專利名稱：乙型肝炎五項指標集成檢測反應板和試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于體外臨床診斷檢測技術領域，確切地說，屬于一種適于乙型肝炎五項指標(HBsAg\抗-HBs\HBeAg\抗-HBe\抗-HBc)集成檢測的反應板和試劑盒。
背景技術：
HBsAg、抗-HBs、HbeAg、抗-Hbe、抗-HBc檢測是乙型肝炎診斷的五項最為常用的指標，目前多使用的固相酶免分析法(ELISA)進行單指標檢測。
ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，也可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。
ELISA法的類型包括雙抗體夾心法、雙抗原夾心法、間接法、競爭法等。
雙抗體夾心法其原理及操作步驟為1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2)加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。
3)加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量雙抗原夾心法其原理及操作步驟為反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。
競爭法其原理及操作步驟為當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBcELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應?？笻Be的檢測一般采用此法。
在乙肝五項中，HBsAg、HbeAg二項常用雙抗體夾心法，抗-HBs常用雙抗原夾心法，抗-Hbe、抗-HBc常用競爭法。目前現有的檢測方法最大的缺點是每個反應孔一次只能檢測一個指標，檢測效率低。
因此，本領域迫切需要開發(fā)能夠同時檢測乙型肝炎五項指標(HBsAg\抗-HBs\HBeAg\抗-HBe\抗-HBc)的檢測反應板和試劑盒。

發(fā)明內容
本實用新型的目的就是提供一種能夠同時檢測乙型肝炎五項指標(HBsAg\抗-HBs\HBeAg\抗-HBe\抗-HBc)的檢測反應板和試劑盒。該反應板和試劑盒可簡便快速地同時檢測多人份的乙型肝炎五項指標。
在本實用新型的第一方面，提供了一種乙肝五項集成檢測反應板，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括1-200個樣本孔，2-5個陰性對照孔，1-3個陽性質控孔，其中，其特征在于每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著HBsAg、HBeAg二種抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三種抗體的蛋白質微點陣。
在一優(yōu)選例中，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
在另一優(yōu)選例中，所述樣本孔的數量為5-50個。
在另一優(yōu)選例中，所述的HBsAg、HBeAg二種抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三種抗體在固相載體上各有3個點樣點。
在本實用新型的第二方面，提供了一種乙肝五項集成檢測試劑盒，它包括本實用新型上述的乙肝五項集成檢測反應板。
在另一優(yōu)選例中，還包括酶結合物、反應液和檢測液、陰性對照、陽性質控品。
在另一優(yōu)選例中，所述的反應液由HRP標記的抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc混合組成，所述的檢測液由發(fā)光物和過氧化氫二種試劑組成，使用前混合。
在另一優(yōu)選例中，所述的發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。


圖1是本實用新型一種固相載體上乙肝抗原和抗體的點樣示意圖。
圖2是在本實用新型的反應孔中進行的各抗原一抗體反應的示意圖。
具體實施方式
乙型肝炎五項指標集成檢測的關鍵和難點是，HBsAg與抗-HBs、HbeAg與抗-HBe的難以同時檢測。本實用新型經過深入而廣泛的研究，對檢測反應板作了改進，在本實用新型中檢測抗原用雙抗體夾心法，而檢測對應抗體用競爭法，從而解決了抗原及其抗體同時檢測的的問題。
具體而言，為提高乙肝五項(HBsAg、HbeAg、抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc)的檢測效率，本實用新型利用固相酶免分析原理，應用微點陣檢測技術和化學發(fā)光檢測技術設計了一種乙肝五項集成檢測反應板，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括1-200個樣本孔，2-5個陰性對照孔，1-3個陽性質控孔，其中，其特征在于每一反應孔的底部平面上有固相載體，且在固相載體上包被著HBsAg、HBeAg二種抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三種抗體的蛋白質微點陣。
各反應孔的數量沒有特別限制，通常樣本孔為1-200個，較佳地5-50個。陰性對照孔為2-5個，較佳地2-4個。陰性質控孔為1-3個，較佳地為2-3個。
在本實用新型中，反應孔的形狀和大小沒有特別限制，可以是圓形、方形、六角形、橢圓形、或其他如何形狀。大小通常為直徑0.1-5cm，深度為0.1-2cm。
在本實用新型中，反應板基板的材料可以選用本領域常用的各種材料，較佳的基材材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。
在本實用新型中，包被乙肝抗原或抗體的固相載體可以選用本領域常用的各種固相載體，包括(但并不限于)玻璃片、塑料片、硝酸纖維(NC)膜、PDVF膜等，較佳的固相載體包括NC、PDVF膜。
用于本實用新型的HBsAg、HBeAg二種抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三種抗體都可用常規(guī)方法制備或購得。此外，可采用本領域常規(guī)的各種包被方法將抗原或抗體包被在固相載體。
在固相載體上，HBsAg、HBeAg二種抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三種抗體各有2-5個點樣點，較佳地3個點樣點。此外，較佳地在固相載體上還包括一個定位點(見圖1)。各點樣點之間的距離通常為0.1-100mm。
另一方面，本實用新型還提供了一種乙肝五項集成檢測試劑盒，該試劑盒可實現多指標并行化、高通量檢測。它包括本實用新型的反應孔板、洗滌液、反應液、檢測液(A、B)、陰性對照、陽性質控品等。其中反應液由HRP標記的抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc混合組成，檢測液由發(fā)光物和過氧化氫二種試劑組成，發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾及其衍生物等，使用前混合。
在本實用新型中，HBsAg、HbeAg的檢測用雙抗體夾心法，抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc的檢測用競爭法，檢測原理如圖2所示。
本實用新型巧妙地綜合利用了固相酶聯(lián)免疫原理、蛋白質微點陣檢測技術和化學發(fā)光檢測技術，實現了乙型肝炎五種指標的同時檢測。
下面結合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應理解，這些實施例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1檢測反應板的制備取96孔板，設置90個樣本孔，3個陰性對照孔，3個陽性質控孔。在每個反應孔的底部放置一固相載體(NC膜或PDVF膜)，且在固相載體上包被著HBsAg、HBeAg二種抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三種抗體的蛋白質微點陣(圖1)。
實施例2試劑盒制備制備含一乙型肝炎五項指標集成檢測，它含有實施例1的反應孔板一塊(16-36人份)，洗滌濃縮液1瓶，反應液1瓶，檢測液A一瓶，檢測液B一瓶，陽性對照一瓶，陰性對照一瓶。
洗滌濃縮液、反應液、檢測液A、檢測液B、陽性對照和陰性對照與常規(guī)的單指標檢測乙型肝炎中所用的試劑相同。
實施例3乙型肝炎五項指標集成檢測按以下方法對各測試血清樣品進行檢測1、加待檢測血清或陰性對照、陽性質控于相應反應孔內，100ul/孔。
2、37℃保溫振蕩反應30分鐘。
3、用洗液洗滌4-6次，每次浸泡2分鐘。
4、每孔加反應液100ul/孔。
5、用洗液洗滌4-6次，每次浸泡2分鐘。
6、加檢測液20ul/孔，振動，使檢測液均勻分布于孔的底部。
7、用CCD檢測，視發(fā)光信號強度曝光30-60秒。
結果判定HBsAg、HbeAg樣本信號值/陰性對照值≥1.6抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc(陰性對照信號值-樣本信號值)/陰性對照信號值≥0.34與此同時，用常規(guī)方法對測試的血清樣品進行常規(guī)檢測。結果表明，用本實用新型的試劑盒得出的測試結果與常規(guī)方法相同。
在本實用新型提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本實用新型的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求1.一種乙肝五項集成檢測反應板，其特征在于，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括1-200個樣本孔，2-5個陰性對照孔，1-3個陽性質控孔，其中，其特征在于每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著HBsAg、HBeAg二種抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三種抗體的蛋白質微點陣。
2.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
3.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述樣本孔的數量為5-50個。
4.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述的HBsAg、HBeAg二種抗原和抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc三種抗體在固相載體上各有3個點樣點。
4.一種乙肝五項集成檢測試劑盒，其特征在于，它包括權利要求1所述的乙肝五項集成檢測反應板。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包括酶結合物、反應液和檢測液、陰性對照、陽性質控品。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的反應液由HRP標記的抗-HBs、抗-Hbe、抗-HBc混合組成，所述的檢測液由發(fā)光物和過氧化氫二種試劑組成，使用前混合。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
專利摘要本實用新型涉及乙型肝炎五項指標集成檢測反應板和試劑盒。所述的反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括1－200個樣本孔，2－5個陰性對照孔，1－3個陽性質控孔，其中每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著HBsAg、HBeAg二種抗原和抗－HBs、抗－Hbe、抗－HBc三種抗體的蛋白質微點陣。本實用新型的反應板和試劑盒可簡便快速地同時檢測多人份的乙型肝炎五項指標。
文檔編號G01N33/576GK2613760SQ03229889
公開日2004年4月28日 申請日期2003年3月31日 優(yōu)先權日2003年3月31日
發(fā)明者穆海東 申請人:穆海東