基于微鏡掃描的微懸臂梁陣列生化傳感裝置及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種微懸臂梁陣列生化傳感的裝置，其包括反應(yīng)池、微梁陣列、半導(dǎo)體激光器、偏轉(zhuǎn)微鏡、信號發(fā)生器、光電位置敏感探測器(PSD)、和數(shù)據(jù)處理設(shè)備。本發(fā)明的裝置利用偏轉(zhuǎn)微鏡驅(qū)動，實(shí)現(xiàn)了單一匯聚激光束對微梁陣列的掃描探測，可以實(shí)現(xiàn)對微梁陣列上生化反應(yīng)信息的高靈敏度、快速、并行檢測，可應(yīng)用于食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)制造等領(lǐng)域中的監(jiān)控和檢測。本發(fā)明還公開了利用微懸臂梁陣列生化傳感裝置的生化檢測方法。
【專利說明】基于微鏡掃描的微懸臂梁陣列生化傳感裝置及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生化傳感【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種微懸臂梁陣列生化傳感裝置和方法，該裝置和方法可應(yīng)用于食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)制造等領(lǐng)域中的監(jiān)控和檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]基于表面應(yīng)力檢測的微懸臂梁(以后均稱微梁)生化傳感技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種新興傳感技術(shù)，其原理是:把探針(抗原或抗體)分子用直接或間接的方式固定(修飾)到微梁一側(cè)的鍍金層上，當(dāng)被檢測樣品液中的靶分子與微梁金表面上的探針分子發(fā)生特異性反應(yīng)時，會使微梁表面應(yīng)力改變，從而導(dǎo)致微梁彎曲變形，通過光學(xué)或電學(xué)方法檢測這種變形的過程，可得到生化反應(yīng)的實(shí)時信息。與傳統(tǒng)的免疫傳感方法相比，該方法無需使用任何酶標(biāo)、熒光物質(zhì)和放射性作為反應(yīng)示蹤劑，消除了標(biāo)記過程的影響，靈敏度高(比酶聯(lián)免疫試驗高數(shù)倍)，還可以通過監(jiān)測微梁變形來實(shí)時、定量的監(jiān)測抗原抗體的反應(yīng)過程，得到更豐富的免疫生化反應(yīng)的信息。經(jīng)過這些年的發(fā)展，微梁傳感被作為一種新興技術(shù)，在生物工程和環(huán)境污染監(jiān)測技術(shù)等方面與傳統(tǒng)的方法進(jìn)行對比研究，如RNA轉(zhuǎn)錄因子、酶、汞排放及揮發(fā)性化合物等，由于微懸臂梁的厚度尺寸僅為亞微米量級，對微梁表面生化反應(yīng)(比如，修飾的探針分子與靶分子結(jié)合)導(dǎo)致的應(yīng)力變化極為敏感，使其檢測極限達(dá)到納克甚至亞納克級每毫升，優(yōu)于常規(guī)的酶聯(lián)免疫方法。
[0003]在單微懸臂梁檢測系統(tǒng)基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步消除環(huán)境溫漂、溶液折射率變化等背景噪聲影響、實(shí)現(xiàn)多種靶標(biāo)分子的快速并行檢測，微梁傳感技術(shù)正逐步向多陣列發(fā)展。已報道實(shí)現(xiàn)微梁陣列傳感研究的方法主要有:(I)利用垂直共振腔面射型激光器提供時序陣列光源，對微梁陣列進(jìn)行逐一照射，再利用光電位置敏感探測器(PSD)對各微梁的偏轉(zhuǎn)信號進(jìn)行接收檢測；(2)利用擴(kuò)束后的面光源照射微梁陣列，用CCD記錄二維微梁陣列變形前后的圖像進(jìn)行微梁的變形檢測。但由于垂直共振腔面射型激光器發(fā)射光束的相鄰距離不能調(diào)節(jié)，它只能針對間距一定的微梁陣列進(jìn)行照射，靈活性較低且價格也很昂貴；CCD面光源檢測法中，由于微梁尖端的彎曲會使圖像產(chǎn)生彌散，嚴(yán)重影響光斑位移的檢測質(zhì)量，導(dǎo)致其檢測靈敏度不高，且多通道檢測時速度也較慢。
[0004]如何利用簡單光路設(shè)計出方便實(shí)用的傳感系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)微梁陣列高靈敏度、快速、并行的變形檢測，研制出微梁陣列免疫傳感裝置，并利用陣列免疫傳感器進(jìn)行抗體親和常數(shù)測定以及應(yīng)用于食品安全中多殘留和多種重金屬離子并行實(shí)時原位檢測，一直是生化檢測領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，做出了本發(fā)明。
[0006]本發(fā)明的原理是利用偏轉(zhuǎn)微鏡驅(qū)使半導(dǎo)體激光器發(fā)射出來的激光束產(chǎn)生周期性偏轉(zhuǎn)，以掃描微梁陣列；再通過光杠桿原理將微梁陣列中各微梁的彎曲變形信號放大，用光電位置敏感探測器(PSD)時序接收檢測，從而實(shí)時監(jiān)測各微梁上的生化反應(yīng)過程信息。
[0007]因此,在第一個方面,本發(fā)明提供了一種基于微鏡掃描的微懸臂梁陣列生化傳感裝置(下面有時簡稱為“本發(fā)明的裝置”)，該裝置包括
[0008]反應(yīng)池，所述反應(yīng)池用于容納緩沖液和待測樣品；
[0009]微梁陣列，所述微梁陣列由兩個以上平行間隔排列的微梁組成并被可拆卸地固定在密閉的反應(yīng)池中，其中所述每個微梁上固定有檢測生物分子或?qū)φ辗肿?在本發(fā)明中也稱為“參考分子”，固定或修飾有參考分子的微梁也稱為“參考梁”);
[0010]半導(dǎo)體激光器；
[0011]偏轉(zhuǎn)微鏡,所述偏轉(zhuǎn)微鏡被設(shè)置成改變由所述半導(dǎo)體激光器發(fā)射的激光束的光路，使所述激光束掃射到所述每個微梁上；
[0012]信號發(fā)生器，所述信號發(fā)生器控制所述偏轉(zhuǎn)微鏡的輸入電壓大小和變化周期；
[0013]光電位置敏感探測器(PSD)，所述光電位置敏感探測器接收由所述微梁陣列反射的激光光點(diǎn)，從而產(chǎn)生并輸出關(guān)于每個微梁的位移信號；和
[0014]數(shù)據(jù)處理設(shè)備，所述數(shù)據(jù)處理設(shè)備處理由所述光電位置敏感探測器輸出的每個微梁的位移信號，基于固定有對照分子的微梁的位移數(shù)據(jù)關(guān)于獲得固定有檢測生物分子的每個微梁彎曲的數(shù)據(jù)，
[0015]其中當(dāng)待測樣品中含有與所述檢測生物分子特異性結(jié)合的靶分子時，固定有所述檢測生物分子的微梁與所述待測樣品在反應(yīng)池中在適于兩者的反應(yīng)條件下反應(yīng)后會發(fā)生彎曲。
[0016]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的裝置還可以包括設(shè)置與所述反應(yīng)池可操作連接的加熱片和與所述加熱片電連接的溫控器，所述溫控器控制加熱片的溫度以調(diào)節(jié)所述反應(yīng)池中的溫度從而適于所述檢測生物分子和所述靶分子在所述反應(yīng)池中發(fā)生反應(yīng)。所述反應(yīng)可以是受體配體結(jié)合作用、抗原抗體反應(yīng)或分子締合反應(yīng)中的任一種。
[0017]在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述裝置還可以包括模擬/數(shù)字信號轉(zhuǎn)換器，所述模擬/數(shù)字信號轉(zhuǎn)換器將所述關(guān)于每個微梁的位移信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，所述數(shù)字信號輸出至所述數(shù)據(jù)處理裝置進(jìn)行處理，以獲得所述微梁彎曲數(shù)據(jù)。
[0018]在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述信號發(fā)生器可以通過控制所述偏轉(zhuǎn)微鏡的電壓大小和變化周期，使得所述偏轉(zhuǎn)微鏡以相應(yīng)的步進(jìn)量偏轉(zhuǎn)激光束的光路從而改變所述激光束掃描各個微梁的時序，從而定位所述激光束使其適于掃描以不同間距間隔的每個微梁。
[0019]在第二個方面，本發(fā)明提供了一種使用本發(fā)明的裝置檢測待測樣品中的靶分子的方法(下面有時簡稱為“本發(fā)明的方法”)，所述方法包括以下步驟:
[0020](I)將與能夠所述靶分子特異性結(jié)合的檢測生物分子和對照分子分別固定至微梁陣列中的不同微梁上，每個微梁上固定一種分子；
[0021](2)將步驟(I)中獲得的微梁相間隔地平行固定在反應(yīng)池中，并在反應(yīng)池中注入緩沖液，并使緩沖液在反應(yīng)池中流動；
[0022](3)啟動半導(dǎo)體激光器發(fā)射激光束；
[0023](4)通過信號發(fā)生器控制偏轉(zhuǎn)微鏡，使其偏轉(zhuǎn)由所述半導(dǎo)體激光器發(fā)射的激光束的光路，以定位激光束使其掃描所述微梁陣列中的每個微梁；
[0024](5)向反應(yīng)池中加入待測樣品；[0025](6)通過光電位置敏感探測器接收由所述微梁陣列反射的激光光點(diǎn)，從而產(chǎn)生并輸出關(guān)于每個微梁的位移信號；
[0026](7)所述數(shù)據(jù)處理設(shè)備接收并處理由所述光電位置敏感探測器輸出的每個微梁的位移信號，基于固定有對照分子的微梁的位移數(shù)據(jù)關(guān)于獲得固定有檢測生物分子的每個微梁彎曲(當(dāng)待測樣品中含有與所述檢測生物分子特異性結(jié)合的靶分子時，固定有所述檢測生物分子的微梁與所述待測樣品在反應(yīng)池中在適于兩者的反應(yīng)條件下反應(yīng)后會發(fā)生彎曲)的數(shù)據(jù)；
[0027](8)根據(jù)預(yù)設(shè)的彎曲量閾值判斷所述待測樣品中是否包含所述靶分子。
[0028]在本發(fā)明的方法中，可以通過操作溫控器控制加熱片的溫度以調(diào)節(jié)所述反應(yīng)池中的溫度從而適于所述檢測生物分子和所述靶分子在所述反應(yīng)池中發(fā)生反應(yīng)。所述反應(yīng)可以是受體配體結(jié)合作用、抗原抗體反應(yīng)或分子締合反應(yīng)中的任一種。
[0029]在本發(fā)明的方法的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述信號發(fā)生器可以按照使用者的設(shè)定控制偏轉(zhuǎn)微鏡的輸入電壓和變化周期，從而控制所述偏轉(zhuǎn)微鏡按照預(yù)設(shè)的與設(shè)定的輸入電壓和變化周期對應(yīng)的步進(jìn)量偏轉(zhuǎn)由所述半導(dǎo)體激光器發(fā)射的激光束的光路從而改變所述激光束掃描各個微梁的時序，以定位所述激光束使其適于掃描以不同間距間隔的每個微
梁
[0030]在本發(fā)明中，所述對照分子包括至少一種陽性對照分子或至少一種空白對照分子，或至少一種陽性對照 分子和至少一種空白分子的組合。
[0031]在本發(fā)明中，所述靶分子可以是受體或配體，所述檢測生物分子為能與所述受體或配體特異性結(jié)合的配體或受體。所述靶分子還可以是抗原分子，所述檢測生物分子為所述抗原分子的特異性抗體或抗體片段，所述特異性抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
[0032]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體片段可以是抗體的Fab、Fab’片段或F(ab，)2 片段。
[0033]在具體實(shí)施本發(fā)明的裝置和方法時，在實(shí)踐中，一般當(dāng)微懸臂梁的彎曲位移量達(dá)到IOnm及以上時，就可以判定檢測結(jié)果呈陽性。
[0034]本發(fā)明的有益效果
[0035]本發(fā)明利用偏轉(zhuǎn)微鏡驅(qū)動，實(shí)現(xiàn)了單一匯聚激光束對微梁陣列的掃描探測，可以實(shí)現(xiàn)對微梁陣列上生化反應(yīng)信息的高靈敏度、快速、并行檢測。
[0036]本發(fā)明相對于現(xiàn)有的微梁陣列生化傳感方法和裝置，其優(yōu)點(diǎn)有:
[0037](I)探測光路結(jié)構(gòu)簡單，容易實(shí)現(xiàn)；
[0038](2)掃描驅(qū)動部件使用的是一個小微鏡，激光束發(fā)射裝置只需一個小半導(dǎo)體激光器，成本較低；
[0039](3)掃描步進(jìn)量可以任意調(diào)節(jié)，對各種間距的微梁陣列都能方便快捷的進(jìn)行定位探測；
[0040](4)使用同一激光器掃描，保證了微梁陣列各根微梁上照射光源的一致性；
[0041](5)利用這種方法集成的微梁陣列生化傳感器體積小重量輕，移動方便。
【專利附圖】

【附圖說明】[0042]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0043]圖1是基于微鏡掃描的微梁陣列生化傳感裝置的整體設(shè)計示意圖。
[0044]圖2是偏轉(zhuǎn)微鏡驅(qū)使激光束掃描微梁陣列的原理圖。
[0045]圖3是實(shí)驗用微梁陣列的照片。
[0046]圖4是微梁陣列基底上間隔250μπι兩點(diǎn)處的掃描位移曲線圖，其中:(a)X方向和(b) Y方向。
[0047]圖5是兩個微梁上的光點(diǎn)掃描信號的示意圖。
[0048]圖6是在溫度激勵下兩個微梁的位移曲線圖。
[0049]圖7是利用毛細(xì)管修飾CLEN抗體到微梁陣列上的照片。
[0050]圖8顯示利用微梁陣列檢測CLEN抗原抗體的特異性結(jié)合。
[0051]圖9是生化反應(yīng)池結(jié)構(gòu)的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0052]定義
[0053]檢測生物分子:在本發(fā)明中，檢測生物分子是指能夠與在待測樣品中可能存在的被研究的目標(biāo)分子特異性結(jié)合的生物分子。該檢測生物分子包括但不限于抗原、抗體、受體或配體等，其類型可以是蛋白質(zhì)、核酸或糖類等生物大分子。
[0054]靶分子:在本發(fā)明中，靶分子即被研究的目標(biāo)分子，其是能夠與檢測生物分子特異性結(jié)合的生物分子，其包括但不限于抗原、抗體、受體或配體等，其類型可以是蛋白質(zhì)、核酸或糖類等生物大分子。
[0055]抗體:抗體(antibody)指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。
[0056]半抗體片段:通過二硫鍵還原劑將全抗體拆分成各自帶有巰基的對稱的片段，每個半抗體片段包含一條完整的輕鏈和一條完整重鏈以及Fe片段。
[0057]F(ab’)2:1g (immunoglobulin,免疫球蛋白)被胃蛋白酶水解在鉸鏈區(qū)重鏈間二硫鍵近C處切斷，形成一個雙價抗原結(jié)合片段簡稱F(ab’)2片段和一些小片段pFc'。由于F(ab’)2片段保留了結(jié)合相應(yīng)抗原的生物學(xué)活性，又避免了 Fe片段的抗原性可能引起的副作用，因而被廣泛用作生物制品。如白喉抗霉素和破傷風(fēng)抗霉素，經(jīng)胃蛋白酶水解后，因去掉了 Fe片段的抗原性而減少了超敏反應(yīng)的發(fā)生。pFc'片段最終被降解，無生物學(xué)活性。
[0058]Fab (fragment of antigen binding):木瓜蛋白酶使Ig在鉸鏈區(qū)重鏈間二硫鍵近N端處切斷，形成兩個相同的單價抗原結(jié)合片段簡稱Fab段(如圖1中所示)，一個可結(jié)晶的片段簡稱 Fe (fragment crystallizable)段。
[0059]Fab’:是帶巰基的單價抗原結(jié)合片段(F(ab’)2被二硫鍵還原劑拆分的各自帶有疏基的片段)。
[0060]抗原結(jié)合位點(diǎn):抗體分子與抗原相結(jié)合的部位，由Ig輕、重鏈的⑶R1、⑶R2和CDR3組成。
[0061]抗原:是一類能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物(抗體或效應(yīng)細(xì)胞)發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖哂忻庖咴院头磻?yīng)原性兩種性質(zhì)。根據(jù)抗原性質(zhì)分為兩類:完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)是一類既有免疫原性，又有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒、細(xì)菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原，即半抗原(hapten)是只具有免疫反應(yīng)性，而無免疫原性的物質(zhì)，故又稱不完全抗原。
[0062]巰基化試劑:具有巰基的能連接抗體與金的雙功能交聯(lián)試劑。
[0063]二硫鍵還原劑:二硫鍵又稱S-S鍵，是2個SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的鍵。在巰基乙胺(2-MEA)、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等的硫化合物存在下能與之發(fā)生作用，還原成巰基(-SH)。這些硫化物就是本發(fā)明中所說的二硫鍵還原劑。在微量的二硫鍵還原劑存在的情況下抗體的重鏈間的二硫鍵被還原而其它的二硫鍵不被破壞。
[0064]微懸臂梁(微梁):典型的微懸臂梁由氮化硅制成，如商品化的三角形微懸臂梁(Veeco Instruments)(尺寸:長200um,腿寬20um,厚0.6um)，單側(cè)鍍有60nm的金；抗體通常通過巰基化試劑的巰基(-SH)與金的共價結(jié)合以及巰基化試劑的另外一端(含有-COOH或-NH2等活性基團(tuán))與抗體結(jié)合來固定到微梁表面。
[0065]基于表面應(yīng)力檢測的微懸臂梁傳感系統(tǒng):微懸臂梁傳感系統(tǒng)主要由激光器、微懸臂梁、光電位置敏感器(PSD)、溫度控制系統(tǒng)、蠕動泵、以及數(shù)據(jù)分析處理裝置組成。典型的微懸臂梁免疫檢測方法的步驟如下:將微懸臂梁固定到反應(yīng)池中，以蠕動泵控制流動緩沖液通過反應(yīng)池，待反應(yīng)池中氣泡排凈后以0.lmL/min的速度流動緩沖液通過反應(yīng)池。反應(yīng)池的溫度控制在37 ± 0.0I °C，室溫控制在27±0.01°C。激光器發(fā)出一束激光照射在微懸臂梁的尖端，經(jīng)微懸臂梁反射后照在PSD的靶面上。當(dāng)微懸臂梁的位移信號穩(wěn)定后，加入緩沖液稀釋的樣品溶液，PSD實(shí)時記錄微懸臂梁的尖端位移。
[0066]時序接收:激光器發(fā)出的激光束經(jīng)偏轉(zhuǎn)微鏡反射后，順序射向微懸臂梁陣列上的
1、2......η號微懸臂梁，1、2......η號微懸臂梁再依次將照射來的激光束反射向PSD靶
面，由PSD記錄各激光點(diǎn)位置。
[0067]步進(jìn)量:偏轉(zhuǎn)微鏡每次轉(zhuǎn)動時轉(zhuǎn)過的最小角度。
[0068]具體實(shí)施方案
[0069]在本發(fā)明的裝置和方法中，利用的生化反應(yīng)可以是受體配體結(jié)合作用、抗原抗體反應(yīng)或分子締合反應(yīng)中的任一種，優(yōu)選本領(lǐng)域中常用的抗原抗體反應(yīng)。
[0070]當(dāng)采用抗原抗體反應(yīng)時，采用的抗體是與檢測生物分子特異性結(jié)合的抗體，可以是多克隆抗體或單克隆抗體，其可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法制備，包括但不限于免疫法、雜交瘤法、化學(xué)合成法、基因工程法等。所述抗體還可以是基因工程修飾的雜合抗體，諸如人源化抗體，駱駝源化抗體等針對某種哺乳動物改造的抗體，例如人-鼠雜合抗體等。
[0071]本發(fā)明中所提及的抗原包括但不限于完全抗原和半抗原，其可以是本領(lǐng)域中所知曉的任何類型的抗原。
[0072]本發(fā)明中提到的待測樣品可以是生物樣品，例如來自于哺乳動物尤其是人的樣品，包括組織樣品(如病理組織切片、活檢、毛發(fā)、拭子等)、細(xì)胞樣品(如細(xì)胞涂片、血液涂片等)、體液樣品(如血液、尿液、腦脊液、唾液等)、排泄物(例如嘔吐物、汗液、糞便等)。所述待測樣品還可以是環(huán)境樣品，諸如土壤樣品、水樣、浮塵等；其他生產(chǎn)領(lǐng)域中獲得的樣品，諸如污水樣品、食品樣品等。
[0073]在本發(fā)明中使用的微梁可以根據(jù)本領(lǐng)域中的公知方法自行制備，也可以購買市售商品，對此在本發(fā)明中并無任何限制。
[0074]作為在微梁上修飾或固定檢測生物分子的方法，在本發(fā)明中對此沒有任何限制，可以采用本領(lǐng)域中任何已知的方法。
[0075]當(dāng)使用抗體或抗體片段作為檢測生物分子時，優(yōu)選使用抗體片段，所述抗體片段可以是抗體的Fab、Fab’片段或F(ab’)2片段。
[0076]作為在微梁上修飾抗體或抗體片段的方法的實(shí)例，可以先利用巰基化試劑自帶的巰基自組裝至微懸臂梁的鍍金表面上，然后將抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)ab、Fab’片段)與巰基化試劑結(jié)合；可以先將抗體或抗體片段(例如，F(xiàn)ab、Fab’片段)與巰基化試劑聯(lián)結(jié)在一起，然后利用巰基化試劑自帶的巰基自組裝至微梁的鍍金表面上；還可以用二硫鍵還原劑將抗體裂解成兩個半抗原片段，然后利用半抗原片段自身的巰基自組裝至鍍金表面上；也可以先用胃蛋白酶將抗體水解成F(ab’)2片段，然后用二硫鍵還原劑將F(ab’)2片段還原成兩個Fab’片段，再利用每個Fab’片段的巰基自組裝至微梁的鍍金表面上。
[0077]本發(fā)明中使用的二硫鍵還原劑的實(shí)例包括巰基乙胺(2-MEA)、2_巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。使用二硫鍵還原劑還原二硫鍵從而拆分抗體的方法和條件是本領(lǐng)域中公知的，例如，可以根據(jù)靶抗原的類型、大小和性質(zhì)等，遵照本領(lǐng)域中的已知方法或市售的相關(guān)試劑盒的說明書來選擇具體的二硫鍵還原劑和濃度、抗體濃度，兩者的用量和質(zhì)量比，溫育條件和溫育時間等。
[0078]在本發(fā)明中使用的巰基化試劑不受限制，只要其可以與抗體的Fab片段聯(lián)結(jié)，并且可以被固定在微梁的鍍金層上。
[0079]本發(fā)明中使用的巰基化試劑包含巰基官能團(tuán)和羧基或氨基官能團(tuán)，其中該試劑一端的巰基用于通過自組裝固定在金表面上，另一端的羧基或氨基(也可以通過活化被暴露)用于與抗體的氨基或羧基末端發(fā)生反應(yīng)。本發(fā)明可用的巰基化試劑包括硫醇類化合物，例如11-羧酸硫醇，2-氨基乙硫醇(AET)和3-巰基丙酸(MPA);鹽酸硫醇亞胺；磺基烴基琥珀酰亞胺基-6-(3’ 2-吡啶二硫-丙酰胺)_乙酸酯(Sulf0-LC-SroP);和3，3’ - 二硫雙磺基琥珀酰亞胺丙酸酯(DTSSP)等。
[0080]下面結(jié)合附圖詳細(xì)地說明本發(fā)明。
[0081]圖1中圖示了基于微鏡掃描的微梁陣列生化傳感裝置的整體設(shè)計示意圖。在圖1中，半導(dǎo)體激光器(直徑8mm，長40mm，匯聚激光點(diǎn)焦距可調(diào))發(fā)出激光束，經(jīng)過偏轉(zhuǎn)微鏡改變光路后掃射到固定在密閉生化反應(yīng)池(容積0.5ml)中的微梁上(反應(yīng)池上方是玻璃片)，池中環(huán)境溫度由溫控器通過加熱片控制。接著再用光電位置敏感探測器(PSD)接收由微梁陣列反射的激光光點(diǎn)位置信號，任選地通過A/D轉(zhuǎn)換后輸入計算機(jī)，就可以實(shí)現(xiàn)對微梁陣列彎曲信號的檢測，從而得到微梁陣列中各梁上的對應(yīng)生化反應(yīng)信息。
[0082]圖2是偏轉(zhuǎn)微鏡驅(qū)使激光束掃描微梁陣列原理圖。在圖2中，偏轉(zhuǎn)微鏡的構(gòu)造和配置為:鏡面長4mm、寬2mm,最大輸入電壓10V,最大偏轉(zhuǎn)角度5°。其原理如下:通過信號發(fā)生器控制輸入偏轉(zhuǎn)微鏡的電壓大小和變化周期，使微鏡按設(shè)定步進(jìn)量偏轉(zhuǎn)激光束時序、定位掃描微梁陣列中的每個微梁(微梁長200-1000 μ m，寬90-100 μ m，厚I μ m，表面鍍有
0.02μπι厚的金層，兩微梁之間的中心間距為250μπι)，再用光電位置敏感探測器(PSD)時序接收由微梁陣列反射的激光光點(diǎn)位置信號，實(shí)現(xiàn)對微梁陣列彎曲信號的檢測。
[0083]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明在微梁陣列傳感探測方面做進(jìn)一步說明，但不意在限制本發(fā)明。
[0084]實(shí)施例[0085]實(shí)施例1、基于微鏡掃描的微梁陣列傳感方法對溫度變化的測量
[0086]1.將一商品化微梁陣列(德國micromotive公司，如圖3所示，其中微梁長500 μ m，寬90 μ m，厚I μ m，表面鍍有(λ 02 μ m厚的金層，兩微梁之間的中心間距為250 μ m)固定到系統(tǒng)(包括激光器、偏轉(zhuǎn)微鏡、生化反應(yīng)池、溫控器、PSD、A/D轉(zhuǎn)換器、計算機(jī)，如圖1所示)中的生化反應(yīng)池里。
[0087]2.半導(dǎo)體激光器發(fā)出的匯聚激光束經(jīng)偏轉(zhuǎn)微鏡變向后周期性掃射微梁陣列基底上間距250 μ m的兩定點(diǎn)9小時，掃描位移曲線圖如圖4所示:在X方向和Y方向上，兩掃描位點(diǎn)都保持平行一致，沒有出現(xiàn)較大偏移，說明系統(tǒng)掃描光路穩(wěn)定。
[0088]3.調(diào)節(jié)激光束掃描位點(diǎn)，準(zhǔn)確定位微梁1、2尖端，周期性切換并采集位移信號，示意圖如圖5所示；在兩根梁位移信號穩(wěn)定后，用高精度溫控器(精度0.01°C)將微梁陣列的溫度從21°C逐步升至29°C，所得對應(yīng)數(shù)據(jù)曲線如圖6所示。從圖6中可以看出在升溫8°C后，兩根微梁的位移響應(yīng)信號相差了 2111!11左右，誤差3.6(% (相差量21nm除以總的變形量580nm)，在同一溫度變化激勵下基本保持一致。由于微梁傳感技術(shù)對生化反應(yīng)的檢測主要是針對分子間的特異性結(jié)合，因此只要能準(zhǔn)確的測出這種特有的反應(yīng)信息，PSD靶面上接收到的微梁彎曲信號誤差在10%左右是不影響檢測結(jié)果的。[0089]實(shí)施例2、基于微鏡掃描的微梁陣列生化傳感方法對瘦肉精的檢測
[0090]1.實(shí)驗裝置和試劑
[0091]檢測系統(tǒng)的具體結(jié)構(gòu)如圖1中所示，主要包括激光器(參數(shù):直徑8mm，長20mm，發(fā)出激光的波長為650nm，激光焦點(diǎn)光斑直徑為200 μ m)、偏轉(zhuǎn)微鏡(參數(shù):驅(qū)動電壓40V~50V，驅(qū)動頻率3KHz，掃描角度范圍10° )、生化反應(yīng)池(容積0.5mL，全密封，由內(nèi)直徑Imm進(jìn)樣口、內(nèi)直徑Imm出樣口、玻璃片、微梁固定臺組成，圖9)、溫控器(控溫精度0.01°C，溫控范圍(TC~100°C )、PSD (位移分辨率Ιμπι，靶面尺寸12mmX 12mm)、A/D轉(zhuǎn)換器(12位)、計算機(jī)。
[0092]瘦肉精抗體、瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)樣品CLEN、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品CAP(以上3種樣品均取自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院)；活化劑:1_乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)；硫醇HS-CH2-COOH (以上3種藥品均購置于SIGMA公司)；PBS(4.0g NaCl+0.1g KH2PO4+1.48g Na2HPO4 *H20+500ml 去離子水)；TPBS(PBS+0.5%Tween-20) ;98%濃硫酸；30%雙氧水，上述試劑均為分析純。
[0093]2.微梁陣列上抗體的修飾
[0094]清洗微梁陣列，浸入比例為1: 3的H2O2和H2SO4混合溶液中IOmin (室溫)，取出用去離子水沖洗，放入孔板中，加入200 μ L的0.lmol/L硫醇后封口靜置20h (室溫)，利用硫醇自帶的巰基(-HS)自組裝到微梁陣列一側(cè)的鍍金表面上。反應(yīng)完成后，取出微梁陣列用乙醇沖洗,再用去離子水沖洗,放入新孔板中，注入100 μ L的0.2mol/L EDC和100 μ L的
0.05mol/LNHS靜置1.5h，活化微梁陣列上硫醇的羧基。隨后將微梁陣列取出用去離子水沖洗，再放到毛細(xì)管陣列套合修飾平臺上，對I號微梁進(jìn)行瘦肉精抗體修飾，過程如圖7所示。2號微梁為參考梁，上面不修飾任何抗體，用于檢測溫度、溶液折射率變化等環(huán)境因素引起的信號偏轉(zhuǎn)。在本實(shí)施例中，毛細(xì)管內(nèi)徑設(shè)計為200~230 μ m,外徑為300~330 μ m, 一端套合在微梁上，另一端插入裝有瘦肉精抗體溶液的孔板中，靜置2h。然后取出微梁陣列用TPBS沖洗，再固定在生化反應(yīng)池中，流動PBS緩沖液，調(diào)試光路進(jìn)行實(shí)驗。[0095]3.具體實(shí)驗過程
[0096]激光器發(fā)出的激光束射向偏轉(zhuǎn)微鏡，偏轉(zhuǎn)微鏡被頻率3KHz、電壓值40V?50V (電壓變化周期1S，分1000步完成)的激勵信號驅(qū)動偏轉(zhuǎn)，經(jīng)偏轉(zhuǎn)微鏡反射后的激光束周期性掃描微梁陣列。調(diào)節(jié)生化反應(yīng)池位置使激光束掃描在微梁陣列中微梁I和微梁2的尖端，再調(diào)節(jié)PSD位置使從微梁I和2反射來的激光束打在PSD靶面中央，便于信號的接收采集。調(diào)試好光路后，米集輸入電壓信號和對應(yīng)PSD祀面光強(qiáng)信號一分鐘,統(tǒng)計出掃描過程中光強(qiáng)信號最強(qiáng)時(說明激光束掃描到了微梁I和微梁2上并被反射到了 PSD靶面上引起了響應(yīng))的兩個輸入電壓值，于是周期性輸入這個兩個電壓值時，偏轉(zhuǎn)微鏡就驅(qū)使激光束掃描微梁I和微梁2，實(shí)現(xiàn)周期性定位掃描。觀察計算機(jī)上輸出的微梁I和微梁2的位移信號曲線，待兩條曲線都平穩(wěn)后從進(jìn)樣口輸入CAP標(biāo)樣溶液，等待一段時間，待微梁I和微梁2的位移信號曲線都平穩(wěn)后，再從進(jìn)樣口輸入CLEN標(biāo)樣溶液，等一段時間微梁I和微梁2的位移信號曲線都平穩(wěn)后實(shí)驗完成，停止數(shù)據(jù)采集。
[0097]4.微梁陣列檢測結(jié)果
[0098]微梁陣列對CLEN抗原抗體特異性反應(yīng)的檢測結(jié)果如圖8所示，圖8中先加入500ng/mL的CAP標(biāo)樣后，兩梁響應(yīng)量一致，且幅度較小，說明:(I)此響應(yīng)信號可能是由環(huán)境擾動(溫漂、溶液折射率及酸堿度變化等)引起；(2)梁I上修飾的瘦肉精抗體和CAP標(biāo)樣不發(fā)生反應(yīng)。待信號平穩(wěn)后，再加入10ng/mL的CLEN標(biāo)樣，此時修飾有CLEN抗體的梁I響應(yīng)信號明顯大于未修飾CLEN抗體的梁2響應(yīng)信號，說明:(I)梁I上發(fā)生了 CLEN抗原抗體的特異性反應(yīng)導(dǎo)致了梁上表面應(yīng)力的變化；(2)梁2的響應(yīng)信號幅度較小，可能是由環(huán)境擾動引起。最后，將梁I響應(yīng)信號減去梁2 (參考梁)響應(yīng)信號，即可得到僅由CLEN抗原抗體特異性結(jié)合產(chǎn)生的真實(shí)微梁變形信號(34nm)。
【權(quán)利要求】
1.一種微梁陣列傳感裝置，包括 反應(yīng)池，所述反應(yīng)池用于容納緩沖液和待測樣品； 微梁陣列，所述微梁陣列由兩個以上平行間隔排列的微梁組成并被可拆卸地固定在密閉的反應(yīng)池中，其中所述每個微梁上固定有檢測生物分子或?qū)φ辗肿樱? 半導(dǎo)體激光器； 偏轉(zhuǎn)微鏡，所述偏轉(zhuǎn)微鏡被設(shè)置成改變由所述半導(dǎo)體激光器發(fā)射的激光束的光路，使所述激光束掃射到所述每個微梁上； 信號發(fā)生器，所述信號發(fā)生器控制所述偏轉(zhuǎn)微鏡的輸入電壓大小和變化周期； 光電位置敏感探測器(PSD)，所述光電位置敏感探測器接收由所述微梁陣列反射的激光光點(diǎn)，從而產(chǎn)生并輸出關(guān)于每個微梁的位移信號；和 數(shù)據(jù)處理設(shè)備，所述數(shù)據(jù)處理設(shè)備處理由所述光電位置敏感探測器輸出的每個微梁的位移信號，基于固定有對照分子的微梁的位移數(shù)據(jù)以獲得固定有檢測生物分子的每個微梁彎曲的數(shù)據(jù)， 其中當(dāng)待測樣品中含有與所述檢測生物分子特異性結(jié)合的靶分子時，固定有所述檢測生物分子的微梁與所述待測樣品在反應(yīng)池中在適于兩者的反應(yīng)條件下反應(yīng)后會發(fā)生彎曲。
2.權(quán)利要求1所述的裝置，所述裝置還包括設(shè)置與所述反應(yīng)池可操作連接的加熱片和與所述加熱片電連接的溫控器，所述溫控器控制加熱片的溫度以調(diào)節(jié)所述反應(yīng)池中的溫度從而適于所述檢測生物分子和所述靶分子在所述反應(yīng)池中發(fā)生反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1或2所述的裝置，其特征在于所述反應(yīng)為受體配體結(jié)合作用、抗原抗體反應(yīng)或分子締合反應(yīng)。`
4.權(quán)利要求1-3中任一項所述的裝置，所述裝置還包括模擬/數(shù)字信號轉(zhuǎn)換器，所述模擬/數(shù)字信號轉(zhuǎn)換器將所述關(guān)于每個微梁的位移信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，所述數(shù)字信號輸出至所述數(shù)據(jù)處理裝置進(jìn)行處理，以獲得所述微梁彎曲數(shù)據(jù)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項所述的裝置，其特征在于所述對照分子包括至少一種陽性對照分子。
6.權(quán)利要求1-5中任一項所述的裝置，其特征在于所述對照分子包括至少一種空白對照分子。
7.權(quán)利要求1-6中任一項所述的裝置，其特征在于所述信號發(fā)生器通過控制所述偏轉(zhuǎn)微鏡的電壓大小和變化周期，使得所述偏轉(zhuǎn)微鏡以相應(yīng)的步進(jìn)量偏轉(zhuǎn)激光束的光路從而改變所述激光束掃描各個微梁的時序，從而定位所述激光束使其適于掃描以不同間距間隔的每個微梁。
8.權(quán)利要求1-7中任一項所述的裝置，其特征在于所述靶分子為抗原，所述檢測生物分子為所述抗原的特異性抗體或抗體片段，所述特異性抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
9.權(quán)利要求8所述的裝置，其特征在于所述抗體片段是抗體的Fab、Fab’片段或F(ab，)2 片段。
10.一種使用微梁陣列傳感裝置檢測待測樣品中的靶分子的方法，所述方法包括以下步驟: (I)將與能夠所述靶分子特異性結(jié)合的檢測生物分子和對照分子分別固定至微梁陣列中的不同微梁上，每個微梁上固定一種分子； (2)將步驟(1)中獲得的微梁相間隔地平行固定在反應(yīng)池中，并在反應(yīng)池中注入緩沖液，并使緩沖液在反應(yīng)池中流動； (3)啟動半導(dǎo)體激光器發(fā)射激光束； (4)通過信號發(fā)生器控制偏轉(zhuǎn)微鏡，使其偏轉(zhuǎn)由所述半導(dǎo)體激光器發(fā)射的激光束的光路，以定位激光束使其掃描所述微梁陣列中的每個微梁； (5)向反應(yīng)池中加入待測樣品； (6)通過光電位置敏感探測器接收由所述微梁陣列反射的激光光點(diǎn)，從而產(chǎn)生并輸出關(guān)于每個微梁的位移信號； (7)所述數(shù)據(jù)處理設(shè)備接收并處理由所述光電位置敏感探測器輸出的每個微梁的位移信號，基于固定有對照分子的微梁的位移數(shù)據(jù)關(guān)于獲得固定有檢測生物分子的每個微梁彎曲的數(shù)據(jù)， (8)根據(jù)預(yù)設(shè) 的彎曲量閾值判斷所述待測樣品中是否包含所述靶分子。
【文檔編號】G01B11/16GK103868889SQ201210551559
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月18日
【發(fā)明者】張青川, 鄔林, 程騰 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)