臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用。
【背景技術】
[0002]頭孢西丁對革蘭氏陽性菌的抗菌性能弱，對革蘭氏陰性菌作用強。頭孢西丁對大腸桿菌、克雷白氏菌、流感嗜血桿菌、淋球菌、奇異變形桿菌、吲哚陽性變形桿菌等有抗菌作用;對厭氧菌亦有良好的作用，如消化球菌、消化鏈球菌、梭狀芽胞桿菌、擬桿菌(包括脆弱擬桿菌)；綠膿桿菌、腸球菌和陰溝桿菌的多數(shù)菌株對頭孢西丁不敏感。臨床應用于敏感的革蘭氏陰性菌的厭氧菌所致的下呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)、腹腔、骨和關節(jié)、皮膚和軟組織等部位感染，心內(nèi)膜感染以及敗血癥。尤適用于需氧菌和厭氧菌混合感染導致的吸入性肺炎、糖尿病患者下肢感染及腹腔或盆腔感染。
[0003]藥物代謝動力學是研究藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄過程及規(guī)律的一門學科，與藥效學研究藥物對生物體的生物學活性相對應。藥物代謝動力學側重于研究機體對藥物的處置，但隨著學科的發(fā)展及研究技術水平的提高，藥物對生物體的藥物處置系統(tǒng)如轉運體、代謝酶系的作用亦屬于藥物代謝動力學的研究范疇。藥物在生物體內(nèi)的處置特性在一定程度上決定了其藥效或毒性作用強度，因而，藥物代謝動力學研究在創(chuàng)新藥物研究過程中具有十分重要的作用地位和意義。
[0004]在歐美等發(fā)達國家，藥物代謝動力學研究已貫穿于創(chuàng)新藥物研發(fā)的每一個環(huán)節(jié)，包括先導化合物的結構設計與優(yōu)化、候選化合物的篩選與評價、候選藥物的臨床前評價與臨床研究。國外近二十年的實踐經(jīng)驗證明，藥物代謝動專學研究的早期介入與系統(tǒng)研究是提高創(chuàng)新藥物研發(fā)成功率、降低研發(fā)成本與風險、加快研發(fā)進程、實現(xiàn)臨床安全合理用藥的關鍵所在。
[0005]我國臨床前藥物代謝動力學研究與評價由于多種技術瓶頸限制，僅局限于在研發(fā)后期對部分藥物原形進行初步的藥物代謝動力學評價，評價內(nèi)容主要包括藥物原形的血漿經(jīng)時過程、主要臟器分布及原形藥的排泄途徑的描述性研究。隨著我國新藥研發(fā)模式從以“仿制為主”向“仿創(chuàng)結合”及“創(chuàng)新為主”的轉變，我國原有的藥物代謝動力學研究評價體系已不能適應新藥研發(fā)模式發(fā)展轉變的需要，不能充分發(fā)揮藥物代謝動力學研究在先導化合物的結構設計與優(yōu)化、新藥劑型設計與劑型改造、藥物相互作用預測以及臨床安全合理用藥等方面的指導作用。
[0006]相比于歐美等發(fā)達國家，我國原有的藥物代謝動力學研究發(fā)展滯后的根本原因在于關鍵技術水平的落后和研究體系不完善。集中體現(xiàn)在高靈敏度生物樣品中微量藥物的定量分析技術，體內(nèi)外吸收、分布、代謝與排泄特性的快速預測、篩選與評價技術，藥動學-藥效學結合研究技術，藥物相互作用預測與評價技術等相關關鍵技術的缺乏。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]為此，精確地研究頭孢西丁的藥代動力學性質，了解其藥物作用的規(guī)律性和毒性產(chǎn)生的物質基礎，對指導臨床制定合理的給藥方案，提高臨床用藥的安全性和合理性具有關鍵作用和重要意義。
[0008]因此，本發(fā)明的目的是提供一套臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用，以更精確研究頭孢西丁的吸收、分布、代謝與排泄過程。
[0009]因此，本發(fā)明提供了臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用，其包括:
[0010](I)將一定濃度的頭孢西丁給予實驗動物一定時間后，收集血液、尿液和糞便中的一種或多種生物樣品；
[0011](2)將步驟(I)中獲得的生物樣品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技術進行處理，制成相應的溶液；
[0012](3)采用液相色譜-質譜(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)分析步驟(2)中制備的溶液。
[0013]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用，其包括將一定濃度的頭孢西丁給予實驗動物一定時間后，收集血液，采用高效親和色譜法測定頭孢西丁與血漿蛋白的結合率。
[0014]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用，其包括將一定濃度的頭孢西丁處理Caco-2細胞，檢測細胞形態(tài)、電阻值、頭孢西丁的通透性和堿性磷酸酶活性，以檢測頭孢西丁的透膜性和細胞吸收能力。
[0015]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用，其包括將一定濃度的頭孢西丁處理整體動物、S9、人腸微粒體及單克隆純化酶，檢測頭孢西丁體外代謝穩(wěn)定性及代謝產(chǎn)物的鑒定，通過結合LC-MS/MS，匪R技術，在定量分析的基礎上對該藥物可能的I相及II相代謝產(chǎn)物進行了鑒定。
[0016]本發(fā)明通過提供了臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用，采用高通量、高靈敏度定量分析技術，提高了頭孢西丁的靈敏度，為相關藥代性質研究奠定了技術基礎。同時本發(fā)明運用新的高效親和色譜法測定頭孢西丁在注射后的血漿蛋白結合率，以檢測頭孢西丁在體內(nèi)的吸收、轉運及分布特性。藥物血漿蛋白結合率是藥物與血漿蛋白結合的量占藥物總濃度的百分率，是藥物代謝動力學的重要參數(shù)之一;它影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄，從而影響其作用強度和時間，并往往與藥物的相互作用及作用機制等密切相關。因此，藥物血漿蛋白結合率的研究對于指導臨床合理用藥都具有重要意義。此外，本發(fā)明還運用Caco-2細胞模型，對其透膜性和細胞吸收能力進行了評價。最后，檢測了頭孢西丁體外代謝穩(wěn)定性及代謝產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0017]本發(fā)明提供了臨床前藥物代謝動力學關鍵技術與研究體系在頭孢西丁的應用，其包括:
[0018](I)將一定濃度的頭孢西丁給予實驗動物一定時間后，收集血液、尿液和糞便中的一種或多種生物樣品；
[0019](2)將步驟(I)中獲得的生物樣品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技術進行處理，制成相應的溶液；
[0020](3)采用液相色譜-質譜(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)分析步驟⑵中制備的溶液。
[0021 ]本發(fā)明所述試驗動物可以是大鼠、小鼠、豚鼠、兔或犬。
[0022]所述一定濃度和一定時間根據(jù)實驗動物確定。
[0023]在一種優(yōu)選的實施方式中，在步驟(2)中，所述液液萃取采用乙酸乙酯和氨水的混合物(例如，氨水在混合物中的濃度為1 % )以及乙酸乙酯和氫氧化鈉(例如，氫氧化鈉在混合物中的濃度為0.15M)的混合物;所述蛋白沉淀采用甲醇沉淀、乙腈沉淀、甲醇和乙腈的混合物沉淀，甲醇和乙腈的體積比為例如1: 1.5。
[0024]在一種優(yōu)選的實施方式中，在步驟(2)中，所述液液萃取采用乙酸乙酯和氨水的混合物以及乙酸乙酯和氫氧化鈉的混合物，所述蛋白沉淀采用甲醇沉淀、乙腈沉淀、甲醇和乙腈沉淀。
[0025]在一種優(yōu)選的實施方式中，在步驟(3)中，通過系統(tǒng)優(yōu)化流動相組成、流動相梯度流速、質譜離子化條件，以提高對頭孢西丁定量分析的靈敏度；而且極大地提高了分析通量，為頭孢西丁的藥物代謝動力學研究打下了堅實的分析技術基礎。
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