臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維b1的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維bl的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肝臟是人體的重要器官，我國(guó)是一個(gè)肝病大國(guó)。甲硫氨酸維bl主要用于改善肝臟功能，對(duì)肝臟疾病，如急慢性肝炎、肝硬化，尤其是對(duì)脂肪肝有較明顯的療效，能改善肝內(nèi)膽汁淤積;可用于酒精、巴比妥類(lèi)、磺胺類(lèi)藥物中毒時(shí)有輔助治療。
[0003]藥物代謝動(dòng)力學(xué)是研究藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄過(guò)程及規(guī)律的一門(mén)學(xué)科，與藥效學(xué)研究藥物對(duì)生物體的生物學(xué)活性相對(duì)應(yīng)。藥物代謝動(dòng)力學(xué)側(cè)重于研究機(jī)體對(duì)藥物的處置，但隨著學(xué)科的發(fā)展及研究技術(shù)水平的提高，藥物對(duì)生物體的藥物處置系統(tǒng)如轉(zhuǎn)運(yùn)體、代謝酶系的作用亦屬于藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究范疇。藥物在生物體內(nèi)的處置特性在一定程度上決定了其藥效或毒性作用強(qiáng)度，因而，藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究在創(chuàng)新藥物研究過(guò)程中具有十分重要的作用地位和意義。
[0004]在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究已貫穿于創(chuàng)新藥物研發(fā)的每一個(gè)環(huán)節(jié)，包括先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化、候選化合物的篩選與評(píng)價(jià)、候選藥物的臨床前評(píng)價(jià)與臨床研究。國(guó)外近二十年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明，藥物代謝動(dòng)專(zhuān)學(xué)研究的早期介入與系統(tǒng)研究是提高創(chuàng)新藥物研發(fā)成功率、降低研發(fā)成本與風(fēng)險(xiǎn)、加快研發(fā)進(jìn)程、實(shí)現(xiàn)臨床安全合理用藥的關(guān)鍵所在。
[0005]我國(guó)臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究與評(píng)價(jià)由于多種技術(shù)瓶頸限制，僅局限于在研發(fā)后期對(duì)部分藥物原形進(jìn)行初步的藥物代謝動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)內(nèi)容主要包括藥物原形的血漿經(jīng)時(shí)過(guò)程、主要臟器分布及原形藥的排泄途徑的描述性研究。隨著我國(guó)新藥研發(fā)模式從以“仿制為主”向“仿創(chuàng)結(jié)合”及“創(chuàng)新為主”的轉(zhuǎn)變，我國(guó)原有的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究評(píng)價(jià)體系已不能適應(yīng)新藥研發(fā)模式發(fā)展轉(zhuǎn)變的需要，不能充分發(fā)揮藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究在先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化、新藥劑型設(shè)計(jì)與劑型改造、藥物相互作用預(yù)測(cè)以及臨床安全合理用藥等方面的指導(dǎo)作用。
[0006]相比于歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，我國(guó)原有的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究發(fā)展滯后的根本原因在于關(guān)鍵技術(shù)水平的落后和研究體系不完善。集中體現(xiàn)在高靈敏度生物樣品中微量藥物的定量分析技術(shù)，體內(nèi)外吸收、分布、代謝與排泄特性的快速預(yù)測(cè)、篩選與評(píng)價(jià)技術(shù)，藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)結(jié)合研究技術(shù)，藥物相互作用預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)等相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)的缺乏。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]為此，精確地研究甲硫氨酸維bl的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，了解其藥物作用的規(guī)律性和毒性產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)指導(dǎo)臨床制定合理的給藥方案，提高臨床用藥的安全性和合理性具有關(guān)鍵作用和重要意義。
[0008]因此，本發(fā)明的目的是提供一套臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維bl的應(yīng)用，以更精確研究甲硫氨酸維bl的吸收、分布、代謝與排泄過(guò)程。
[0009]因此，本發(fā)明提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維bl的應(yīng)用，其包括:
[0010](I)將一定濃度的甲硫氨酸維bl給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一定時(shí)間后，收集血液、尿液和糞便中的一種或多種生物樣品；
[0011](2)將步驟(I)中獲得的生物樣品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技術(shù)進(jìn)行處理，制成相應(yīng)的溶液；
[0012](3)采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析步驟(2)中制備的溶液。
[0013]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維bl的應(yīng)用，其包括將一定濃度的甲硫氨酸維bl給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一定時(shí)間后，收集血液，采用高效親和色譜法測(cè)定甲硫氨酸維bl與血漿蛋白的結(jié)合率。
[0014]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維bl的應(yīng)用，其包括將一定濃度的甲硫氨酸維bl處理Caco-2細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)、電阻值、甲硫氨酸維bl的通透性和堿性磷酸酶活性，以檢測(cè)甲硫氨酸維bl的透膜性和細(xì)胞吸收能力。
[0015]因此，本發(fā)明還提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維bl的應(yīng)用，其包括將一定濃度的甲硫氨酸維bl處理整體動(dòng)物、S9、人肝微粒體及單克隆純化酶，檢測(cè)甲硫氨酸維bl體外代謝穩(wěn)定性及代謝產(chǎn)物的鑒定，通過(guò)結(jié)合LC-MS/MS，NMR技術(shù)，在定量分析的基礎(chǔ)上對(duì)該藥物可能的I相及II相代謝產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。
[0016]本發(fā)明通過(guò)提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維bl的應(yīng)用，采用高通量、高靈敏度定量分析技術(shù)，提高了甲硫氨酸維bl的靈敏度，最低檢出限可達(dá)ng級(jí)，為相關(guān)藥代性質(zhì)研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。同時(shí)本發(fā)明運(yùn)用新的高效親和色譜法測(cè)定甲硫氨酸維BI在注射后的血漿蛋白結(jié)合率，以檢測(cè)甲硫氨酸維bl在體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及分布特性。藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物與血漿蛋白結(jié)合的量占藥物總濃度的百分率，是藥物代謝動(dòng)力學(xué)的重要參數(shù)之一;它影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄，從而影響其作用強(qiáng)度和時(shí)間，并往往與藥物的相互作用及作用機(jī)制等密切相關(guān)。因此，藥物血漿蛋白結(jié)合率的研究對(duì)于指導(dǎo)臨床合理用藥都具有重要意義。此外，本發(fā)明還運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型，結(jié)合甲硫氨酸維b I的水溶性、c 1gP、PSA等參數(shù)，對(duì)其透膜性和細(xì)胞吸收能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。最后，檢測(cè)了甲硫氨酸維bl體外代謝穩(wěn)定性及代謝產(chǎn)物。
[0017]本發(fā)明研究結(jié)果顯示，甲硫氨酸在人體內(nèi)與ATP結(jié)合生成S—腺苷氨酸，促進(jìn)肝細(xì)胞膜磷脂甲基化，減少肝內(nèi)膽汁淤積，轉(zhuǎn)硫基作用加強(qiáng)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞恢復(fù)正常生理功能和肝功能恢復(fù)，同時(shí)通過(guò)供給甲基，促進(jìn)膽堿的合成，促進(jìn)肝脂肪代謝保肝及解毒。維生素bl在體內(nèi)與焦磷酸結(jié)合成輔羧酶，參與糖代謝中丙酮酸和a-酮戊二酸的氧化脫羧反應(yīng)，對(duì)于肝損傷導(dǎo)致的維生素bl缺失患者改善其糖代謝及身體機(jī)能。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明提供了臨床前藥物代謝動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵技術(shù)與研究體系在甲硫氨酸維bl的應(yīng)用，其包括:
[0019](I)將一定濃度的甲硫氨酸維bl給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一定時(shí)間后，收集血液、尿液和糞便中的一種或多種生物樣品；
[0020](2)將步驟(I)中獲得的生物樣品采用液液萃取、蛋白沉淀、固相萃取技術(shù)進(jìn)行處理，制成相應(yīng)的溶液；
[0021](3)采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)分析步驟⑵中制備的溶液。
[0022]本發(fā)明所述試驗(yàn)動(dòng)物可以是大鼠、小鼠、豚鼠、兔或犬。
[0023]所述一定濃度和一定時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物確定。
[0024]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(2)中，所述液液萃取采用乙酸乙酯和氨水的混合物(例如，氨水在混合物中的濃度為1 % )以及乙酸乙酯和氫氧化鈉(例如，氫氧化鈉在混合物中的濃度為0.15M)的混合物;所述蛋白沉淀采用甲醇沉淀、乙腈沉淀、甲醇和乙腈的混合物沉淀，甲醇和乙腈的體積比為例如1: 1.5。
[0025]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(3)中，通過(guò)系統(tǒng)優(yōu)化流動(dòng)相組成、流動(dòng)相梯度流速、質(zhì)譜離子化條件，以提高對(duì)甲硫氨酸維bl定量分析的靈敏度;且優(yōu)選為甲硫氨酸維bl的最低檢出限為納克級(jí)，而且極大地提高了分析通量，為甲硫氨酸維bl的藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究打下了堅(jiān)實(shí)的分析技術(shù)基礎(chǔ)。
[0026]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該應(yīng)用還包括采用高效親和色譜法測(cè)定甲硫氨酸維bl在注射一定時(shí)間后與血漿蛋白的結(jié)合率。