臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在我國，癌癥發(fā)病率接近世界水平，但死亡率高于世界水平。據(jù)相關(guān)資料估計(jì)，每年全國因腫瘤造成的門診和住院花費(fèi)數(shù)百億元，遠(yuǎn)高于其他慢性病的醫(yī)療費(fèi)用，是衛(wèi)生總費(fèi)用上漲的重要因素之一。
[0003]培美曲塞是一種結(jié)構(gòu)上含有核心為吡咯嘧啶基團(tuán)的抗葉酸制劑，通過破壞細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過程，抑制細(xì)胞復(fù)制，從而抑制腫瘤的生長。
[0004]藥物代謝動(dòng)力學(xué)是研究藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄過程及規(guī)律的一門學(xué)科，與藥效學(xué)研究藥物對生物體的生物學(xué)活性相對應(yīng)。藥物代謝動(dòng)力學(xué)側(cè)重于研究機(jī)體對藥物的處置，但隨著學(xué)科的發(fā)展及研究技術(shù)水平的提高，藥物對生物體的藥物處置系統(tǒng)如轉(zhuǎn)運(yùn)體、代謝酶系的作用亦屬于藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究范疇。藥物在生物體內(nèi)的處置特性在一定程度上決定了其藥效或毒性作用強(qiáng)度，因而，藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究在創(chuàng)新藥物研究過程中具有十分重要的作用地位和意義。
[0005]在歐美等發(fā)達(dá)國家，藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究已貫穿于創(chuàng)新藥物研發(fā)的每一個(gè)環(huán)節(jié)，包括先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化、候選化合物的篩選與評價(jià)、候選藥物的臨床前評價(jià)與臨床研究。國外近二十年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明，藥物代謝動(dòng)專學(xué)研究的早期介入與系統(tǒng)研究是提高創(chuàng)新藥物研發(fā)成功率、降低研發(fā)成本與風(fēng)險(xiǎn)、加快研發(fā)進(jìn)程、實(shí)現(xiàn)臨床安全合理用藥的關(guān)鍵所在。
[0006]我國臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究與評價(jià)由于多種技術(shù)瓶頸限制，僅局限于在研發(fā)后期對部分藥物原形進(jìn)行初步的藥物代謝動(dòng)力學(xué)評價(jià)，評價(jià)內(nèi)容主要包括藥物原形的血漿經(jīng)時(shí)過程、主要臟器分布及原形藥的排泄途徑的描述性研究。隨著我國新藥研發(fā)模式從以“仿制為主”向“仿創(chuàng)結(jié)合”及“創(chuàng)新為主”的轉(zhuǎn)變，我國原有的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究評價(jià)體系已不能適應(yīng)新藥研發(fā)模式發(fā)展轉(zhuǎn)變的需要，不能充分發(fā)揮藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究在先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化、新藥劑型設(shè)計(jì)與劑型改造、藥物相互作用預(yù)測以及臨床安全合理用藥等方面的指導(dǎo)作用。
[0007]相比于歐美等發(fā)達(dá)國家，我國原有的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究發(fā)展滯后的根本原因在于關(guān)鍵技術(shù)水平的落后和研究體系不完善。集中體現(xiàn)在高靈敏度生物樣品中微量藥物的定量分析技術(shù)，體內(nèi)外吸收、分布、代謝與排泄特性的快速預(yù)測、篩選與評價(jià)技術(shù)，藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)結(jié)合研究技術(shù)，藥物相互作用預(yù)測與評價(jià)技術(shù)等相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)的缺乏。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0008]為此，精確地研究培美曲塞的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，了解其藥物作用的規(guī)律性和毒性產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，對指導(dǎo)臨床制定合理的給藥方案，提高臨床用藥的安全性和合理性具有關(guān)鍵作用和重要意義。
[0009]因此，本發(fā)明的目的是提供一套臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用，以更精確研究培美曲塞的吸收、分布、代謝與排泄過程。
[0010]因此，本發(fā)明提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用，其包括:
[0011 ] (1)將一定濃度的培美曲塞給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一定時(shí)間后，收集血液、尿液和奠便中的一種或多種生物樣品；
[0012](2)將步驟(1)中獲得的生物樣品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技術(shù)進(jìn)行處理，制成相應(yīng)的溶液；
[0013](3)采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析步驟(2)中制備的溶液。
[0014]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用，其包括將一定濃度的培美曲塞給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一定時(shí)間后，收集血液，采用高效親和色譜法測定培美曲塞與血漿蛋白的結(jié)合率。
[0015]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用，其包括將一定濃度的培美曲塞處理原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，測定檢測細(xì)胞形態(tài)、電阻值，以檢測培美曲塞的血腦屏障通透性。
[0016]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用，其包括將一定濃度的培美曲塞處理Caco-2細(xì)胞，檢測細(xì)胞形態(tài)、電阻值、培美曲塞的通透性和堿性磷酸酶活性，以檢測培美曲塞的透膜性和細(xì)胞吸收能力。
[0017]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用，其包括將一定濃度的培美曲塞處理整體動(dòng)物、S9、人腸肝微粒體及單克隆純化酶，檢測培美曲塞體外代謝穩(wěn)定性及代謝產(chǎn)物的鑒定，通過結(jié)合LC-MS/MS，NMR技術(shù)，在定量分析的基礎(chǔ)上對該藥物可能的I相及II相代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。
[0018]本發(fā)明通過提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用，采用高通量、高靈敏度定量分析技術(shù)，提高了培美曲塞的靈敏度，為相關(guān)藥代性質(zhì)研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。同時(shí)本發(fā)明運(yùn)用新的高效親和色譜法測定培美曲塞在注射后的血漿蛋白結(jié)合率，以檢測培美曲塞在體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及分布特性。藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物與血漿蛋白結(jié)合的量占藥物總濃度的百分率，是藥物代謝動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一;它影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄，從而影響其作用強(qiáng)度和時(shí)間，并往往與藥物的相互作用及作用機(jī)制等密切相關(guān)。因此，藥物血漿蛋白結(jié)合率的研究對于指導(dǎo)臨床合理用藥都具有重要意義。此外，本發(fā)明還運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型，對其透膜性和細(xì)胞吸收能力進(jìn)行了評價(jià);還采用原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞測定檢測細(xì)胞形態(tài)、電阻值，以檢測培美曲塞的血腦屏障通透性。最后，檢測了培美曲塞體外代謝穩(wěn)定性及代謝產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0019]本發(fā)明提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在培美曲塞的應(yīng)用，其包括:
[0020](1)將一定濃度的培美曲塞給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一定時(shí)間后，收集血液、尿液和奠便中的一種或多種生物樣品；
[0021](2)將步驟(1)中獲得的生物樣品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技術(shù)進(jìn)行處理，制成相應(yīng)的溶液；
[0022](3)采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析步驟⑵中制備的溶液。
[0023]本發(fā)明所述試驗(yàn)動(dòng)物可以是大鼠、小鼠、豚鼠、兔或犬。
[0024]所述一定濃度和一定時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物確定。
[0025]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(2)中，所述液液萃取采用乙酸乙酯和氨水的混合物(例如，氨水在混合物中的濃度為10 % )以及乙酸乙酯和氫氧化鈉(例如，氫氧化鈉在混合物中的濃度為0.15M)的混合物;所述蛋白沉淀采用甲醇沉淀、乙腈沉淀、甲醇和乙腈的混合物沉淀，甲醇和乙腈的體積比為例如1:1.5。
[0026]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(3)中，通過系統(tǒng)優(yōu)化流動(dòng)相組成、流動(dòng)相梯度流速、質(zhì)譜離子化條件，以提高對培美曲塞定量分析的靈敏度；而且極大地提高了分析通量，為培美曲塞的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究打下了堅(jiān)實(shí)的分析技術(shù)基礎(chǔ)。
[0027]鑒于腦靶向藥物腦分布研究的重要性，腦靶向給藥的藥物需進(jìn)行血腦屏障通透性的評價(jià)。本發(fā)明采用基于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血腦屏障通透性研究模型，并通過形態(tài)學(xué)、電阻值、陽性藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、進(jìn)一步檢測培美曲塞的血腦屏障通透性。因此，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該應(yīng)用還包括將一定濃度的培美曲塞處理原代培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，測定檢測細(xì)胞形態(tài)、電阻值，以檢測培美曲塞的血腦屏障通透性。
[0028]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該應(yīng)用還