免疫組庫分析中樣品污染的檢測(cè)和定量的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和定量個(gè)體的包含T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的組織樣品中的核酸污染的方法，其用于產(chǎn)生基于序列的克隆型譜。在一個(gè)方面，本發(fā)明通過測(cè)量借以可將來自預(yù)期個(gè)體的核酸與非預(yù)期個(gè)體的核酸區(qū)分開的內(nèi)源性或外源性核酸標(biāo)簽的存在和/或水平來實(shí)現(xiàn)。內(nèi)源性標(biāo)簽包括遺傳身份標(biāo)志物，諸如短串聯(lián)重復(fù)序列、稀有克隆型等，且外源性標(biāo)簽包括用于確定來自序列讀段的克隆型序列的序列標(biāo)簽。
【專利說明】免疫組庫分析中樣品污染的檢測(cè)和定量
[0001] 本申請(qǐng)是W下每一個(gè)美國專利申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)案（continuation-in-part): 2013年3月15日提交的系列號(hào)13/835, 093和2013年3月15日提交的系列號(hào)13/834, 794， 并且要求來自W下的優(yōu)先權(quán)；2012年4月13日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/624, 002 ; 2012年6月11日提交的系列號(hào)61/658,317 ;2012年12月17日提交的系列號(hào)61/738, 277 ; 和2013年2月22日提交的系列號(hào)61/768, 269 ;前述申請(qǐng)的每一個(gè)通過應(yīng)用W其整體并入 本文。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 隨著DNA測(cè)序的每個(gè)堿基成本已經(jīng)下降，并且測(cè)序技術(shù)已變得更可靠和方便，正在 使用大規(guī)模DNA測(cè)序開發(fā)越來越多的診斷和預(yù)后應(yīng)用，例如，F(xiàn)址am和Willis,美國專利公 布 2010/0151471 ;Rreeman 等人，Genome Research, 19:1817-1824(2009) ;Boyd 等人，Sci. Transl.Med. 化a23(2009) ;He 等人，Oncotarget(March 8, 2011);化lomaki 等人 Genet. Med. , 14 (3) : 296-305 (2012) ;Kohlmann 等人，Semin. Oncol. , 39 (1) : 26-36 (2012)。 特別是，編碼免疫分子，諸如T細(xì)胞或B細(xì)胞受體，或其組分的核酸譜，包含了關(guān)于生物體 的健康或疾病的狀態(tài)的大量信息，使得已提出了此類譜作為用于各種狀況的診斷或預(yù)后指 標(biāo)的用途，例如F址am和Willis( W上引用）；Boyd等人（W上引用）；化等人（W上引 用）。此外，此類基于序列的譜能夠有比基于擴(kuò)增的編碼CDR區(qū)的尺寸分布、由微陣列序列 取樣、來自PCR擴(kuò)增子的雜交動(dòng)力學(xué)曲線或其他方法大得多的靈敏度，例如Morley等人，美 國專利 5, 418, 134 ;van Dongen 等人，Leukemia, 17:2257-2317 (2003) ;0gle 等人，Nucleic Acids Research, 31: el39 (2003) ;Wang 等人，BMC Genomics, 8:329(2007) ;Baum 等人， 化1:山"6 Methods, 3 (11) : 895-901 (2006)。
[0004] 然而，與在采用擴(kuò)增步驟的其他基于DNA的測(cè)定中一樣，污染或交叉污染DNA的存 在可降低采用免疫組庫（immune r巧ertoire)測(cè)序的測(cè)定中檢測(cè)的有效限值（effective limit)。污染DM的來源包括測(cè)定試劑、設(shè)備，操作者的處理、氣溶膠等，例如化ban等人， J.化rensic Sci.，45 化）：1307-1311 (2000) ;Kwok, 142-145 頁，于 Innis 等人，編著，PCR Protocols (Academic Press, 1990)。
[0005] 癌癥的微小殘留?。╩inimal residual disease, M畑）的檢測(cè)受該樣的污染 影響。對(duì)于許多癌癥進(jìn)行治療的患者常常保留與癌癥相關(guān)的MRD。目P，即使患者可具有 響應(yīng)于治療的由臨床測(cè)量的疾病的完全緩解，因某種原因或其他原因避開破壞的小部分 癌細(xì)胞可得W保留。該殘留群體的類型和尺寸是患者的繼續(xù)治療的重要預(yù)后因素，例 如 Campana'Hematol. Oncol. Clin. North Am. ,23 巧）：1083-1098(2009) ;Buccisano 等 人，Blood, 119(2) : 332-341 (2012)。因此，MRD的測(cè)量越靈敏，隨后的治療過程將越可能 成功，例如 Szcz巧anski 等人，Best Pract. Res. Clin.化ematol. , 15 (1) : 37-57 (2002)。 已開發(fā)了用于評(píng)估該群體的幾種技術(shù)，包括基于流式細(xì)胞儀、原位雜交、細(xì)胞遺 傳學(xué)、核酸標(biāo)志物的擴(kuò)增等的技術(shù)，例如Buccisano等人，化rrent化inion in 0ncology，21:582-588(2009) ;van Dongen 等人，Le址emia, 17 (12): 2257-2317 (2003);等。 由于此類區(qū)段（本文還稱為"克隆型（clonotype)")通常具有可用作用于其相關(guān)癌癥細(xì)胞 的分子標(biāo)簽的獨(dú)特序列，編碼重組免疫受體的區(qū)段（即克隆型）的核酸的基于PCR和序列 的分析對(duì)于評(píng)估白血病和淋己瘤中的M畑是特別有用的，例如Van Dongen等人（如上引 用）；F址am和Willis,美國專利公布2011/0207134 ;等。然而，此類技術(shù)的靈敏度仍受到來 自其他個(gè)體的交叉污染的存在的限制。
[0006] 鑒于基于序列的診斷和預(yù)后應(yīng)用的潛在影響，如果存在用于方便檢測(cè)并定量樣品 污染可用的方法，特別是在其中處理大量患者樣品的設(shè)置下使用免疫組庫測(cè)序的測(cè)定中， 將是非常期望的。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提出了用于檢測(cè)和定量免疫組庫測(cè)定中污染性核酸的方法。本發(fā)明舉例說 明了 一些實(shí)施方案和應(yīng)用，其中的一些列于W下及整個(gè)說明書中。
[0009] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于確定個(gè)體的包含T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的組織樣品的 克隆型譜（clonotype profile)中的污染水平的方法，其中所述方法包括W下步驟；（a)從 個(gè)體獲得組織樣品，該組織樣品包含來自個(gè)體和可能來自一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的核酸， 該核酸包括來自T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的重組核酸和非重組核酸；化）由組織樣品的核酸生 成克隆型譜；（C)測(cè)序來自組織樣品的核酸的一個(gè)或更多個(gè)基因座上的遺傳標(biāo)志物，W基 于根據(jù)遺傳標(biāo)志物的個(gè)體和一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的遺傳鑒定獲得來自一個(gè)或更多個(gè)其 他個(gè)體和來自所述個(gè)體的核酸的比例，其中遺傳標(biāo)志物出現(xiàn)在重組核酸和非重組核酸兩者 中存在的基因座上，W及（d)確定克隆型譜中的污染性核酸的水平為組織樣品的核酸中存 在的來自一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的核酸的比例。
[0010] 在另一個(gè)方面，W上方法還包括W下步驟；（i)測(cè)量所述組織樣品中所述核酸的 總量；（ii)測(cè)量所述組織樣品中所述重組核酸的總量；（iii)測(cè)序所述非重組核酸中存在 且所述重組核酸中不存在的核酸的可切除區(qū)段中的一個(gè)或更多個(gè)基因座上的遺傳標(biāo)志物， W獲得來自所述個(gè)體和來自所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的所述非重組核酸的比例；W及 (iv)由所述組織樣品的所述核酸中的污染性重組核酸的水平確定所述克隆型譜中的污染 性核酸的所述水平，污染性重組核酸的水平由W下來確定；核酸的總量、所述重組核酸的總 量、來自所述個(gè)體和來自所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的所述核酸的所述比例、W及所述個(gè) 體和所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的所述非重組核酸的比例。
[0011] 在另外的方面，本發(fā)明涉及用于確定個(gè)體的包含T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的組織樣品 的克隆型譜中相關(guān)克隆型的檢測(cè)限的方法，所述方法包括W下步驟；(a)從個(gè)體獲得組織 樣品，該組織樣品包含來自個(gè)體和可能來自一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的核酸，該核酸包括來 自T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的重組核酸和非重組核酸；化）由組織樣品的核酸生成克隆型譜； (C)測(cè)序來自組織樣品的核酸的一個(gè)或更多個(gè)基因座上的遺傳標(biāo)志物，W基于根據(jù)遺傳標(biāo) 志物的所述個(gè)體和所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的遺傳鑒定獲得來自一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè) 體和來自所述個(gè)體的核酸的比例，其中遺傳標(biāo)志物出現(xiàn)在重組核酸和非重組核酸兩者中存 在的基因座上，W及（d)確定檢測(cè)限為對(duì)于個(gè)體的一個(gè)或更多個(gè)基因座的任何等位基因的 水平為鄰近最高的任何所述遺傳標(biāo)志物的等位基因的水平（determining the limit of detection as the level of an allele of any of said genetic markers next highest to that of any allele of the one or more loci of the individual)。
[0012] 本發(fā)明的該些W上特征方面，W及其他方面W-些說明性的實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用來示例， 其中的一些示于附圖并表征于w下的權(quán)利要求書部分。然而，w上概述不意在描述本發(fā)明 的各個(gè)說明性實(shí)施方案或每個(gè)實(shí)現(xiàn)。
[0013] 附圖簡述
[0014] 本發(fā)明的新穎特征特別地記載在所附的權(quán)利要求書中。參考示出其中利用本發(fā)明 的原則的說明性實(shí)施方案的W下詳細(xì)的說明書獲得本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)的更好的理解，并 且其附圖如下：
[0015] 圖1A示意性地示出了用于擴(kuò)增用于本發(fā)明的遺傳標(biāo)志物的典型方案。
[0016] 圖1B示意性地示出了樣品中的核酸，其包含患者核酸和污染性核酸，諸如來自一 個(gè)或更多個(gè)其他患者的遺留DNA。
[0017] 圖1C示出了特定基因座上的遺傳標(biāo)志物的等位基因之間的序列讀段的分布。
[0018] 圖1D示意性地示出了樣品中的DNA，其包含患者的非重組核酸（P。）和重組核酸 化）W及非重組核酸（C。）和重組核酸也）污染性核酸，諸如來自一個(gè)或更多個(gè)其他患者的 遺留DNA。
[0019] 圖1E-1F示出了通過取樣標(biāo)記附加獨(dú)特序列標(biāo)簽至核酸分子的實(shí)例。
[0020] 圖1G示出了 I巧轉(zhuǎn)錄物和其內(nèi)自然變異的來源。
[002。 圖2A-2C示出了用于擴(kuò)增TCR目基因的兩階段PCR方案。
[0022] 圖3A示出了確定圖2C的PCR產(chǎn)物的核巧酸序列的詳細(xì)信息。圖3B示出了確定 圖2C的PCR產(chǎn)物的核巧酸序列的另一個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)信息。
[0023] 圖4A示出了在單一反應(yīng)中由I巧鏈產(chǎn)生H個(gè)測(cè)序模板的PCR方案。圖4B-4C示 出了用于在H個(gè)單獨(dú)反應(yīng)中由I巧鏈產(chǎn)生H個(gè)測(cè)序模板的PCR方案，在H個(gè)單獨(dú)反應(yīng)之后， 組合所得的擴(kuò)增子用于加入P5和P7引物結(jié)合位點(diǎn)的第二PCR。圖4D示出了對(duì)于I巧鏈產(chǎn) 生的序列讀段的位置。圖4E示出了 V和J區(qū)的密碼子結(jié)構(gòu)改進(jìn)NDN區(qū)的堿基調(diào)用化ase call)的用途。
[0024] 圖5示出了根據(jù)與相同序列標(biāo)簽相關(guān)的序列讀段確定克隆型的序列的步驟的一 個(gè)實(shí)現(xiàn)。
[00幼發(fā)明詳述
[0026] 除非另有指明，本發(fā)明的實(shí)踐可采用，在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)的分子生物學(xué)（包 括重組技術(shù)）、生物信息學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、和生物化學(xué)的常規(guī)技術(shù)和描述。此類常規(guī)技術(shù)包 括，但不限于，血細(xì)胞的取樣和分析、核酸測(cè)序和分析等。合適的技術(shù)的具體說明可參考本 文W下的實(shí)施例。然而，當(dāng)然，還可使用其他等同的常規(guī)方法。此類常規(guī)技術(shù)和描述可參 見標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)諸如 Genome Analysis:A L油oratory Manual Series(.I-IV卷）；PCR Primer:A Laboratory Manual ;and Molecular Cloning:A Laboratory Manual (全部來自 冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版）；等。
[0027] 本發(fā)明涉及用于檢測(cè)和定量用于產(chǎn)生克隆型譜的個(gè)體的組織樣品中的核酸污染 的方法。特別是，感興趣的核酸污染是起源自其他個(gè)體遺留污染，諸如起源自患者至患者或 測(cè)定操作者至患者的遺留污染，其中包含來自一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的克隆型的DNA不適 當(dāng)?shù)嘏c意在測(cè)量的個(gè)體的DNA混合。此類遺留污染的存在可導(dǎo)致具有重大醫(yī)學(xué)利益的克隆 型，諸如與癌癥，諸如白血病相關(guān)的克隆型的存在和量的假性估計(jì)。
[0028] 在一個(gè)實(shí)施方案中，來自其他個(gè)體的核酸污染可通過測(cè)量具有不同于感興趣的個(gè) 體，即意在測(cè)量或測(cè)定的個(gè)體的基因身份的基因身份的DM的量或比例來確定。核酸在組織 樣品中的基因身份可通過基于短串聯(lián)重復(fù)序列、單核巧酸多態(tài)性等的常規(guī)遺傳鑒定測(cè)定來 確定，諸如公開于W下文獻(xiàn)中的，其通過引用并入本文；Caskey等人，美國專利5, 364, 759 ; Weber 美國專利 5, 075, 217 Shumaker 等人，Human Mutation, 7:346-354(1996) ;Sobrino 等人，F(xiàn)orensic Sci. Int. , 154 (2-3) : 181-194 (2005) ;Mark, P'Ja^rvissenschaften, 84:181 -188(1997);等。如圖lA中所示，典型地，基因組DM中的遺傳標(biāo)志物將具有可包含SNP或 STR連同分別的上游和下游側(cè)翼區(qū)（172)和（174)的多態(tài)性區(qū)（170)，其可用于將遺傳標(biāo)志 物（170)定位在基因組上并提供引物結(jié)合位點(diǎn)用于其擴(kuò)增和分析。在一個(gè)實(shí)施方案中，上 游和下游引物（176)和（180)連同來自免疫細(xì)胞的重組核酸可分別用于W兩階段PCR擴(kuò)增 遺傳標(biāo)志物（170)(如圖2A-2B和4B-4C所示）。在此類實(shí)施方案中，引物（176)和（180) 分別具有尾部（178)和（182)，其具有允許與在兩階段PCR的第二階段中用于擴(kuò)增重組核 酸的引物相同的引物用于擴(kuò)增遺傳標(biāo)志物（170)的序列。尾部還可包含鑒定遺傳標(biāo)志物的 基因座的條形碼或標(biāo)簽（例如，W鑒定其為來自基因座1、2、3、或等，參考圖1A)。如W下所 述，盡量選擇引物（176)和（180)的位置和長度使得其退火和解鏈溫度與用于擴(kuò)增重組核 酸的那些大約相同（例如圖2A的（212)并使得所得擴(kuò)增子具有與重組核酸分子的擴(kuò)增子 大約相同的長度和GC含量。
[0029] 示例性實(shí)施方案示于圖1B中。在該圖中，從組織樣品中提取的核酸（100)表示為 垂直線（101)，既指示來自感興趣的個(gè)體，諸如患者，的基因組或基因組的片段，又指示來自 其他個(gè)體的基因組或基因組的片段，即污染性核酸（104)。全部個(gè)體在位點(diǎn)1、2、3、和4上 將具有遺傳標(biāo)志物，其對(duì)于感興趣的個(gè)體具有值Si、S2、S3、和S4 (108)，W及對(duì)于污染性DNA 具有值S/、S2'、S3'、和S/ (110)，當(dāng)然，如果污染來自一個(gè)W上其他個(gè)體，其可在各基因座 上包括一個(gè)W上的值。在任何情況下，如W下所提到的，感興趣的個(gè)體的值可與可存在于組 織樣品中的來自其他個(gè)體的值區(qū)分開。如果預(yù)先未知感興趣的個(gè)體基于該些標(biāo)志物的基因 身份，其可由測(cè)定中產(chǎn)生的信息來確定。假定感興趣的個(gè)體的DNA將是核酸的主要級(jí)分，例 如80%、90%、95%，等，則相應(yīng)于遺傳標(biāo)志物的不同等位基因的序列讀段的分布將偏斜至 相應(yīng)于感興趣的個(gè)體的等位基因，即主要等位基因，如圖1C中對(duì)于遺傳標(biāo)志物基因座1所 不。對(duì)于基因座1，比如說遺傳 t不志物Si,具有六個(gè)等位基因，SiA、Sie、Sic、SiD、SiE和Sip。具 有最高數(shù)目序列讀段（152)的等位基因，Sk，將相應(yīng)于感興趣個(gè)體的等位基因。Sk的一些 序列讀段（150)可起因于其他個(gè)體，并且一些可分布在其他等位基因，例如（154)。從來自 其他基因座的單獨(dú)計(jì)數(shù)的序列讀段，可建立并求解線性方程組W產(chǎn)生來自感興趣個(gè)體和來 自其他個(gè)體的核酸的比例的估計(jì)值。（例如，兩個(gè)未知數(shù)可W是xi =來自感興趣個(gè)體的遺 傳標(biāo)志物的總序列讀段的比例，且x,=來自其他個(gè)體的遺傳標(biāo)志物的總序列讀段的比例）。 序列讀段在各遺傳標(biāo)志物的不同等位基因中的分布可用于鑒定感興趣的個(gè)體所具有的等 位基因?？寺⌒妥V測(cè)量的最大靈敏度的測(cè)量（例如對(duì)于檢測(cè)相關(guān)克隆型，諸如白血病克?。?通過最大非患者等位基因的值來提供，如由圖1C中的線（155)所示。如果假定存在具有等 位基因 S1D的單一污染性基因組，則具有比S1D的值更大的值的任何克隆型將是患者克隆 型的精確測(cè)量。對(duì)于W小于S1D等位基因的水平的水平存在于克隆型譜中的任何克隆型， 存在克隆型不起源于患者的可能性。
[0030] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于確定個(gè)體的包含T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的組織樣品 的克隆型譜中的相關(guān)克隆型的檢測(cè)限的方法，其中此類方法包括W下步驟；(a)從個(gè)體獲 得組織樣品，該組織樣品包含來自個(gè)體和可能來自一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的核酸，該核酸 包括來自T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的重組核酸和非重組核酸；化）由組織樣品的核酸生成克隆 型譜；（C)測(cè)序來自組織樣品的核酸的一個(gè)或更多個(gè)基因座上的遺傳標(biāo)志物，W基于根據(jù) 遺傳標(biāo)志物的所述個(gè)體和所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的遺傳鑒定獲得來自所述一個(gè)或更 多個(gè)其他個(gè)體和來自所述個(gè)體的核酸的比例，其中遺傳標(biāo)志物出現(xiàn)在重組核酸和非重組核 酸兩者中存在的基因座上，W及（d)確定檢測(cè)限為對(duì)于個(gè)體的一個(gè)或更多個(gè)基因座的任何 等位基因的水平為鄰近最高的任何所述遺傳標(biāo)志物的等位基因的水平。
[0031] 在某些情況下，組織樣品，諸如全血或PBMC中的細(xì)胞類型的比例（并因此重組DNA 對(duì)非重組DNA的比例），可在來自患者，例如經(jīng)歷治療，諸如癌癥化療的樣品和來自另一個(gè) 個(gè)體，諸如健康個(gè)體的污染之間顯著不同。在該種情況下，另外的測(cè)量可確定源自來自可包 括污染性細(xì)胞或核酸的組織樣品的不同細(xì)胞的核酸的不同級(jí)分。在本實(shí)施方案中，核酸的 此類級(jí)分可稱為患者（或感興趣的個(gè)體）非重組（P。)、患者重組（Pf)、污染非重組（C。)、污 染重組（Ct)。本發(fā)明的該方面示于圖1D中，其是來自組織樣品的核酸的組成的示意性表示。 兩個(gè)條帶（120)和（122)分別表示來自患者（或感興趣的個(gè)體）的核酸和污染性核酸?；?者核酸對(duì)污染性核酸的示例性比例可W是約90:10。各條帶進(jìn)一步分為重組核酸（Pf (124) 和Cr(128))和非重組核酸任。(126)和C"(130))。如W上所提及的，在某些情況下，比例Py P?？煞浅２煌诒壤齟ye。。在各條帶中，遺傳標(biāo)志物基因座Si至S4可用于確定患者核酸 對(duì)污染性核酸的比例，其是（P"+Pr) / ((；+Cr) = Rstri，其中Rstri是來自患者核酸的遺傳標(biāo)志物 的序列讀段對(duì)來自其他個(gè)體的遺傳標(biāo)志物的序列讀段的比例，即來自W上的Xi/X2。
[0032] 組織樣品中的總核酸的量或濃度可將重組核酸和非重組核酸兩者共同的核酸區(qū) 段，諸如"管家基因"，例如GAPDH(本文稱為"共同區(qū)段"）的量，與用于此類區(qū)段、或基因的 一個(gè)或更多個(gè)內(nèi)標(biāo)（internal standard)比較來確定。例如，在一階段或兩階段PCR中，在 處理之前，W已知的量或濃度將一種或更多種內(nèi)標(biāo)加入來自組織樣品的核酸中。使用此類 總核酸內(nèi)標(biāo)，人們可獲得組織樣品中總核酸的值Wg，即，值Wg = Pf+Pt+Cf+C。。同樣地，組織 樣品中重組核酸的總量或濃度可通過將克隆型的序列讀段的量與在處理之前加入至來自 組織樣品的核酸的一個(gè)或更多個(gè)重組序列內(nèi)標(biāo)，例如V值)J內(nèi)標(biāo)的序列讀段的量比較來確 定。在一個(gè)實(shí)施方案中，應(yīng)用代表待分析的免疫組庫特別是在長度和組成上代表待分析的 免疫組庫的一組重組序列內(nèi)標(biāo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，此類一個(gè)或更多個(gè)重組序列內(nèi)標(biāo)的 數(shù)目可在1和10之間變化。使用此類內(nèi)標(biāo)，可確定值Wp = Cf+Pf。
[0033] 非重組核酸的比例或量可通過測(cè)量通常將在其中組裝TCR和/或BCR的體細(xì)胞重 組過程，即V值)J重組，期間被切除的核酸的區(qū)段來確定。對(duì)于患者核酸和污染性核酸，此 類區(qū)段，本文稱為"可切除區(qū)段"，分別由盒子（132)和（134)示于圖1D中。一個(gè)或更多個(gè) 此類區(qū)段從重組核酸中切除，如線（133)和（135)所示，指示盒子（132)和（134)的不存 在。在TCR和BCR二者的V值)J重組期間，至少兩個(gè)區(qū)段總是被切除并丟失；在包含V區(qū)基 因的基因組段（the stretch of genome)和包含D區(qū)基因的基因組段之間的第一切除的區(qū) 段，和在包含D區(qū)基因的基因組段和包含J區(qū)基因的基因組段之間的第二切除的區(qū)段。該 些區(qū)段的序列容易從公開可得的基因組圖譜中獲得，所述公開可得的基因組圖譜諸如NCBI 基因組瀏覽器（NCBI Genome Browser) (ht1:p:// www.ncbi.nih.gov/map)，加利福尼亞大 學(xué) Santa Cruz OJCSC)基因組瀏覽器（the University of 化lifornia, Santa Cruz OJCSC) Genome Browser) (ht1:p://genome.ucsc.edu/cgi-bin/h)、或類似的圖譜。例如，編碼人 BCR的V、D、和J基因見于基因組區(qū)14q32. 33中或附近；在J基因和D基因之間的第一切 除的區(qū)段具有位于人基因組的NCBI圖譜的染色體14上坐標(biāo)-106, 335K至-106, 345K內(nèi) 的序列，且位于D基因和V基因之間的第二切除的區(qū)段具有位于人基因組的NCBI圖譜的 染色體14上坐標(biāo)-106, 40服至-106, 385K之間的序列。對(duì)于位于染色體7的7q32-35上 的編碼人TCR目鏈的V、D、和J基因存在類似的可切除的區(qū)段，例如化dges等人，J. Clin. Pathol.，56:1-11 (2003)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，非重組核酸，即，仍存在第一和第二切除的 區(qū)段的核酸的比例和/或量，可至少兩種方式來確定。使用位于切除的區(qū)段中的多態(tài) 性遺傳標(biāo)志物，人們可比較來自患者（或感興趣的個(gè)體）和來自污染性核酸的非重組核酸 的相對(duì)量。目P，比例pyc" =氏可由來自非重組核酸的遺傳標(biāo)志物的序列讀段來計(jì)算?？?選地，人們可使用內(nèi)標(biāo)計(jì)算非重組序列的總數(shù)目。第一和/或第二切除的片段的此類內(nèi)標(biāo) 由W上NCBI序列使用常規(guī)技術(shù)容易地構(gòu)建，諸如W下更充分討論的。關(guān)于總核酸，此類測(cè) 量允許確定量P"+C。= Wy，其中Wx是非重組核酸的總數(shù)目或濃度。
[0034] W上測(cè)量和關(guān)系可概述于W下表中：
[00 巧]
【權(quán)利要求】
1. 一種確定待監(jiān)測(cè)微小殘留病的患者中遺留污染的方法，所述方法包括以下步驟： 由以下步驟通過定期地測(cè)量所述患者的克隆型譜監(jiān)測(cè)患者的微小殘留?。? (i) 從個(gè)體獲得包含T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的樣品； (ii) 將序列標(biāo)簽附著至T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的T細(xì)胞受體基因或免疫球蛋白基因的重 組核酸的分子以形成標(biāo)簽-分子綴合物，其中所述標(biāo)簽-分子綴合物的基本上每個(gè)分子具 有獨(dú)特序列標(biāo)簽； (iii) 擴(kuò)增所述標(biāo)簽-分子綴合物； (iv) 測(cè)序所述標(biāo)簽-分子綴合物； (v) 從由相似序列標(biāo)簽比對(duì)的序列讀段確定克隆型，并從此類克隆型生成克隆型譜； 以及記錄克隆型譜的每次測(cè)量的序列標(biāo)簽的核苷酸序列；以及由隨后克隆型譜中來自任何 先前克隆型譜的序列標(biāo)簽的存在、不存在和/或水平確定遺留污染。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述比對(duì)步驟還包括通過確定所述相似序列標(biāo)簽的 所述克隆型的每個(gè)核苷酸位置上的主要核苷酸確定每個(gè)所述標(biāo)簽-分子綴合物的每個(gè)所 述克隆型的核苷酸序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述附著步驟包括通過取樣標(biāo)記所述重組核酸分 子。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述附著步驟在反應(yīng)混合物中實(shí)施，使得所述序列 標(biāo)簽以所述重組核酸分子濃度的至少100倍的濃度存在于所述反應(yīng)混合物中。
5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述序列標(biāo)簽摻入進(jìn)特異于所述重組核酸分子的引 物。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述克隆型是編碼選自由以下組成的組的免疫受體 或免疫受體組分的區(qū)段的各25個(gè)至400個(gè)核苷酸的序列：IgH的VDJ重排、IgH的DJ重排、 IgK的VJ重排、IgL的VJ重排、TCRP的VDJ重排、TCRP的DJ重排、TCRa的VJ重排、 TCRy的VJ重排、TCRS的VDJ重排、和TCRS的VD重排。
7. -種用于確定個(gè)體的包含T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的組織樣品的克隆型譜中的污染水平 的方法，所述方法包括以下步驟： 從個(gè)體獲得組織樣品，所述組織樣品包括來自所述個(gè)體和可能來自一個(gè)或更多個(gè)其他 個(gè)體的核酸，所述核酸包括來自T細(xì)胞和/或B細(xì)胞的重組核酸以及非重組核酸； 由所述組織樣品的核酸生成克隆型譜； 測(cè)序來自所述組織樣品的核酸的一個(gè)或更多個(gè)遺傳基因座上的遺傳標(biāo)志物以基于根 據(jù)所述遺傳標(biāo)志物對(duì)所述個(gè)體和所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的遺傳鑒定獲得來自所述一 個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體以及來自所述個(gè)體的核酸的比例，其中所述遺傳標(biāo)志物出現(xiàn)在存在于 所述重組核酸和所述非重組核酸兩者的基因座上；以及 確定所述克隆型譜中污染性核酸的水平為來自所述組織樣品的核酸中存在的所述一 個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的核酸的比例。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述比例由鑒定所述個(gè)體的一個(gè)或更多個(gè)所述遺傳 標(biāo)志物的序列讀段和所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的一個(gè)或更多個(gè)所述遺傳標(biāo)志物的序列 讀段的數(shù)目來確定。
9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中對(duì)所述個(gè)體鑒定遺傳基因座上具有最高序列讀段數(shù) 目的所述遺傳標(biāo)志物，且對(duì)來自所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的核酸鑒定各遺傳基因座上的 剩余遺傳標(biāo)志物。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述污染水平與以下成比例：由基因座上的交叉污 染性核酸鑒定的遺傳標(biāo)志物的序列讀段的最高數(shù)目除以由所述個(gè)體的另一個(gè)基因座上鑒 定的遺傳標(biāo)志物的序列讀段的最低數(shù)目。
11. 如權(quán)利要求7所述的方法，所述方法還包括以下的步驟： 測(cè)量所述組織樣品中所述核酸的總量； 測(cè)量所述組織樣品中所述重組核酸的總量； 測(cè)序所述非重組核酸中存在的以及所述重組核酸中不存在的核酸的可切除區(qū)段中的 一個(gè)或更多個(gè)遺傳基因座上的遺傳標(biāo)志物以獲得來自所述個(gè)體和來自所述一個(gè)或更多個(gè) 其他個(gè)體的所述非重組核酸的比例；以及 由所述組織樣品的所述核酸中污染性重組核酸的水平確定所述克隆型譜中污染性核 酸的所述水平，污染性重組核酸的水平由以下來確定：核酸的總量、所述重組核酸的總量、 來自所述個(gè)體與來自所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的所述核酸的所述比例，以及所述個(gè)體與 所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的所述非重組核酸的比例。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述可切除區(qū)段是在V(D)J重組期間切除的核酸 的區(qū)段。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸包括來自人B細(xì)胞的重組核酸，并且所述 可切除區(qū)段包括在染色體14上編碼D區(qū)的基因和編碼V區(qū)的基因之間的區(qū)。
14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述核酸包括來自人T細(xì)胞的重組核酸，并且所述 可切除區(qū)段包括在染色體11上編碼D區(qū)的基因和編碼V區(qū)的基因之間的區(qū)。
15. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中測(cè)量所述核酸的所述總量的所述步驟包括將已知 量的用于總核酸的一種或更多種內(nèi)標(biāo)與來自所述組織樣品的所述核酸組合，使得所述核酸 的共同區(qū)段的數(shù)目可與所述一種或更多種內(nèi)標(biāo)的數(shù)目比較。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述共同區(qū)段包括選自由以下組成的組的基因的 部分：GAPDH、0 2-微球蛋白、18S核糖體RNA、和0 -肌動(dòng)蛋白。
17. 如權(quán)利要求11所述的方法，其中測(cè)量所述重組核酸的所述總量的所述步驟包括將 已知量的用于重組核酸的一種或更多種內(nèi)標(biāo)與來自所述組織樣品的所述核酸組合，使得所 述克隆型譜的克隆型的數(shù)目可與用于重組核酸的所述一種或更多種內(nèi)標(biāo)的數(shù)目比較。
18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述克隆型的每個(gè)包括編碼V(D) J區(qū)的部分的序 列，并且其中所述測(cè)量的步驟包括以PCR使用來自相同集合的引物擴(kuò)增來自所述組織樣品 的所述核酸以及用于重組核酸的所述一種或更多種內(nèi)標(biāo)。
19. 如權(quán)利要求7所述的方法，所述方法還包括以下步驟： 測(cè)量所述組織樣品中所述核酸的總量； 測(cè)量所述組織樣品中所述重組核酸的總量； 測(cè)量所述組織樣品中所述非重組核酸的總量；以及 由所述組織樣品的所述核酸中污染性重組核酸的水平確定所述克隆型譜中污染性核 酸的所述水平，污染性重組核酸的水平由以下來確定：核酸的總量、所述重組核酸的總量、 來自所述個(gè)體與來自所述一個(gè)或更多個(gè)其他個(gè)體的所述核酸的所述比例，以及所述非重組 核酸的總量。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述非重組核酸的所述總量包括將已知量的用于 非重組核酸的一種或更多種內(nèi)標(biāo)與來自所述組織樣品的所述核酸組合，使得非重組核酸中 存在的以及重組核酸中不存在的可切除區(qū)段的數(shù)目可與所述一種或更多種內(nèi)標(biāo)的數(shù)目比 較。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述核酸包括來自人B細(xì)胞的重組核酸，且所述可 切除區(qū)段包括在染色體14上編碼D區(qū)的基因和編碼V區(qū)的基因之間的區(qū)。
22. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述核酸包括來自人T細(xì)胞的重組核酸，且所述可 切除區(qū)段包括在染色體11上編碼D區(qū)的基因和編碼V區(qū)的基因之間的區(qū)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104395481SQ201380031219
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月13日
【發(fā)明者】托馬斯·阿斯布瑞, 維多利亞·卡爾頓, 馬利克·法哈姆, 斯蒂芬·梅斯維茲, 馬丁·穆爾黑德, 托馬斯·威利斯, 建標(biāo)·鄭 申請(qǐng)人:賽昆塔公司