，GGGCCG，GSGGCG，DTAGCG，⑶CGGG，GCSGAG，GGDGCG，SSNSCG，SDCAYG，DTNCGG， GSGCSG,GCGCGG,ANACGG,GGACGG,GNCGGG,CGGSCG,GSTSCG,DGGCSG,ATSCGG,ASCGYG,DGACGG, GGSGSGSGG, GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA, SRAWRHPQFGG, RAFIASRRIRRP, RLLLRRLRR, RIIIRRIRR，AAS，NDN，PSNTNHNSNSN，SHRATPNTSPH 及其組合。
80. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針被加標(biāo)簽用于連接到所述固體基底上，并 且其中所述標(biāo)簽包含下述中的一種或多種：His-標(biāo)簽，生物素，F(xiàn)lag-表位，c-myc表位， HA-標(biāo)簽，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)，麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)，殼多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD)，硫 氧還蛋白，β-半乳糖苷酶，VSV-糖蛋白，鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白，聚苯乙烯（PS)疏水性標(biāo)簽和 金屬未和標(biāo)簽。
81. 權(quán)利要求72的固體基底，其還包括第二熒光團(tuán)，所述第二熒光團(tuán)任選地連接到不 與FFAu結(jié)合的蛋白上。
82. 權(quán)利要求72的固體基底，其中所述探針包含標(biāo)簽，并且所述固體基底包含針對(duì)所 述標(biāo)簽的受體。
83. 權(quán)利要求82的固體基底，其中所述標(biāo)簽是聚組氨酸標(biāo)簽，并且所述固體基底包括 固定的金屬螯合物。
【文檔編號(hào)】G01N33/533GK104220877SQ201280041789
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月26日
【發(fā)明者】阿蘭·馬克·克萊費(fèi)爾德, 安德魯·亨利·休伯, 詹姆斯·帕特里克·坎普夫, 托馬斯·科萬(wàn)朱寶龍 申請(qǐng)人:阿蘭·馬克·克萊費(fèi)爾德