本發(fā)明涉及免疫測(cè)定法技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在歐美國家較為常見，是男性最常見的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的第二位。我國是傳統(tǒng)的前列腺癌發(fā)病率較低的國家，但是近年來隨著人民生活水平的提高，環(huán)境的改變，以及疾病篩查普及率的提高，我國的前列腺癌發(fā)病率正在逐年上升。前列腺癌已成為威脅我國男性健康的一種重要疾病，正在受到越來越多的關(guān)注和重視。

前列腺癌最重要的治療方式之一就是去勢(shì)療法，包括藥物抗雄激素治療以及手術(shù)去勢(shì)治療，以阻止雄激素結(jié)合到雄激素受體上的方式來抑制腫瘤的生長。在前列腺癌早期，去勢(shì)治療有較好的效果，但是經(jīng)過一段時(shí)間的治療之后，前列腺癌逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆缘?，?duì)去勢(shì)治療不再敏感，病情再度惡化，即去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)階段。去勢(shì)抵抗性前列腺癌的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，也沒有較好的治療方法，是前列腺癌基礎(chǔ)與臨床領(lǐng)域的難題。

目前對(duì)于去勢(shì)抵抗性前列腺癌的診斷并沒有很好的方法，主要是依靠監(jiān)測(cè)前列腺特異性抗原和睪酮的變化，以及根據(jù)臨床表現(xiàn)來綜合判斷，缺乏較好的特異性，不能準(zhǔn)確地判斷出去勢(shì)抵抗性前列腺癌。及早地發(fā)現(xiàn)去勢(shì)抵抗性前列腺癌，對(duì)后期治療策略的制定和對(duì)前列腺癌更加深入地從分子水平認(rèn)識(shí)，有著非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的產(chǎn)品或方法特異性差、準(zhǔn)確性不高的問題，所提出的一種用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒及檢測(cè)方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，包括分別包被ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體的ELISA酶標(biāo)板；標(biāo)準(zhǔn)品；樣本稀釋液；生物素標(biāo)記的ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體；親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶；洗滌液；底物溶液；反應(yīng)終止液和覆膜。

進(jìn)一步的，所述樣本稀釋液制備過程如下：取100mLPBS溶液，向其加入2g BSA，至最終質(zhì)量濃度為2％，充分混勻，避免起泡。

進(jìn)一步的，所述洗滌液的制備過程如下：將0.5mL 0.05％Tween-20加入到1000mL PBS緩沖液中。

進(jìn)一步的，所述分別包被ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體的ELISA酶標(biāo)板中的包被抗體濃度為1-100μg/mL，所述生物素標(biāo)記的ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體的濃度為0-100μg/mL，所述親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶濃度0.0001-0.0005mg/mL，所述樣品為前列腺癌患者的血清；所述底物溶液為TMB(四甲基聯(lián)苯胺)的質(zhì)量濃度為0.01％；所述反應(yīng)終止液為2mol/L H₂SO₄。

進(jìn)一步的，所述分別包被ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體的ELISA酶標(biāo)板中的包被抗體濃度優(yōu)選為10μg/mL。

進(jìn)一步的，所述生物素標(biāo)記的ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體的濃度優(yōu)選10μg/mL。

用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟一：采集前列腺癌患者全血樣品，2000rpm 20min離心，取上清液，收集血液的試管為一次性的無熱原、無內(nèi)毒素的試管；

步驟二：將各試劑平衡至室溫，待測(cè)樣品孔每孔分別加樣品血清100μL，每個(gè)樣品平行檢測(cè)2孔，同時(shí)設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照各兩孔，取標(biāo)準(zhǔn)品β-actin 10ng、ACTG1 2000pg、FGγ1000ng各100μL分別加入反應(yīng)孔中，空白對(duì)照孔僅加入100μL樣品稀釋液；酶標(biāo)板加覆膜，37℃孵育90min；

步驟三：棄去孔內(nèi)液體，甩干；三個(gè)檢測(cè)板每孔分別加入生物素標(biāo)記的ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體各100μL，酶標(biāo)板加覆膜，37℃溫育1h；

步驟四：棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌酶標(biāo)板1-5次，每次用洗滌液浸泡1-2min，再甩干；

步驟五：每孔加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶100μL，酶標(biāo)板加覆膜，37℃溫育30min；

步驟六：棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌酶標(biāo)板3-7次，每次用洗滌液浸泡1-2min，再甩干；

步驟七：每孔加入底物溶液(TMB)90μL，酶標(biāo)板加覆膜，37℃避光孵育15-30min；

步驟八：每孔加入反應(yīng)終止液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色變?yōu)辄S色；

步驟九：用酶標(biāo)儀(SPECTRA max plus384)在450nm波長下測(cè)量各孔的光密度(OD值)；

步驟十：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值計(jì)算血清樣本ACTG1、β-actin、FGγ的檢測(cè)值；

將三個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)值代入logistic模型：logit P＝0.000014*ACTG1+0.029528*β-actin+0.000013*FGγ-12.705065，計(jì)算出P值，并判斷其與判定閾值的大小關(guān)系。

進(jìn)一步的，所述步驟四洗滌酶標(biāo)板3次，每次浸泡1.5min；所述步驟六洗滌酶標(biāo)板5次，每次浸泡1.5min。

進(jìn)一步的，所述判定閾值P為0.5171589～0.6320831。

進(jìn)一步的，所述判定閾值P為0.5746210。

若P值大于等于判定閾值時(shí)，則判斷患者已進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌，若P值小于判定閾值則判斷患者未進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明有效的解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的產(chǎn)品或方法特異性差、準(zhǔn)確性不高的問題。本發(fā)明試劑盒根據(jù)血清中ACTG1、β-actin、FGγ的含量來診斷去勢(shì)抵抗性前列腺癌，具有較高的靈敏度和特異度。本發(fā)明試劑盒操作簡(jiǎn)單快速、合理可行，可提高去勢(shì)抵抗性前列腺癌的診斷效率，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明檢測(cè)血清樣本的結(jié)果繪制圖。

圖2為本發(fā)明去勢(shì)抵抗性前列腺癌診斷的ROC曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于所給出的實(shí)施例：

實(shí)施例1：

用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒，包括分別包被ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體的ELISA酶標(biāo)板；標(biāo)準(zhǔn)品；樣本稀釋液；生物素標(biāo)記的ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體；親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶；洗滌液；底物溶液；反應(yīng)終止液和覆膜。

樣本稀釋液制備過程如下：取100mLPBS溶液，向其加入2g BSA，至最終質(zhì)量濃度為2％，充分混勻，避免起泡。

洗滌液的制備過程如下：將0.5mL 0.05％Tween-20加入到1000mL PBS緩沖液中。

分別包被ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體的ELISA酶標(biāo)板中的包被抗體濃度為10μg/mL。

生物素標(biāo)記的ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體的濃度10μg/mL。

用于檢測(cè)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的ELISA試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

步驟一：采集前列腺癌患者全血樣品，2000rpm 20min離心，取上清液，收集血液的試管為一次性的無熱原、無內(nèi)毒素的試管；

步驟二：將各試劑平衡至室溫，待測(cè)樣品孔每孔分別加樣品血清100μL，每個(gè)樣品平行檢測(cè)2孔，同時(shí)設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照各兩孔，取標(biāo)準(zhǔn)品β-actin 10ng、ACTG1 2000pg、FGγ1000ng各100μL分別加入反應(yīng)孔中，空白對(duì)照孔僅加入100μL樣品稀釋液；酶標(biāo)板加覆膜，37℃孵育90min；

步驟三：棄去孔內(nèi)液體，甩干；三個(gè)檢測(cè)板每孔分別加入生物素標(biāo)記的ACTG1抗體、β-actin抗體和FGγ抗體各100μL，酶標(biāo)板加覆膜，37℃溫育1h；

步驟四：棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌酶標(biāo)板3次，每次用洗滌液浸泡1.5min，再甩干；

步驟五：每孔加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶100μL，酶標(biāo)板加覆膜，37℃溫育30min；

步驟六：棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗滌酶標(biāo)板5次，每次用洗滌液浸泡1.5min，再甩干；

步驟七：每孔加入底物溶液(TMB)90μL，酶標(biāo)板加覆膜，37℃避光孵育15min，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止；

步驟八：每孔加入反應(yīng)終止液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色變?yōu)辄S色；

步驟九：用酶標(biāo)儀(SPECTRA max plus384)在450nm波長下測(cè)量各孔的光密度(OD值)；

步驟十：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值計(jì)算血清樣本ACTG1、β-actin、FGγ的檢測(cè)值；

將三個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)值代入logistic模型：logit P＝0.000014*ACTG1+0.029528*β-actin+0.000013*FGγ-12.705065，計(jì)算出P值，并判斷其與判定閾值的大小關(guān)系。

判定閾值P為0.5746210，若P值大于等于0.5746210時(shí)，則判斷患者已進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌，若P值小于0.5746210則判斷患者未進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌。在本實(shí)施例的85例樣本中，使用本發(fā)明試劑盒診斷去勢(shì)抵抗性前列腺癌的敏感性為78％，特異性為90.9％。

本實(shí)施例的血清樣本的檢查值繪制在圖1中，兩組比較P＜0.05，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2為P值作為去勢(shì)抵抗性前列腺癌診斷的ROC曲線，橫坐標(biāo)為1-特異度，縱坐標(biāo)為靈敏度，AUC＝0.902，其中ROC表示曲線下面積。從圖中可以看出，靈敏度達(dá)到78％，特異度達(dá)到90.9％。

可見，采用本發(fā)明檢測(cè)前列腺癌患者血清中ACTG1、β-actin、FGγ的含量，可快速準(zhǔn)確地診斷去勢(shì)抵抗性前列腺癌，具有較高的靈敏度和特異度。