專利名稱：一種用于多組分中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物組分分析的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及用于評(píng)價(jià)中藥多組分藥物代謝動(dòng)力學(xué)的分析方法。更具體地說(shuō)，是測(cè)定生物樣品中中藥各組分含量的液相色譜-質(zhì)譜LC/ MS/MS分析方法。
背景技術(shù)：
藥物代謝動(dòng)力學(xué)是定量研究藥物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律依據(jù)測(cè)得的生物樣品中藥物濃度，運(yùn)用數(shù)學(xué)原理和方法闡述血藥濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律的一門(mén)學(xué)科。中藥復(fù)方具有多味、多成分、多劑型的特點(diǎn)，存在復(fù)雜環(huán)境下及病癥模型條件下的多因素相互作用。因中藥化學(xué)成分眾多，很難購(gòu)買(mǎi)到所有標(biāo)準(zhǔn)品。中藥藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià)目前是按化學(xué)藥物研究方法，測(cè)定多種組分中的一種或幾種，這顯然無(wú)法揭示多組分中藥藥物代謝動(dòng)力學(xué)規(guī)律。由于中藥成分復(fù)雜，即使一味中藥也含有十幾類數(shù)百種化學(xué)成分，因此以往僅以有限幾種成分的藥物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果來(lái)代表某味中藥或某一復(fù)方藥物的藥代動(dòng)力特征是不準(zhǔn)確的。因此需要建立全新的可整體評(píng)價(jià)中藥藥動(dòng)學(xué)的分析方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，建立一種新的中藥藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)方法，以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的依賴于有限標(biāo)準(zhǔn)品的評(píng)價(jià)方法，使其達(dá)到在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，也可對(duì)生物樣品中多組分中藥進(jìn)行定量，進(jìn)而全面評(píng)價(jià)中藥的藥代動(dòng)力學(xué)行為。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)的快速掃描和多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)檢測(cè)模式，可很好地滿足生物樣品中多組分中藥對(duì)分析速度和專屬性的要求。同時(shí)本發(fā)明以中藥原料藥作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用LC-MS/MS建立各組分的定量測(cè)定方法，標(biāo)定生物樣品中原料藥對(duì)應(yīng)的各組分相對(duì)濃度，依據(jù)該濃度結(jié)果建立藥-時(shí)曲線，進(jìn)而計(jì)算各組分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。該方法可定量地描述中藥多組分進(jìn)入機(jī)體后的吸收、分布、代謝和排泄等過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律， 研究給藥后體內(nèi)中藥的分布、濃度、療效與時(shí)間之間的關(guān)系，整體揭示中藥在體內(nèi)的經(jīng)時(shí)變化，對(duì)中藥的臨床安全合理用藥具有重要指導(dǎo)意義。以升麻口服片劑為模型藥物，將本發(fā)明提出的定量方法與傳統(tǒng)的定量方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證的比較研究。結(jié)果表明兩者的線性范圍是一致的，本法的精密度和準(zhǔn)確度也符合國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)的要求，采用該法成功地對(duì)升麻口服片進(jìn)行了多組分體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種用于多組分中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的分析方法，有下述的步驟，(1)稱取原料藥，配制原料藥溶液；再以同樣的溶劑分別稀釋成不同濃度，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以原料藥溶液的總濃度作為標(biāo)示量，計(jì)量各標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分的相對(duì)濃度；(2)建立液相色譜-質(zhì)譜分析條件利用質(zhì)譜Ql全掃描方式選擇原料藥中物質(zhì)的離子對(duì)，即待測(cè)物質(zhì)；建立待測(cè)物質(zhì)色譜-質(zhì)譜分析條件、生物樣品前處理方法、以內(nèi)標(biāo)法建立待測(cè)物質(zhì)定量方法，即為原料藥體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析方法；(3)體內(nèi)試驗(yàn)健康受試動(dòng)物給予相同批次原料藥后，按照設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)采集生物樣品；(4)生物樣品測(cè)定采用步驟O)中建立的液相色譜-質(zhì)譜分析條件對(duì)生物樣品中離子對(duì)代表的物質(zhì)進(jìn)行定量分析；(5)數(shù)據(jù)處理利用步驟中獲得的生物樣品中離子對(duì)代表的物質(zhì)定量分析數(shù)據(jù)，即為離子對(duì)代表的物質(zhì)對(duì)于標(biāo)示量的相對(duì)濃度，利用相對(duì)濃度建立藥-時(shí)曲線，進(jìn)而得到各組分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本發(fā)明的用于多組分中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的分析方法，可以先將中藥原料藥溶解，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按SFDA生物樣品分析指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；所述的方法學(xué)確證，內(nèi)容包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量下限、精密度與準(zhǔn)確度、樣品穩(wěn)定性、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、儲(chǔ)備液穩(wěn)定性。更細(xì)致的實(shí)驗(yàn)步驟如下(1)稱取原料藥時(shí)，應(yīng)保證與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用藥品所用原料藥一致。稱取原料藥適量， 以適當(dāng)溶劑溶解后作為儲(chǔ)備液，用相同溶劑分別稀釋適當(dāng)倍數(shù)，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，含量以原料藥總濃度作為“標(biāo)示量”標(biāo)定，即標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分的濃度均以該“標(biāo)示量”計(jì)。(2)建立LC-MS/MS分析條件進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，選擇靈敏度高、專屬性強(qiáng)的離子對(duì)進(jìn)行定量，輸入質(zhì)譜工作站；優(yōu)化色譜分析條件。(3)選擇合適的內(nèi)標(biāo)以及合適的樣品前處理方法進(jìn)行樣品處理。(4)方法學(xué)確證包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量下限、精密度與準(zhǔn)確度、樣品穩(wěn)定性、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、儲(chǔ)備液穩(wěn)定性。(5)體內(nèi)試驗(yàn)健康受試動(dòng)物，給予相同批次中藥原料藥后按照設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)采集生物樣品。(7)生物樣品測(cè)定用已建立的原料藥“標(biāo)準(zhǔn)品”標(biāo)定生物樣品中的不同組分的濃度。(8)數(shù)據(jù)處理有效整合各項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，選擇科學(xué)合理的數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法，獲得各組分的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本發(fā)明的有益效果(1)以多組分中藥原料藥為標(biāo)準(zhǔn)品，使其達(dá)到在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，也可對(duì)生物樣品中中藥多組分定量，進(jìn)而進(jìn)行整體中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究。0)LC-MS/MS法方法快速、靈敏度高、特異性好，可高通量地分析生物樣品中多組分中藥，能滿足中藥臨床前或臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要。避免逐個(gè)分離標(biāo)準(zhǔn)品，大大縮短試驗(yàn)周期，降低試驗(yàn)成本，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。(3)可實(shí)現(xiàn)中藥有效組分的快速篩選，建立Hi-PD關(guān)系，為臨床安全合理用藥提供試驗(yàn)依據(jù)。


圖1是實(shí)施例1測(cè)定大鼠血漿中待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)Rg3的典型MRM色譜圖。
圖2是實(shí)施例16只大鼠灌服升麻原料藥后十四種成分平均血藥濃度-時(shí)間曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1升麻總皂苷藥代動(dòng)力學(xué)研究1、藥物溶液的配制升麻原料藥為“標(biāo)準(zhǔn)品”，配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液準(zhǔn)確稱取升麻原料藥10. Omg,甲醇定容至10mL，作為儲(chǔ)備液，用甲醇-水(80 20，v/v)溶液逐步稀釋至0.5，2.0，10，50，200， 800 μ g/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。2、建立升麻總皂苷LC-MS/MS多組分測(cè)定方法以升麻原料藥作為物質(zhì)組的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇-水(80 20，ν/ν)將其稀釋到適當(dāng)倍數(shù)(1)用注射泵(FIA)進(jìn)樣，質(zhì)譜的Ql采用全掃描的方式，獲得響應(yīng)較高的升麻物質(zhì)組的m/z數(shù)據(jù)；(2)將這些數(shù)據(jù)分別作為L(zhǎng)C-MS/MS的SIM監(jiān)測(cè)的離子，輸入質(zhì)譜工作站；(3)色譜采用梯度洗脫的方式，質(zhì)譜選擇[M-H]-信號(hào)穩(wěn)定的準(zhǔn)分子離子；(4)采用MS2掃描方式，尋找母離子相對(duì)應(yīng)的子離子，并對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選擇靈敏度高、專屬性強(qiáng)的離子對(duì)進(jìn)行定量，輸入質(zhì)譜工作站；十四種組分質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。表1測(cè)定大鼠血漿中十四種成分的質(zhì)譜條件
Peak# TR(min)MS/MSDPCECXP
-32-5
-19-5
-32.2-5
-35.4-5
-22.85-5
-30-11
-24.77-5
-35-5
-30.8-11
-35-5
-37-5
-31.5-5
-35-5
-49.8-5
-31.8-5 (5)優(yōu)化色譜分析條件，選擇內(nèi)標(biāo)，按現(xiàn)有國(guó)際通用的分析方法確證的要求，建立升麻物質(zhì)組的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析方法。
5
11.46305.3/231.3-11024.43501.3/131-14634.45653.4/501.4-5044.84369.2/335.4-16854.85635.4/501.4-56.764.99609.8/131-8074.78589.2/130.9-10684.97677.4/131-10595.15679.4/131-79.65105.13607.4/369.5-80115.48695.7/525.5-38.2126.29639.4/131-68.9136.54663.4/131-105146.66783.8/161.1-158IS6.81681.4/131-89.5
3、藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)取健康雌性wistar大鼠6只，灌服升麻總皂苷(10mg/kg)。于給藥前Oh及給藥 j^5，15，30min，l，l. 5，2，3，4，6，8，10，12，18，24，36 和 48h 經(jīng)眼眶取血 0. 4mL，置于肝素試管中，離心(3000g) IOmin,分離血漿并保存于_35°C冰箱中待測(cè)。4、血漿樣品測(cè)定4. 1血漿樣品的處理方法取血漿樣品IOOyL置IOmL試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液100yL(l μ g/mL Rg3)，補(bǔ)加 IOOyL甲醇-水(80 20,ν/ν)混合溶液，渦流混合aiiin，加入萃取液正己烷二氯甲烷 異丙醇O 1.5 0. 1)，渦流混合lOmin，離心10min(3000g)，取上清于另一試管中，40°C 氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物加?00 μ L流動(dòng)相溶解，渦流混合，取20 μ L進(jìn)行LC-MS/MS分析。4. 2建立血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線取空白血漿樣品IOOyL置IOmL試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液IOOyL(1 μ g/mL Rg3)，加 “升麻總皂苷系列溶液” 100 μ L，配制成相當(dāng)于“升麻原料藥”血漿濃度為0. 5，2. 0，10，50， 200，800μ g/mL標(biāo)示濃度的樣品，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下依法操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以升麻原料藥總濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得的直線回歸方程。升麻原料藥標(biāo)準(zhǔn)品在0. 5 800 μ g/mL范圍內(nèi)線性良好，升麻原料藥中十四種成分的典型回歸方程見(jiàn)表2。表2十四種組分典型標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和準(zhǔn)確度
權(quán)利要求
1.一種用于多組分中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的分析方法，有下述的步驟，(1)稱取原料藥，配制原料藥溶液；再以同樣的溶劑分別稀釋成不同濃度，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以原料藥溶液的總濃度作為標(biāo)示量，計(jì)量各標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分的相對(duì)濃度；(2)建立液相色譜-質(zhì)譜分析條件利用質(zhì)譜Ql全掃描方式選擇原料藥中物質(zhì)的離子對(duì)，即待測(cè)物質(zhì)；建立待測(cè)物質(zhì)色譜-質(zhì)譜分析條件、生物樣品前處理方法、以內(nèi)標(biāo)法建立待測(cè)物質(zhì)定量方法，即為原料藥體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析方法；(3)體內(nèi)試驗(yàn)健康受試動(dòng)物給予相同批次原料藥后，按照設(shè)計(jì)時(shí)間點(diǎn)采集生物樣品；(4)生物樣品測(cè)定采用步驟O)中建立的液相色譜-質(zhì)譜分析條件對(duì)生物樣品中離子對(duì)代表的物質(zhì)進(jìn)行定量分析；(5)數(shù)據(jù)處理利用步驟(4)中獲得的生物樣品中離子對(duì)代表的物質(zhì)定量分析數(shù)據(jù)，即為離子對(duì)代表的物質(zhì)對(duì)于標(biāo)示量的相對(duì)濃度，利用相對(duì)濃度建立藥-時(shí)曲線，進(jìn)而得到各組分的藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多組分中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的分析方法，其特征在于，先將中藥原料藥溶解，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局生物樣品分析指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證；所述的方法學(xué)確證，內(nèi)容包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量下限、 精密度與準(zhǔn)確度、樣品穩(wěn)定性、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、儲(chǔ)備液穩(wěn)定性。
全文摘要
本發(fā)明的一種用于多組分中藥的藥物代謝動(dòng)力學(xué)的分析方法屬于藥物組分分析的技術(shù)領(lǐng)域。采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式，以原料藥為“標(biāo)準(zhǔn)品”，建立原料藥中各組分的定量反應(yīng)離子，相對(duì)定量生物樣品中各中藥組分的濃度。具體步驟有配制原料藥溶液、建立液相色譜-質(zhì)譜分析條件、體內(nèi)試驗(yàn)、生物樣品測(cè)定和數(shù)據(jù)處理。本發(fā)明初步解決了在沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中多組分中藥進(jìn)行定量分析。采用該方法，對(duì)中藥制劑中的已知和未知組分進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果表明，本方法的精密度和準(zhǔn)確度符合SFDA相關(guān)規(guī)范的要求。
文檔編號(hào)G01N30/72GK102175783SQ20101061366
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者劉萬(wàn)卉, 張繼穩(wěn), 張超, 李海燕, 楊艷, 蓋蕓蕓, 顧景凱 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)