專利名稱：一種分析微藻代謝組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物燃料領(lǐng)域，涉及一種分析微藻代謝組的方法。
背景技術(shù)：
隨著人類社會(huì)的不斷發(fā)展，對(duì)能源的需求與日俱增，但是當(dāng)前化石能源的儲(chǔ)備是有限的，伴隨著化石能源的消耗，石油價(jià)格持續(xù)看漲，國際關(guān)系也日益緊張，此外，化石能源的使用造成二氧化碳不斷增加，是溫室效應(yīng)的主要來源。因此可持續(xù)發(fā)展的綠色新能源的開發(fā)成為了各國關(guān)注的熱點(diǎn)。目前常用的生物能源主要是生物乙醇和生物柴油，其中生物乙醇主要來自于農(nóng)業(yè)廢棄物中的纖維素資源，但是生物乙醇的使用需要重新設(shè)計(jì)配送基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)及引擎，與現(xiàn)有技術(shù)兼容性差，而且纖維素降解液的利用和前處理過程中產(chǎn)生的抑制性毒素也是生物發(fā)酵產(chǎn)乙醇的一大瓶頸。而通過富油生物，比如微藻產(chǎn)生物柴油，所得脂肪酸甲酯完全可以使用現(xiàn)有的燃料裝置，而且微藻生長(zhǎng)速率快，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求低，不占用耕地，含油量也較高。但是微藻產(chǎn)油尚在起步階段，在其發(fā)展成為可以適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)之前還有許多技術(shù)知識(shí)需要積累，而微藻培養(yǎng)過程中相關(guān)的代謝機(jī)制研究就是其中一個(gè)關(guān)鍵方向，不過微藻的破壁比較困難，而且微藻相關(guān)的代謝組學(xué)研究方法幾乎是空白。因此，對(duì)微藻油脂積累過程中的代謝組監(jiān)控的方法的開發(fā)就顯得尤為重要了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分析微藻代謝組的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種分析微藻代謝組的方法，包括如下步驟(1)微藻細(xì)胞收集及淬滅取出已培養(yǎng)好的藻液樣品3-5份，每份100-150mL，4°C下3000-5000rpm，離心 3-4min,收集下層的細(xì)胞，用3_5mL代謝終止液在-40°C下淬滅5_10分鐘，終止代謝反應(yīng)， 在-80°C下冷凍干燥4-6h獲得凍干細(xì)胞；所述代謝終止液為含有1500mg · L4NaNO3Jemg · I^1CaCl2 · 2H20， 75mg · L-1MgSO4 · 7H20和40mg · L^K2HPO4 · 3H20的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為1 2;(2)提取細(xì)胞內(nèi)代謝物從3-5份步驟⑴獲得的凍干細(xì)胞中各取15_25mg分別置于離心管中，每管加入l-2mL-40°C的代謝提取液，混勻，蓋緊并放入液氮中，反復(fù)凍融3_5次，在_20°C下 4000-6000rpm離心l_2min，收集上清，另向殘?jiān)屑尤?. 5_lmL代謝提取液，-20 °C T 4000-6000rpm離心l_2min，離心后，將兩次上清液合并，加入10_20 μ g氘標(biāo)記琥珀酸，得混合液，各取200 μ L混合液，在_80°C下冷凍干燥2-4小時(shí)；所述代謝提取液為體積百分含量為50%的甲醇水溶液；
(3)代謝物衍生化
向步驟⑵獲得的樣品中各加入ZOmgmr1的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液50 μ L， 于40°〇水浴中反應(yīng)60-801^11，反應(yīng)結(jié)束后加入8(^1^ N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺， 于40°C水浴再反應(yīng)60-80min，8000-12000rpm離心lmin，取上清100 μ L放入已編號(hào)的GC 進(jìn)樣瓶，室溫放置濁；
(4) GC-MS 檢測(cè)
采用GC-MS對(duì)步驟( 獲得的3-5份樣品進(jìn)行定性和定量處理，得到微藻代謝組分析結(jié)果。
所述步驟的檢測(cè)條件優(yōu)選的是如下
色譜柱DB-5氣相色譜柱，其規(guī)格為30m*0. 25mm, 0. 25 μ m ；
進(jìn)樣量lyL;
分流比10 1 ；
進(jìn)樣口溫度280°C;
GC interface 溫度270°C ；
氦氣流速恒壓，9 IKPa ；
升溫程序70°C保持2min，以5°C -min"1的速度升到290°C，并在290°C保持6min ；
電離電壓70eV;
源溫250°C；
掃描范圍50-800m/z；
掃描速度2scan · s人
所述的微藻涉及但不限于小球藻(Chlorella sorokiniana)、柵藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)及魚腥藻(Anabaena sp. PCC7120)。
本發(fā)明提供了一種分析微藻代謝組的手段，這種手段涉及代謝反應(yīng)的終止、代謝物的提取、代謝物的分析，從而獲得微藻在不同培養(yǎng)條件下的代謝物的定性和定量結(jié)果，為微藻代謝組的分析提供了方法，這種方法對(duì)促進(jìn)微藻的代謝研究具有重要的意義。
具體實(shí)施方式
下面的實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，并不對(duì)本發(fā)明作任何限制。
下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例1
一種分析微藻代謝組的方法，包括如下步驟
(1)小球藻(Chlorella sorokiniana)細(xì)胞收集及淬滅
對(duì)小球藻(Chlorella sorokiniana)進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至0D560為0. 8時(shí)，取出 5份藻液樣品，每份100mL，4°C下3000rpm，離心3min，收集下層的細(xì)胞，用4mL代謝終止液在-40°C下淬滅5分鐘，終止代謝反應(yīng)，在-80°C下冷凍干燥4h獲得凍干細(xì)胞；
所述代謝終止液為含有1500mg · L4NaNO3Jemg · I^1CaCl2 · 2H20， 75mg · L4MgSO4 · 7H20和40mg · L4K2HPO4 · 3H20的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為1 2;
(2)提取細(xì)胞內(nèi)代謝物
取步驟⑴獲得的凍干細(xì)胞5份，每份15mg分別置于離心管中，每管加入 lmL-40°C的代謝提取液，混勻，蓋緊并放入液氮中，反復(fù)凍融3次，在_20°C下4000rpm離心 Imin,收集上清，另向殘?jiān)屑尤?. 5mL代謝提取液，-20°C下4000rpm離心lmin，離心后， 兩次上清液合并，加入10 μ g氘標(biāo)記琥珀酸，得混合液，各取200 μ L混合液，在-80°C下冷凍干燥2小時(shí)；
所述代謝提取液為體積百分含量為50%的甲醇水溶液；
(3)代謝物衍生化
向步驟⑵獲得的樣品中加入20mg · mL—1的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液50 μ L， 于40°C水浴中反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束后加入80 μ L N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于 40°C水浴再反應(yīng)60min，8000rpm離心lmin，取上清100 μ L放入已編號(hào)的GC進(jìn)樣瓶，室溫放置2h ；
(4) GC-MS 檢測(cè)
采用GC-MS對(duì)步驟( 獲得的5份樣品進(jìn)行定性和定量處理，得到微藻代謝組分析結(jié)果，見表1。
條件如下
色譜柱DB-5氣相色譜柱，其規(guī)格為30m*0. 25mm, 0. 25 μ m ；
進(jìn)樣量lyL;
分流比10 1 ；
進(jìn)樣口溫度280°C;
GC interface 溫度270°C ；
氦氣流速恒壓，9 IKPa ；
升溫程序70°C保持2min，以5°C -min"1的速度升到290°C，并在290°C保持6min ；
電離電壓70eV;
源溫250°C；
掃描范圍50-800m/z；
掃描速度2scan· ；
(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表1代謝物鑒定表類別代謝物
^SH L-纈氨酸L-丙氨酸
權(quán)利要求
1.一種分析微藻代謝組的方法，其特征是包括如下步驟(1)微藻細(xì)胞收集及淬滅取出已培養(yǎng)好的微藻藻液樣品3-5份，每份100-150mL，4°C下3000-5000rpm，離心 3-4min,收集下層的細(xì)胞，用3_5mL代謝終止液在_40°C下淬滅5_10分鐘，終止代謝反應(yīng)， 在-80°C下冷凍干燥4-6h獲得凍干細(xì)胞；所述代謝終止液為含有 1500mg · L^1NaNO3, 36mg · L^1CaCl2 · 2H20，75mg · L4MgSO4 · 7H20 和40mg · L-1K2HPO4 · 3H20的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為1:2;(2)提取細(xì)胞內(nèi)代謝物從步驟⑴獲得的3-5份凍干細(xì)胞中各取15-25mg分別置于離心管中，每管加入1 -2mL-40 V的代謝提取液，混勻，蓋緊并放入液氮中，反復(fù)凍融3_5次，在-20°C下 4000-6000rpm離心l_2min，收集上清，另向殘?jiān)屑尤?. 5-lmL代謝提取液，-20 °C T 4000-6000rpm離心l_2min，離心后，將兩次上清液合并，加入10_20 μ g氘標(biāo)記琥珀酸，得混合液，各取200 μ L混合液，在_80°C下冷凍干燥2-4小時(shí)； 所述代謝提取液為體積百分含量為50%的甲醇水溶液；(3)代謝物衍生化向步驟⑵獲得的樣品中各加入ZOmg·!!^1的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液50yL，于 40°C水浴中反應(yīng)60-80min，反應(yīng)結(jié)束后加入80 μ L N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于 40°C水浴再反應(yīng)60-80min，8000-12000rpm離心lmin，取上清100 μ L放入已編號(hào)的GC進(jìn)樣瓶，室溫放置2h ；(4)GC-MS 檢測(cè)采用GC-MS對(duì)步驟(3)獲得的3-5份樣品進(jìn)行定性和定量處理，得到微藻代謝組分析結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析微藻代謝組的方法，其特征是所述微藻為小球藻(Chlorellasorokiniana) > H 藻(Scenedesmus obliquus)、集胞藻(Synechocystis sp. PCC6803)及魚腥藻(Anabaena sp. PCC7120)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種分析微藻代謝組的方法，其特征是所述步驟(4)的檢測(cè)條件如下色譜柱DB-5氣相色譜柱，其規(guī)格為30m*0. 25mm, 0. 25 μ m ；進(jìn)樣量1 μ L ；分流比10 1 ；進(jìn)樣口溫度280°C ；GC interface 溫度270°C ；氦氣流速恒壓，9 IKPa ；升溫程序70°C保持2min，以5°C · mirT1的速度升到290°C，并在290°C保持6min ； 電離電壓:70eV ； 源溫250 0C ； 掃描范圍50-800m/z ； 掃描速度2scan · s—1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分析微藻代謝組的方法，該方法包括微藻細(xì)胞收集及淬滅；提取細(xì)胞內(nèi)代謝物；代謝物衍生化；最后通過GC-MS對(duì)樣品分析得到代謝組結(jié)果。本發(fā)明提供了一種分析微藻代謝組的手段，這種手段涉及代謝反應(yīng)的終止、代謝物的提取、代謝物的分析，從而獲得微藻在不同培養(yǎng)條件下的代謝物的定性和定量結(jié)果，為微藻代謝組的分析提供了方法，這種方法對(duì)促進(jìn)微藻的代謝研究具有重要的意義。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102495152SQ201110384769
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者丁明珠, 元英進(jìn), 牛艷紅, 陸姝歡 申請(qǐng)人:天津大學(xué)