本發(fā)明涉及食品檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種食品中沙丁胺醇的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
β-腎上腺素受體激動(dòng)劑，簡(jiǎn)稱β-激動(dòng)劑，是動(dòng)物源性食品中檢出率最高、危害最嚴(yán)重的化學(xué)性殘留危害物。我國(guó)農(nóng)業(yè)、衛(wèi)生及食品藥品監(jiān)督管理等部門均明令禁止在畜禽養(yǎng)殖和食用農(nóng)產(chǎn)品中添加β-激動(dòng)劑。
沙丁胺醇為選擇性β2受體激動(dòng)劑，能有效地抑制組胺等致過敏性物質(zhì)的釋放，防止支氣管痙攣。作為藥物，沙丁胺醇廣泛用于治療哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，但攝入過量對(duì)人體危害較大，對(duì)于高血壓、糖尿病等患者尤其危險(xiǎn)。人如果攝入量過大或無病攝入該藥，就可能出現(xiàn)副作用或中毒事故，表現(xiàn)為：肌肉震顫、心悸、神經(jīng)過敏、頭痛、肌肉痛、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、戰(zhàn)栗。
目前，沙丁胺醇?xì)埩袅砍Ｓ玫膬x器分析檢測(cè)高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等。由于上述檢測(cè)方法的樣品前處理均需要使用凈化裝置，包括C18柱、石墨化碳固相萃取柱、弗羅里硅土固相萃取柱、硅膠SPE固相萃取柱等。上述固相萃取柱價(jià)格昂貴，約為500～2000元/支，且凈化步驟繁瑣，需要多種有機(jī)溶劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種低成本、分離操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的食品中沙丁胺醇的檢測(cè)試劑盒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種食品中沙丁胺醇的檢測(cè)試劑盒，包括偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠、復(fù)溶液和磁鐵；所述的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠是由沙丁胺醇單克隆抗體與磁珠的質(zhì)量比為1：20～40混合并溶于二（2-羥乙基）亞胺基三（羥甲基）甲烷緩沖液中偶聯(lián)制備而成；所述的沙丁胺醇單克隆抗體是由沙丁胺醇半抗原與兔血清白蛋白得到的偶聯(lián)物作為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得；所述的沙丁胺醇半抗原是采用混合酸酐法將沙丁胺醇與雞卵清白蛋白偶聯(lián)而得。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的沙丁胺醇半抗原的具體制備步驟為：將0.5mmol硫酸沙丁胺醇溶于15～18ml無水乙醇中，加入0.5mmol戊二酸酐，室溫下反應(yīng)3.6～4.0h，離心，將下層固體溶于12～16ml的N，N-二甲基甲酰胺，加入0.5mmol三正丁胺和0.5mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)2.0～2.5h；將上述反應(yīng)液加入到14～18ml含有7～8mg/ml雞卵清白蛋白的磷酸緩沖液中，室溫反應(yīng)過夜；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖液透析4～5次，冷凍干燥，得到沙丁胺醇半抗原。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的復(fù)溶液為含有0.55～0.70wt.%兔血清白蛋白、0.06～0.08wt.%吐溫-20、0.01～0.015wt.%大慶霉素的磷酸鹽緩沖液，偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠在復(fù)溶液中保存。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：或者含有0.58～0.62wt.%兔血清白蛋白、0.10～0.12wt.%吐溫-20、0.008～0.012wt.%大慶霉素的pH值7.3～7.5的三羥甲基氨基甲烷-硼酸電泳緩沖液，偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠在復(fù)溶液中保存。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的磁鐵產(chǎn)生外加磁場(chǎng)，使偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠聚集在磁鐵上，達(dá)到分離磁珠的目的。
利用所述的食品中沙丁胺醇的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法，步驟為：用試劑盒進(jìn)行樣品中沙丁胺醇的分離富集；將富集有沙丁胺醇的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠用甲醇洗脫，回收甲醇液，用于檢測(cè)分析。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
1、本發(fā)明試劑盒具有較高的特異性和準(zhǔn)確性，對(duì)沙丁胺醇的捕獲濃度可達(dá)到25μg/g（每克免疫磁珠可以捕獲25μg沙丁胺醇），樣品添加回收率≥88.2%；
2、本發(fā)明試劑盒中的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠與液體經(jīng)磁力作用容易快速分離開來，分離過程簡(jiǎn)單，可省去離心和過濾等繁瑣的操作過程，節(jié)約時(shí)間，在撤去外加磁場(chǎng)時(shí)，磁珠無磁性記憶，能夠均勻分散，不出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；
3、磁珠具有一定的機(jī)械度和化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受一定濃度的酸堿溶液和微生物的降解，其結(jié)構(gòu)內(nèi)的磁性物質(zhì)不易被氧化，磁性微粒的這種物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定特點(diǎn)，使其磁性不易下降；
4、磁珠的潤(rùn)洗和洗脫分別用去離子水和甲醇，0.1mL的偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠只需10mL去離子水潤(rùn)洗、0.5mL甲醇洗脫即可，所用試劑的量較少，磁珠的潤(rùn)洗和洗脫過程較環(huán)保。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實(shí)施例1
本發(fā)明實(shí)施例中，一種食品中沙丁胺醇的檢測(cè)試劑盒，包括偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠、復(fù)溶液和磁鐵，偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠是由沙丁胺醇單克隆抗體與磁珠的質(zhì)量比為1：20～40混合并溶于二（2-羥乙基）亞胺基三（羥甲基）甲烷緩沖液中偶聯(lián)制備而成，沙丁胺醇單克隆抗體是由沙丁胺醇半抗原與兔血清白蛋白得到的偶聯(lián)物作為免疫原免疫Balb/c小鼠制備獲得；復(fù)溶液為含有0.55～0.70wt.%兔血清白蛋白、0.06～0.08wt.%吐溫-20、0.01～0.015wt.%大慶霉素的磷酸鹽緩沖液或者含有0.58～0.62wt.%兔血清白蛋白、0.10～0.12wt.%吐溫-20、0.008～0.012wt.%大慶霉素的pH值7.3～7.5的三羥甲基氨基甲烷-硼酸電泳緩沖液，偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠在復(fù)溶液中保存。磁鐵產(chǎn)生外加磁場(chǎng)，使偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠聚集在磁鐵上，達(dá)到分離磁珠的目的。
一、試劑盒的各組分的制備
1、沙丁胺醇半抗原合成
將0.5mmol硫酸沙丁胺醇溶于15～18ml無水乙醇中，加入0.5mmol戊二酸酐，室溫下反應(yīng)3.6～4.0h，離心，將下層固體溶于12～16ml的N，N-二甲基甲酰胺，加入0.5mmol三正丁胺和0.5mmol氯甲酸異丁酯，繼續(xù)反應(yīng)2.0～2.5h；將上述反應(yīng)液加入到14～18ml含有7～8mg/ml雞卵清白蛋白的磷酸緩沖液中，室溫反應(yīng)過夜（大約16h）；將上述反應(yīng)液用磷酸緩沖液透析4～5次，冷凍干燥，得到沙丁胺醇半抗原。
2、免疫原的制備
取8～10mL沙丁胺醇半抗原，溶解于1mLN,N-二甲基甲酰胺中，得到沙丁胺醇半抗原溶液；取25～30mg二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺用0.2～0.5mL水充分溶解后，加入沙丁胺醇半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取兔血清白蛋白50mL，使之充分溶解在4mL的pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液中，接著緩慢滴加反應(yīng)液A，并于室溫下攪拌24h；用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液于4℃透析3天，每天換5次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到沙丁胺醇免疫原；分裝，于-20℃保存，得免疫原，備用。
3、沙丁胺醇單克隆抗體的制備
1）動(dòng)物免疫：用上述制備出的免疫原按100μg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復(fù)合物100μg/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。
2）細(xì)胞融合：按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞混合，然后在45秒內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的聚乙二醇4000進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37℃，5wt.%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時(shí)候進(jìn)行全換液。
3）雜交瘤細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初選采用間接酶聯(lián)免疫吸附方法，以包被抗原（預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽(yáng)性血清稀釋度）包被酶標(biāo)板，加入被測(cè)孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液50μL，再加入細(xì)胞上清液50μL和羊抗鼠IgG-HRP50μL，于37℃反應(yīng)30min，洗板，再加入底物顯色液100μL，于25℃下避光反應(yīng)15min，再加入終止液50μL，測(cè)定OD450nm值下降到對(duì)照孔的50%以下，判為陽(yáng)性，經(jīng)3次檢測(cè)都為陽(yáng)性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。
4）單克隆抗體制備：將3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定效價(jià)，凍存；并取8～10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL/只，7～10日后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1～2×106/只，7～10日后抽取小鼠腹水，離心取上清，測(cè)定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆谩?/p>
5、偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠的制備
1）磁珠活化
表面有-COOH基團(tuán)的磁珠（購(gòu)于DYNAL，粒徑為2.8μm），其含量是0.1eq/g～0.3eq/g，取100μL磁珠，用含有pH值5.0、0.05wt.％的吐溫-20的濃度為20mmol/L的二（2-羥乙基）亞胺基三（羥甲基）甲烷緩沖液100mL洗滌兩次，磁分離后移除上清；磁珠活化前，用4℃貯存的含有pH值5.0、0.05wt.％的吐溫-20的濃度為20mmol/L的二（2-羥乙基）亞胺基三（羥甲基）甲烷緩沖液分別配制50mmol/L的二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺溶液；分別向裝有磁珠的離心管中加入新配置的二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺溶液各50μL，渦旋混勻，室溫活化30min；將離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁分離4min，移除上清液，再向其中加入100μL、pH值5.0、20mmol/L的二（2-羥乙基）亞胺基三（羥甲基）甲烷緩沖液清洗3次后即可得到表面有羧基活化的磁珠。
2)偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠的制備
將5μg沙丁胺醇單克隆抗體溶解到60μL、pH值5.0、20mmol/L的二（2-羥乙基）亞胺基三（羥甲基）甲烷緩沖液中，向其中加入5mg活化的磁珠，或?qū)?0μg沙丁胺醇單克隆抗體溶解到60μL、pH5.0、20mmol/L的二（2-羥乙基）亞胺基三（羥甲基）甲烷緩沖液中，向其中加入5mg活化的磁珠，并用20mmol/L的二（2-羥乙基）亞胺基三（羥甲基）甲烷緩沖液定容至100μL，輕柔地混勻磁珠與沙丁胺醇單克隆抗體；4℃偶聯(lián)2h，期間利用渦旋儀使磁珠保持混勻狀態(tài)；離心管置于磁分離架上進(jìn)行磁分離5min，移除上清液；為了淬滅未反應(yīng)的-COOH，可加入100μL，pH值7.3～7.4的三羥甲基氨基甲烷反應(yīng)15min或100μL、pH值8.0、乙醇胺濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液封閉磁珠；用100μL、0.2wt.%兔血清白蛋白、0.1wt.%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液清洗封閉好的磁珠4次，將磁珠復(fù)溶于含0.2wt.%的兔血清白蛋白、0.08wt.%吐溫-20、0.02wt.%NaN3的磷酸鹽緩沖液中，于4℃保藏。
二、試劑盒的組建
組建檢測(cè)沙丁胺醇磁免疫磁珠分離富集試劑盒，使其含有下列組分：
偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠
復(fù)溶液
磁鐵
將偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠加入到復(fù)溶液中，至終濃度為8mg/mL。
三、試劑盒對(duì)樣品中沙丁胺醇的分離富集方法
1）取溶有偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠復(fù)溶液0.1mL于10mL離心管中，用5mL去離子水潤(rùn)洗磁珠1次，將離心管在磁鐵上靜置4min，確保磁珠全部吸附在磁鐵上，每次用磁鐵分離磁珠和洗液；
2）將組織樣本用均質(zhì)器均質(zhì)后，稱取5.0±0.05g樣品至樣品瓶中，分別加入1.5±0.05g氯化鈉，20mL50%甲醇溶液，用渦旋儀渦旋5min，室溫下3000r/min離心5min，取5mL離心上清液與5mL去離子水混勻，再與偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠混勻，在室溫下反應(yīng)20min；
3）反應(yīng)完成后，用磁鐵分離磁珠，用5mL去離子水清洗磁珠，清洗兩次；
4）將0.5mL甲醇加入到裝有經(jīng)過步驟3）清洗過的磁珠的10mL離心管中，混勻，靜置1min，用磁鐵分離磁珠，回收甲醇溶液，用于檢測(cè)分析。
四、試劑盒質(zhì)量的測(cè)定
1、試劑盒的捕獲量和回收率
試劑盒捕獲量的定義為：每毫克偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠可以捕獲沙丁胺醇的最大量。制備沙丁胺醇濃度分別為10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL樣品溶液，每份豬肉、豬肝、牛肉、羊肉樣品溶液為1mL，取沙丁胺醇單克隆抗體免疫磁珠0.1mL分別加入至上述樣品中，用試劑盒進(jìn)行樣品中沙丁胺醇的分離和富集，并用沙丁胺醇酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒對(duì)用偶聯(lián)沙丁胺醇單克隆抗體的磁珠處理過樣品進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得結(jié)果如下：樣品中沙丁胺醇濃度為10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL和25ng/mL時(shí)，經(jīng)上述食品中沙丁胺醇的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品中沙丁胺醇進(jìn)行分離富集后，檢測(cè)得出沙丁胺醇添加回收率范圍為93.6～99.8%，當(dāng)樣品中沙丁胺醇濃度為30ng/mL時(shí)，得出沙丁胺醇添加回收率范圍為88.2～91.4%，表明食品中沙丁胺醇的檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品中沙丁胺醇的捕獲量為25ng/mL。
2、特異性
以沙丁胺醇作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率為100%，用于試劑盒交叉反應(yīng)性研究的藥物均為與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物：克侖特羅、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、溴氯布特羅、溴布特羅、特布他林、羥甲基沙丁胺醇、西馬特羅、妥布特羅、馬噴特羅、賽布特羅、克侖潘特、齊帕特羅、噴布特羅、克侖丙羅、馬布特羅、氯丙那林。豬尿、牛尿、羊尿、飼料、豬肉、豬肝、牛肉、羊肉樣品中分別添加上述18種藥物（包括沙丁胺醇）濃度為20ng/mL，按試劑盒步驟操作，對(duì)樣品中沙丁胺醇進(jìn)行分離富集后，再檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示試劑盒對(duì)沙丁胺醇具有較高的特異性，對(duì)與沙丁胺醇結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物均無交叉反應(yīng)。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。