專利名稱：食品安全快速均相免疫檢測試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種食品安全檢測試劑。
背景技術(shù)：
我國衛(wèi)生部和農(nóng)業(yè)部已制定了一系列農(nóng)藥殘留限量(大約136種)和相應(yīng)的123 種農(nóng)藥檢驗方法，頒布了農(nóng)藥多殘留檢測方法(包括有機氯、有機磷、擬除蟲菊酯和氨基甲 酸酯類近50種農(nóng)藥)。但我國仍缺乏自主研發(fā)的系統(tǒng)的多殘留、大通量的均相酶免放大技 術(shù)產(chǎn)品。免疫檢測方法是目前檢測小分子化學(xué)藥物的最快速方法，據(jù)歐共體對2000多個 實驗室(包括法證實驗室、臨床實驗室、研究機構(gòu)、參照實驗室)進行的調(diào)查，篩選實驗采用 免疫法的占89. 6%、理化色譜法的只有10. 4%，而且免疫法的采用還處于快速上升勢態(tài)。傳統(tǒng)的免疫快速檢測產(chǎn)品(放免法、酶聯(lián)法、膠體金法)都需要將標記的抗原或抗 體(探針)和游離(探針)的抗原或抗體進行分離，才能通過肉眼或儀器讀取結(jié)果，所需時 間長、操作步驟多、系統(tǒng)誤差大。反應(yīng)過程見以下方程式Ab (抗體)+Ag (待測物)+Ag* (標記抗原)—Ab-Ag+Ab-Ag*+Ag*+Ag需要分離步驟的原因是用膠體金、同位素或HRP酶標記的探針本身理化性質(zhì)在 反應(yīng)中沒有變化，儀器無法區(qū)分游離的探針(Ag*)和與抗體結(jié)合的探針(Ab-Ag*)，必須通過 層析、沉淀或洗滌方法將Ag*除去后，才能準確測量Ab-Ag*的濃度，從而估算出待測物(Ag) 的濃度。均相免疫技術(shù)應(yīng)用的標記物，理化性質(zhì)在與抗體結(jié)合后發(fā)生改變，無需分離就可 直接讀取溶液中[Agl或[Ab-Agl濃度來推算出待測物Ag的濃度。該技術(shù)(EMIT)及產(chǎn)品 是集現(xiàn)代有機合成化學(xué)、免疫化學(xué)、分子生物學(xué)和全自動智能性生化分析儀器為一體的高 科技產(chǎn)業(yè)，在測定速度、準確性和可靠性方面均比膠體金法和ELISA方法先進得多。均相免疫放大技術(shù)可用于標記的物質(zhì)有酶、凝膠顆粒、化學(xué)發(fā)光物、熒光物質(zhì)以 及膠體金等。例如EMIT是利用酶標記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標記酶的活性會發(fā) 生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性改變，而確定抗原或抗體的 含量?；驹戆肟乖c酶結(jié)合成酶標半抗原，保留半抗原和酶的活性。酶標半抗原與抗 體結(jié)合后，所標的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受影響而活性被壓制(如附圖1)。而 游離的酶標半抗原仍保持酶的活性(如附圖3)，通過測定標記酶的活性，確定與抗體結(jié)合 的樣本中半抗原的量(如附圖2)，而間接確定樣本中藥物的含量。EMIT試劑盒中的主要試劑為①、抗體/酶的底物，②、酶標半抗原，檢測對象為標 本中的半抗原。試劑盒的工作原理為當試劑①、②與標本混合后，標本中的待測物與酶標 半抗原競爭性地與試劑中的抗體相結(jié)合。在反應(yīng)后酶活力大小與標本中的待測物濃度呈一 定的比例，從酶活力的測定結(jié)果就可推算出標本中待測物的量。該技術(shù)目前主要用于小分 子激素和有機化合物(如藥物及其代謝物)的測定。雖然此技術(shù)已用于測定常用小分子藥 物，尤其是濫用毒品。但由于測定靈敏度的限制，還沒有任何有關(guān)技術(shù)用于食品中有毒有害物質(zhì)(如農(nóng)獸藥)殘留的檢測報道。均相免疫分析方法速度快、操作簡單、單一性好、系統(tǒng)誤差小于1%，靈敏度比化學(xué) 顯色法高，均相免疫技術(shù)已廣泛應(yīng)用于違禁藥品的大通量檢測，對于大部分毒品檢測的準 確性和靈敏度都超過95%，已成為歐美國家大型檢測中心的必備技術(shù)和試劑。但用于食品 中有毒有害物質(zhì)的檢測尚未見報道。其原因在于傳統(tǒng)的EMIT技術(shù)的檢測靈敏度還達不到 lng/ml0食品安全檢測要求殘留藥物的含量檢測達到極高的靈敏度，而且快速、簡便、定 量。市售的膠體金試紙只能定性檢測，ELISA試劑盒的檢測結(jié)果受環(huán)境和操作者技能影響， 傳統(tǒng)的EMIT試劑盒的靈敏度較低。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是通過對傳統(tǒng)均相酶免放大技術(shù)的改良，提供一系列滿足檢測要求 的有害物質(zhì)殘留均相免疫檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的利用均相酶免放大反應(yīng)的方法測定動物體液和組織萃取液中有害物質(zhì)殘留量；其 中所指的均相酶免放大反應(yīng)是指待測的樣品和試劑均為液相，測定過程中不存在分離步 驟，樣品與抗體反應(yīng)后再加入標記的抗原進行反應(yīng)。其中所指的動物體液和組織可包括動 物尿液、血液、動物內(nèi)臟或肌肉等；所指的有害物質(zhì)殘留包括常用有機小分子藥品和違禁藥 品，包含鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、三聚氰胺、孔雀石綠、苯二氮卓、三環(huán)類抗抑郁藥和各 種抗菌素類藥物。均相酶免放大反應(yīng)是由針對目標分析物(原藥或藥物主要代謝物)的單 克隆或多克隆抗體(試劑A)以及原藥或藥物主要代謝物與標記抗原如特定酶(G6PDH)標 記的抗原(試劑B)，其標記物也可以是除酶以外的化學(xué)發(fā)光物或其它標記物，如膠體金、乳 膠顆粒、染料等。由以下的化合物所獲得的抗體和標記的物用于均相免疫反應(yīng)中。均相酶 聯(lián)放大技術(shù)產(chǎn)品中所用的緩沖液包括常用磷酸鹽(PBS)、Tris、HEPES等緩沖液。所用的半 抗原連接到大分子上，方法包括常用的重氮法、酸酐法、活化酯法等。其分子式
5 有益效果由于開發(fā)的食品安全中各類農(nóng)獸藥有害殘留EMIT快速大通量檢測試劑盒，采用自有知識產(chǎn)權(quán)的酶標記反應(yīng)技術(shù)，檢測準確度和效率相比之前的篩查方法有極大的提高； 結(jié)合全自動化智能性生化分析儀的高靈敏度及高速性，可實現(xiàn)每天1萬份的快速大通量檢 測。每份樣本可同時檢測高達上百種藥物及其代謝產(chǎn)物，這是任何其它方法無法代替的，已 成為發(fā)展現(xiàn)代分析儀器的重要發(fā)展方向之一。應(yīng)用領(lǐng)域廣，集高度并行性、特異性強、精確 度高、檢測速度快、大通量檢測等優(yōu)點于一體；在實際應(yīng)用中可以大大降低勞動強度和提高 工作效率，節(jié)省能源及成本等，解決傳統(tǒng)方法耗時長、精度低。另外，開發(fā)的技術(shù)平臺是與國 際相接軌的，達到了國際領(lǐng)先水平，更重要的是該技術(shù)平臺還可用于人體唾液、尿液、頭發(fā) 中微量毒品檢測，具有十分廣泛的應(yīng)用前景和社會意義。本發(fā)明中開發(fā)的產(chǎn)品不僅靈敏度 高，而且可以同時檢測上百個化合物及代謝產(chǎn)物，檢測快速、準確，檢測數(shù)據(jù)可自動處理、打 印，也可連接互聯(lián)網(wǎng)實現(xiàn)同步監(jiān)控。


圖1為與抗體結(jié)合后的酶標記半抗原圖；圖2為與抗體結(jié)合后的樣本中半抗原圖；圖3為游離酶標半抗原圖；圖4為反應(yīng)式原理圖；圖5實施例一萊克多巴胺試劑盒檢測標準曲線圖；圖6實施例二克倫特羅試劑盒檢測標準曲線圖；圖7實施例三苯二氮卓EMIT檢測標準曲線圖。
實施例具體實施方式
下面對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一萊克多巴胺均相酶免放大技術(shù)產(chǎn)品1半抗原的制備將0. Sg萊克多巴胺與0. 3g醋酸酐溶于20ml四氫呋喃中，加入0. 5ml 二乙胺后， 加熱回流12小時。在減壓下除取溶劑后，加入IOml鹽酸溶液(0. 1N)，用30ml乙酸乙酯萃 取目標半抗原。除去乙酸乙酯后，所得半固態(tài)物(0.75g)溶于IOml甲醇中。直接用于下一 步完全抗原的合成。2抗原的合成取上述甲醇溶液Iml (75mg半抗原)，減壓除去溶劑，剩余物溶于0. 5ml 二甲酰胺 (DMF)中，加入0. Ig DCC和0. 03g氮羥基丁二酰胺，室溫下反應(yīng)2小時后，將反應(yīng)物分批加 到5ml蛋白質(zhì)如BSA (0. 3g)或BTG、KLH磷酸鹽緩沖液中(pH 7. 5)。所得溶液在室溫下反 應(yīng)12小時，4°C透析(4X4L)。然后溶于250ml中性磷酸鹽緩沖液(0. 1M，pH 7. 0)中。3抗體制備將所得完全抗原按常規(guī)方法接種實驗動物(兔)，加強免疫后取抗血清。4酶標抗原的制備從抗原的合成中所制得的活化的萊克多巴胺半抗原IOmg溶于0. 2ml的DMF溶劑 中。稱取G6PDH酶10mg，溶于Iml磷酸鹽緩沖液(0. 1M)中。混合上述兩溶液，室溫下攪拌 2小時，再透析2天(4X4L)。
5均相酶聯(lián)試劑的制備1) RA試劑的制備將抗體制備中所制得的抗體加到0. OlM的Tris緩沖液(pH5. 5)，其中含有0. 2% 的酶底物NAD?？贵w與緩沖液的比例可從1 50到1 10000。2) RE試劑的制備將酶標抗原的制備中所制得的萊克多巴胺酶結(jié)合物加入到0. IM的Tris緩沖液 (pH7. 5 8. 5)，其中含有0. 的BSA。酶聯(lián)物稀釋比例可從1 100到1 10000。調(diào)節(jié) 抗體和酶聯(lián)結(jié)合物在緩沖液中的濃度，以便優(yōu)化測定工作曲線范圍。6豬尿中萊克多巴胺含量的測定取20ml豬尿與50 150ml的RA試劑在20 37°C下反應(yīng)1至10分鐘，加入RE試 劑(50 150μ 1)，測定340nm處的吸光度變化。以下數(shù)據(jù)是由全自動生化儀Oympus 400E 所測得的數(shù)據(jù)萊克多巴胺試劑盒檢測結(jié)果表 實施例二 鹽酸克倫特羅均相酶免放大技術(shù)產(chǎn)品1半抗原和全抗原的制備方法同實施例一半抗原的制備和實施例一抗原的合成。2抗體制備將所得完全抗原按常規(guī)方法接種實驗動物(兔)，加強免疫后取抗血清。3酶標抗原的制備方法同實施例一酶標抗原的制備。4均相酶聯(lián)試劑的制備方法同實施例一均相酶聯(lián)試劑的制備。5豬尿中克倫特羅含量的測定操作過程同實施例一。以下數(shù)據(jù)是由全自動生化儀Oympus 400E所測得的數(shù)據(jù)克倫特羅試劑盒檢測結(jié)果
實施例三苯二氮卓類化合物均相酶免放大技術(shù)產(chǎn)品本專利首次報道檢測靈敏度達lng/ml苯二氮卓類均相酶免放大技術(shù)產(chǎn)品，而傳 統(tǒng)方法只能達到lOng/ml左右。本專利使用一種人工合成的改良的特異G6PDH酶，成功將 檢測靈敏度提高了 10倍左右，其檢測數(shù)據(jù)如下(全自動生化儀Oympus 400E)苯二氮卓EMIT檢測結(jié)果表
權(quán)利要求
一種均相的免疫檢測試劑，其特征在于利用均相的免放大反應(yīng)的方法測定動物體液和組織萃取液中有害物質(zhì)殘留量。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的均相免疫檢測試劑，其特征在于所指的均相免放大反應(yīng)是指待測 的樣品和試劑均為液相，測定過程中不存在分離步驟，樣品與抗體反應(yīng)后再加入標記的抗 原進行反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利1所述的均相免疫檢測試劑，其特征在于所指的動物體液和組織可包括動 物尿液、血液、動物內(nèi)臟或肌肉等的體液和組織；
4.根據(jù)權(quán)利1所述的均相免疫檢測試劑，其特征在于所指的有害物質(zhì)殘留包括常用 有機小分子藥品和違禁藥品，包含鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、三聚氰胺、孔雀石綠、苯二氮 卓、三環(huán)類抗抑郁藥和各種抗菌素類藥物。
5.根據(jù)權(quán)利1所述的均相的免疫檢測試劑，其特征在于由于以下部分組成，由分析的 樣品和針對目標分析物(原藥或藥物主要代謝物)的單克隆或多克隆抗體(試劑A)以及 原藥或藥物主要代謝物與標記抗原如特定酶(G6PDH)標記的抗原(試劑B)，其標記物可以 是除酶以外的化學(xué)發(fā)光物或其它標記物，如膠體金、乳膠顆粒、染料等。
6.根據(jù)權(quán)利1所述的均相的免疫檢測試劑，其特征在于由以下的化合物所獲得的抗體 和標記的物用于均相免疫反應(yīng)中。
7.根據(jù)權(quán)利1所述的均相的免疫檢測試劑，其特征在于均相酶聯(lián)放大技術(shù)產(chǎn)品中所用 的緩沖液包括常用磷酸鹽(PBS) ,Tris, HEPES等緩沖液。
8.根據(jù)權(quán)利1所述的均相的免疫檢測試劑，其特征在于所用的半抗原連接到大分子 上，方法包括常用的重氮法、酸酐法、活化酯法等。
9.根據(jù)權(quán)利1所述的均相的免疫檢測試劑，其特征在于分子式為
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種均相免疫檢測試劑，本發(fā)明采用利用均相酶免放大反應(yīng)的方法測定動物體液和組織萃取液中有害物質(zhì)殘留量，能對有害物質(zhì)殘留包括常用有機小分子藥品和違禁藥品，包含鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、三聚氰胺、孔雀石綠、苯二氮卓、三環(huán)類抗抑郁藥和各種抗菌素類藥物進行檢測，具有十分廣泛的應(yīng)用前景和社會意義。本發(fā)明中開發(fā)的產(chǎn)品不僅靈敏度高，而且可以同時檢測上百個化合物及代謝產(chǎn)物，檢測快速、準確，檢測數(shù)據(jù)可自動處理、打印，也可連接互聯(lián)網(wǎng)實現(xiàn)同步監(jiān)控。
文檔編號G01N21/31GK101929998SQ20091003348
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者王國洪, 王志洪 申請人:常州賽德瑞爾生物科技有限公司