專利名稱：：用于評估針對胰島素樣生長因子Ⅰ受體的抗體的抑制活性的方法用于評估針對胰島素樣生長因子I受體的抗體的抑制活性的方法本發(fā)明涉及用于評估針對胰島素樣生長因子I受體(IGF-1R)的抗體的抑制活性的方法，用于預(yù)測所述抗體的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)特性的方法和用于預(yù)測施用所述抗體的患者中的治療過程的臨床結(jié)果。胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR,EC2.7.112,CD221抗原)屬于跨膜蛋白酪氨酸激酶的家族(LeRoith,D.,等，內(nèi)分泌綜述(Endocrin.Rev.)16(1995)143-163;和Adams,T.E.,等，細胞分子生命科學(xué)(Cell.Mol.LifeSci.)57(2000)1050-1093)。IGF-IR以高親和力結(jié)合IGF-l并且在體內(nèi)激發(fā)對該配體的生理響應(yīng)。IGF-lR還結(jié)合IGF-2，但親和性稍低。IGF-IR的過量表達促進了細胞的致瘤性轉(zhuǎn)化，并且存在IGF-1R參與細胞的惡性轉(zhuǎn)化的證據(jù)，因此其是開發(fā)用于治療癌癥的治療劑的一個有用靶標(Adams，T.E.,等,細胞分子生命科學(xué)(Cell.Mol丄ifeSci.)57(2000)1050-1093)。胰島素樣生長因子I(IGFI)是血管平滑肌細胞(VSMC)的重要促分裂原。IGFI受體是由2條交聯(lián)的細胞外ot-鏈和包含酪氨酸-激酶結(jié)構(gòu)域的2條跨膜p-鏈組成的異源四聚體。其與胰島素受體(IR)具有高度序列相似性，且已將推定的配體-特異性結(jié)合位點定位于所述oc-鏈的半胱氨酸-富集區(qū)(CRR)(Adams,T.E.,等，細胞分子生命科學(xué)(Cell.Mol.LifeSci.)57(2000)1050-1093)。針對IGF-1R的抗體在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的，并且在體外和體內(nèi)對它們的抗腫瘤效果進行了研究(Benini,S.,等，臨床癌癥研究(Clin.CancerRes.)7(2001)1790-1797;Scotlandi,K.,等，癌癥基因治療(CancerGeneTher.)9(2002)296-307;Scotlandi,K.,等，國際癌癥雜志(Int.J.Cancer)101(2002)11-16;Brunetti，A.,等，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)165(1989)212-218;Prigent,S.A.，等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265(19%)9970-9977;Li,S丄.,等，癌癥免疫學(xué)和免疫療法(CancerImmunol.Immunother.)49(2000)243-252;Pessino,A.，等，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)162(1989)1236-1243;Surinya，K.H.,等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)277(2002)16718-16725;Soos,M.A.,等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，267(1992)12955-12963;Soos,M.A.,等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)5217-5221;O'Brien,R.M.,等，EMBOJ.6(1987)4003-4010;Taylor,R.,等，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)242(1987)123-129;Soos,M.A.,等，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)235(1986)199-208;Li,S丄.，等，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem.Bi叩hys.Res.Commun.)196(1993)92-98;Delafontaine，P.,等，分子細胞學(xué)和心臟病學(xué)雜志(J,Mol.Cell.Cardiol.)26(1994)1659-1673;Kull，RC.Jr.，等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)258(1983)6561-6566;Morgan,D.O.,禾卩Roth,R.A.,生物化學(xué)(Biochemistry)25(1986)1364-1371;Forsayeth,J.R.，等，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84(1987)3448-3451;Schaefer,E.M.，等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265(1990)13248-13253;Gustafson，T.A.,禾卩Rutter,W丄，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)265(1990)18663-18667;Hoyne，P.A.,等，F(xiàn)EBSLett.469(2000)57-60;Tulloch,P.A.,等，結(jié)構(gòu)生物學(xué)雜志(J.StructBiol.)125(1999)11-18;Rohlik,Q.T.，等，生物化學(xué)生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)149(1987)276-281;和Kalebic，T.,等，癌癥研究(CancerRes.)54(1994)5531-5534;Adams,T.E.，等，細胞分子生命科學(xué)(Cell.Mol.LifeSci.)57(2000)1050-1093;Dricu,A"等，糖生物學(xué)(Glycobiology)9(1999)571-579;Kanter-Lewensohn，L.,等，黑素瘤研究(MelanomaRes,)8(1998)389-397;Li，S丄.，等，癌癥免疫學(xué)和免疫療法(CancerImmunol.Immunother.)49(2000)243-252)。針對IGF-IR的抗體還描述于許多其它出版物中，例如Arteaga,C丄.,等，乳腺癌研究和治療(BreastCancerRes.Treatment)22(1992)101-106;和Hailey,J.,等，分子癌癥治療(Mol.CancerTher).1(2002)1349-1353。特別地，將稱為ocIR3的針對IGF-lR的單克隆抗體廣泛應(yīng)用于研究IGF-lR介導(dǎo)的過程和IGF-l介導(dǎo)的疾病諸如癌癥的研究中。ct-IR-3在Ku11,F.C.，生單獨和與細胞生長抑制劑諸如多柔比星和長春新堿一起的抗腫瘤效果。(xIR3是一種鼠單克隆抗體，己知其抑制IGF-1與IGF受體的結(jié)合，但是不抑制IGF-2與IGF-1R的結(jié)合。高濃度的alR3刺激腫瘤細胞增殖禾!]IGF-lR的磷酸化(Bergmann，U.，等，癌癥研究(CancerRes.)55(1995)2007-2011;Kato，H.，等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)268(1993)2655-2661)。存在其它抗體(例如，1H7,Li,S丄.,等，癌癥免疫學(xué)和免疫療法(CancerImmunol.Immunother.)49(2000)243-252)，與抑制IGF-1的結(jié)合比較，其更有效抑制IGF-2與IGF-1R的結(jié)合?？贵w以及它們的特性和性狀的現(xiàn)有技術(shù)的概述在Adams，T.E.，等.，細胞分子生命科學(xué)(Cell.Mol丄ifeSci.)57(2000)1050-1093中有所描述。在現(xiàn)有技術(shù)中所述的大多數(shù)抗體起源自小鼠。如在現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的，在沒有經(jīng)過進一步的改變諸如嵌合化或人源化的情況下，這些抗體對于治療人患者是沒有作用的?；谶@些缺陷，在治療人患者中，明顯優(yōu)選將人抗體作為治療劑。在現(xiàn)有技術(shù)中，人抗體是眾所周知的(vanDijk，M.A.,和vandeWinkel，J.G.，當(dāng)代化學(xué)生物學(xué)觀點(Curr.Opin.Chem.Biol.)5(2001)368-374)?；谒黾夹g(shù)，可以制備針對許多種類靶目標的人抗體。針對IGF-1R的嵌合的、人源化的和人治療性抗體在WO02/053596、WO2004/071529、WO2005/016967、WO2006/008639、US2005/0249730、US2005/0084906、WO2005/058967、WO2006/013472、US2003/0165502、WO2005/082415、WO2005/016970、WO03/106621、WO04/083248、WO2003/100008、WO2004/087756、WO2005/005635和WO2005/094376中有所提及。使用單克隆抗體的標準固相免疫測定包括在吸附于固相上的抗體(捕捉抗體)、抗原、和針對與酶綴合的抗原的另一表位的抗體(示蹤抗體)之間形成復(fù)合物。因此，形成夾心物固相-捕捉抗體-抗原-示蹤抗體。在由該夾心物催化的反應(yīng)中，抗體-綴合的酶的活性與培養(yǎng)基中的抗原濃度成比例。該標準夾心式方法也稱為雙抗原橋連免疫測定，因為捕捉和示蹤抗體結(jié)合于抗原的不同表位。本發(fā)明涉及用于評估針對胰島素樣生長因子I受體(IGF-IR)的抗體的抑制活性的方法，用于預(yù)測所述抗體的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)特性的方法和用于預(yù)測施用所述抗體的患者中的治療過程的臨床結(jié)果。用于確定IGF-1R的測定是現(xiàn)有技術(shù)中眾所周知的(例如，WO02/053596,WO2004/087756和WO2005/005635)，然而存在作為樣品使用的IGF-1R過表達細胞(3T3細胞)或通過流式細胞計數(shù)法進行的測量(Cohen，B.D.,臨床癌癥研究(Clin.CancerRes.)11(2005)2063-2073)。存在對測量和監(jiān)測用針對IGF-1R的抗體治療患者的藥物動力學(xué)和藥效學(xué)結(jié)果的需要。例如，所述測量和監(jiān)測可以通過在腫瘤活組織切片檢査中測量IGF-1R表達水平(Kornprat,P.,臨床病理學(xué)雜志(J.Clin.Path.)59(2006)202-206)或IGF-lR磷酸化狀態(tài)(Chen，J.W.，美國生理學(xué)和內(nèi)分泌學(xué)代謝雜志(Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.)284(2003)ell49-ell55)進行。還提議測量患者中IGF-lR的消耗(Cohen,B.D.,臨床癌癥研究(Clin.CancerRes.)11(2005)2063-2073)。如通過流式細胞計數(shù)法監(jiān)測地，用針對IGF-IR的抗體離體處理血液導(dǎo)致人外周血單核細胞上IGF-IR的下調(diào)。發(fā)明概述本發(fā)明包括用于通過固相免疫測定確定樣品中IGF-1R的方法，其特征在于所述樣品是溶胞哺乳動物外周血淋巴細胞(PBL)的制備物。所述樣品也表示為"溶胞的PBL樣品"或"溶胞的PBL"。哺乳動物優(yōu)選是人或猿。意外地發(fā)現(xiàn)，盡管PBL上IGF-1R表達的范圍是250-2，300個分子(Cohen,B.D.，臨床癌癥研究(Clin.CancerRes.)11(2005)2063-2073),但是可能通過按照本發(fā)明的固相免疫測定確定溶胞的PBL上的IGF-IR。本發(fā)明包括按照本發(fā)明的方法，其特征在于將IGF-IR蛋白水平確定為關(guān)于施用給所述哺乳動物的針對IGF-IR的抗體的體內(nèi)活性的測量標準。本發(fā)明包括按照本發(fā)明的方法，其用于評估用所述抗體處理的哺乳動物中針對IGF-1R的抗體的體內(nèi)活性，所述方法的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-IR蛋白水平確定為關(guān)于所述抗體體內(nèi)活性的測量標準。本發(fā)明包括按照本發(fā)明的方法，其用于預(yù)測在用所述抗體處理的哺乳動物中針對IGF-1R的抗體的藥效學(xué)或藥物動力學(xué)特性，所述方法的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-IR蛋白水平確定為關(guān)于所述預(yù)測的測量標準。本發(fā)明包括按照本發(fā)明的方法，其用于在施用針對IGF-1R的抗體的患者中預(yù)測臨床結(jié)果或確定治療過程，所述方法的特征在于包括下列步驟在第一時間確定所述患者的溶胞PBL樣品中的IGF-1R蛋白水平，比較所述蛋白水平和在第二時間確定的所述水平。本發(fā)明包括按照本發(fā)明的方法，其特征在于取樣的時間是施用之前和過程中和/或之后。本發(fā)明包括按照本發(fā)明的方法，其特征在于通過ELISA測量IGF-1R蛋白水平。本發(fā)明包括按照本發(fā)明的方法，其特征在于ELISA中使用的第一和第二抗體是針對IGF-1R的結(jié)合不同表位的兩種單克隆抗體、或單克隆抗體和多克隆抗體。按照本發(fā)明，本發(fā)明包括針對IGF-1R的第一和第二抗體用于制造免疫學(xué)測定從而評估針對IGF-1R的第三抗體的體內(nèi)活性的用途，其中所述哺乳動物是已用所述第三抗體處理的，所述用途的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為關(guān)于所述第三抗體的體內(nèi)活性的測量標準。按照本發(fā)明，本發(fā)明包括針對IGF-1R的第一和第二抗體用于制造免疫學(xué)測定從而預(yù)測針對IGF-1R的第三抗體在用所述第三抗體處理的哺乳動物中的藥效學(xué)或藥物動力學(xué)特性的用途，所述用途的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為關(guān)于所述預(yù)測的測量標準。按照本發(fā)明，本發(fā)明包括針對IGF-1R的第一和第二抗體用于制造免疫學(xué)測定從而在向患者施用第三抗體的哺乳動物中預(yù)測臨床結(jié)果或確定治療過程的用途，所述用途的特征在于包括下列步驟在第一時間確定所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中的IGF-1R蛋白水平和比較所述蛋白水平和在第二時間確定的所述水平。按照本發(fā)明，本發(fā)明包括所述用途，其特征在于取樣的時間是施用所述第三抗體之前、過程中和/或之后。按照本發(fā)明，本發(fā)明包括所述用途，其特征在于免疫學(xué)測定，優(yōu)選ELISA中使用的抗體是針對IGF-1R的結(jié)合不同表位的兩種單克隆抗體、或單克隆抗體和多克隆抗體。本發(fā)明包括用于確定哺乳動物的溶胞PBL樣品中IGF-1R的方法，其特征在于確定所述PBL中的IGF-1R蛋白水平，優(yōu)選地確定為關(guān)于向所述哺乳動物施用的針對IGF-1R的抗體的體內(nèi)活性的測量標準。本發(fā)明包括用于評估哺乳動物的溶胞PBL樣品中針對IGF-1R的抗體的體內(nèi)活性的方法，所述哺乳動物是已用所述抗體處理的，所述方法的特征在于將所述PBL中的IGF-1R水平確定為關(guān)于所述抗體的體內(nèi)活性的測量標準。.本發(fā)明包括用于評估在用所述抗體處理的哺乳動物中針對IGF-1R的抗體的體內(nèi)活性的方法，所述方法的特征在于在所述處理的哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為關(guān)于所述抗體的體內(nèi)活性的測量標準。本發(fā)明還包括預(yù)測用所述抗體處理的哺乳動物中針對IGF-1R的抗體的藥效學(xué)或藥物動力學(xué)特性的方法，所述方法的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為關(guān)于所述預(yù)測的測量標準。本發(fā)明還包括在施用針對IGF-1R的抗體的患者中預(yù)測臨床結(jié)果或確定治療過程的方法，所述方法的特征在于包括下列步驟在第一時間確定所述患者的溶胞PBL樣品中的IGF-1R蛋白水平，比較所述蛋白水平和在第二時間確定的所述水平。取樣的時間是施用之前、過程中和/或之后。所有這些方法在哺乳動物外進行，并且在體外確定IGF-1R蛋白水平。優(yōu)選地，在執(zhí)行確定方法前，從樣品，優(yōu)選從暗黃覆蓋層(buffycoat)，——通常通過使用Ficoll梯度的離心——分離PBL。作為用于按照本發(fā)明的方法的樣品，優(yōu)選使用10、10SPBL細胞/250pl的制備物。在(例如PBS緩沖的)水溶液中溶胞和溶解PBL。溶胞例如通過使用垸基芳基多醚醇如辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton⑧X-100)或CHAPS(例如1%(v/v))進行。本發(fā)明還包括針對IGF-1R的第一和第二抗體制造免疫學(xué)測定從而評估針對IGF-1R的第三抗體的體內(nèi)活性的用途，其中所述哺乳動物已用所述第三抗體抗體處理，所述用途的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為關(guān)于所述第三抗體的體內(nèi)活性的測量標準。本發(fā)明還包括針對IGF-1R的第一和第二抗體用于制造免疫學(xué)測定從而預(yù)測針對IGF-1R的第三抗體在用所述第三抗體處理的哺乳動物中的藥效學(xué)或藥物動力學(xué)特性的用途，所述用途的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為關(guān)于所述預(yù)測的測量標準。本發(fā)明還包括針對IGF-1R的第一和第二抗體用于制造免疫學(xué)測定從而在向患者施用第三抗體的哺乳動物中預(yù)測臨床結(jié)果或確定治療過程的用途，所述用途包括下列步驟在第一時間確定所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中的IGF-1R蛋白水平和比較所述蛋白水平和在第二時間確定的所述水平。取樣的時間是施用之前和過程中和/或之后?？梢杂糜诒景l(fā)明的確定方法中的抗體優(yōu)選是結(jié)合不同表位的兩種單克隆抗體、或是單克隆抗體和多克隆抗體。所述第一抗體是固定的，且所述第二抗體是檢測抗體并包含可檢測的標記。可以用于本發(fā)明的抗體結(jié)合于人IGF-1R(EC2.7丄112，SwissProtP08069)，且優(yōu)選地結(jié)合于所述受體的a-鏈。按照本發(fā)明使用的所述單克隆抗體例如記述在WO2004/087756和WO2005/005635中。所述抗體也有效作為第三(治療性)抗體。將產(chǎn)生有效的單克隆抗體的雜交瘤細胞保藏在德國的德國微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSMZ)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可以用于本發(fā)明的抗體的特征還在于與IGF-1R的親和力為10—8M(KD)或更低，優(yōu)選10一M且更優(yōu)選約10氣10"M。IGF-1R蛋白水平通過免疫學(xué)測定，更優(yōu)選地通過ELISA確定，由此固定一種抗體。固定優(yōu)選通過生物學(xué)結(jié)合對進行，所述生物學(xué)結(jié)合對優(yōu)選為半抗原-抗半抗原(如針對洋地黃毒苷的洋地黃毒苷-抗體)或生物素-(鏈霉)抗生物素蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，第一抗體是生物素化的且固定在鏈霉抗生物素蛋白(或其他抗生物素蛋白類似物)基質(zhì)上。生物素化或半抗原-偶聯(lián)以這樣的方式進行，即所述方式是所述抗體仍與IGF-1R保持10—9m(Kd)或更低，優(yōu)選約1(T、10"3M的親和力。優(yōu)選地，所述哺乳動物是需要腫瘤治療的人患者或為了體內(nèi)動物試驗處理的非-人哺乳動物。發(fā)明詳述術(shù)語"抗體"涵蓋各種形式的抗體，其包括但不限于整個抗體、抗體片段、人抗體、人源化抗體以及遺傳工程化的抗體。優(yōu)選地，所述第一和第二抗體之一是來自于非-人動物如兔或山羊的單克隆抗體且另一種是來自于非-人動物如兔或山羊的多克隆抗體。"抗體片段"包括全長抗體的一部分，通常至少是足以和有效用于按照本發(fā)明測定的抗原結(jié)合部分或其可變區(qū)?？贵w片段的實例包括Fab和F(ab)2片段。術(shù)語"針對IGF-1R的抗體"或"IGF-1R抗體"用于本文中時，指特異性結(jié)合于人IGF-1R并因此優(yōu)選與其他人蛋白不表現(xiàn)出可檢測的交叉反應(yīng)性的抗體。術(shù)語"與IGF-1R結(jié)合"用于本文中時，意指在體外測定中，優(yōu)選在結(jié)合測定中抗體與IGF-1R的結(jié)合，其中抗體結(jié)合于表面，且IGF-1R的結(jié)合通過表面等離振子共振(SPR)測量。結(jié)合意味著結(jié)合親和力(KD)為1(T8M或更低，優(yōu)選10—91^或更低和更優(yōu)選10—13-10—IQM。術(shù)語"針對IGF-1R的抗體的體內(nèi)活性"用于本文中時，指關(guān)于所述抗體己知的結(jié)合IGF-1R和抑制配體結(jié)合的公知活性?？贵w-介導(dǎo)的阻斷配體結(jié)合于IGF-1R抑制兩種主要胰島素樣生長因子(IGF)途徑，即促分裂原-活化的蛋白激酶和磷脂酰肌醇3'-激酶/Akt的下游信號傳導(dǎo)。結(jié)果，IGF-1和IGF2的促分裂原性和增殖潛力顯著降低。另夕卜，抗體誘導(dǎo)IGF-1R內(nèi)在化和與腫瘤細胞特異性結(jié)合的降解，由此導(dǎo)致細胞表面呈遞的受體分子的顯著減少(至少80%)。(見例如Mitsiades,C.S.，癌細胞(CancerCell)5(2004)221-230;Grimberg,A.,癌癥生物學(xué)和治療(CancerBiology&Therapy)2(2003)630-635)。按照現(xiàn)有技術(shù)，見例如Rees,G.和GoughR.,醫(yī)學(xué)實驗室技術(shù)雜志(J.Med.Lab.Tech.)25(1968)117-118和Figdor，C.，等，免疫學(xué)方法雜志(J.Immunol.Methods)55(1982)221-229，從暗黃覆蓋層分離外周血單核細胞/淋巴細胞。針對IGF-1R的抗體的免疫學(xué)確定是通過包括捕捉抗體(第一抗體)和與可檢測的標記綴合的示蹤抗體(第二抗體)的雙抗原橋連免疫測定發(fā)生的。夾心式ELISA法的特征在于利用識別抗原不同表位的兩種單克隆IGF-1R抗體類型(第一和第二抗體)，備選地，用一種單克隆IGF-IR抗體類型和一種多克隆IGF-1R抗體類型，來測量抗原濃度。該夾心式ELISA程序通常由三個階段組成。例如，在第一階段中，將包含抗原的樣品倒在其上吸附了第一單克隆/多克隆抗體的測量板上；該樣品中的IGF-1R結(jié)合于所述第一抗體。在第二階段中，用洗滌試劑洗去所述樣品中除所述抗原外的物質(zhì)。然后，在第三階段中，將用報道分子，諸如酶或放射性同位素標記的第二抗原溶液倒在所述板上；標記的抗體結(jié)合于與所述第一抗體結(jié)合的IGF-1R，并檢測所述標記。ELISA法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，且例如通過Hildeb腦dR丄.，傳染病的快速診斷(Rapiddiagnosisininfectiousdisease),Rytel，M.W.(ed.),BocaRaton(1979)第71-88頁綜述。優(yōu)選地，抗體與其綴合配偶體的綴合通過經(jīng)由N-端和/或e-氨基基團(賴氨酸)、不同賴氨酸的s-氨基基團、抗體氨基酸主鏈的羧基-、巰基-、羥基-和/或苯酚官能團和/或抗體碳水化合物結(jié)構(gòu)的糖醇基團的化學(xué)結(jié)合進行。優(yōu)選地，所述第一抗體通過特異性結(jié)合對固定。所述結(jié)合對(第一成分/第二成分)是，例如，鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素，抗體/抗原(見，例如，Hermanson,G.T.，生物綴合技術(shù)(BioconjugateTechniques)，學(xué)術(shù)出版社公司(AcademicPress,Inc.)(1996))，凝集素/多糖，類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，激素/激素受體，酶/底物，IgG/蛋白質(zhì)A和/或G，等。優(yōu)選地，所述第一抗體與生物素綴合，且固定通過固定的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白進行。備選地，所述第一抗體通過被動吸附與固相綴合。被動吸附例如，記述在Butler,J.E.,免疫測定中的固相(SolidPhasesinImmunoassay),在免疫測定(Immunoassay)中，Diamandis,E.P"和Christopoulos,T.K.(版本)，學(xué)術(shù)出版社公司(AcademicPress,Inc.),圣地亞哥，加利福尼亞(1996)，第205-225頁。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述第二抗體與可檢測的標記綴合，優(yōu)選通過特異性結(jié)合對綴合。所述結(jié)合對(第一成分/第二成分)是，例如，鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白/生物素，抗體/抗原(見，例如，Hermanson，G.T.,生物綴合技術(shù)(BioconjugateTechniques),學(xué)術(shù)出版社公司(AcademicPress,Inc.),圣地亞哥，加利福尼亞(1996))，凝集素/多糖，類固醇/類固醇結(jié)合蛋白，激素/激素受體，酶/底物，IgG/蛋白質(zhì)A禾口/或G，等。優(yōu)選地，所述第二抗體通過洋地黃毒苷和針對洋地黃毒苷的抗體與可檢測的標記綴合。備選地，所述第二抗體與電化學(xué)發(fā)光標記，如二吡啶基釕復(fù)合物綴合。單克隆抗體作為蛋白質(zhì)包含許多反應(yīng)性側(cè)鏈?？贵w的所述反應(yīng)性化學(xué)基團是，例如，氨基基團(賴氨酸、(x-氨基基團)、硫醇基團(胱氨酸、半胱氨酸、和甲硫氨酸)、羧酸基團(天冬氨酸、谷氨酸)和糖-醇基團。用于按照本發(fā)明的免疫測定的固體支持物廣泛記述在現(xiàn)有技術(shù)中(見，例如，Butler,J.E.,方法(Methods)22(2000)4-23)不同免疫測定的原理，例如，由Hage,D.S.記述在分析化學(xué)(Anal.Chem.)71(1999)294R-304R中。Lu,B.，等，在分析學(xué)(Analyst.)121(1996)29R-32R中，報告了用于免疫測定中的抗體定向固定。例如，由Wilchek,M.,和Bayer，E.A.在酶學(xué)方法(MethodsEnzymol.)184(1990)467-469中報告了抗生物素蛋白-生物素-介導(dǎo)的免疫測定。單克隆抗體和其恒定結(jié)構(gòu)域作為蛋白質(zhì)包含許多用于偶聯(lián)結(jié)合配偶體如表面、蛋白、聚合物、諸如PEG、纖維素或聚苯乙烯、酶或結(jié)合對成員的反應(yīng)性側(cè)鏈?？贵w化學(xué)反應(yīng)性基團是，例如，氨基基團(賴氨酸、a-氮基基團)、硫醇基團(胱氨酸、半胱氨酸、和甲硫氨酸)、羧酸基團(天冬氨酸、谷氨酸)和糖-醇基團。所述方法例如，由Aslam,M.和Dent，A.記述在生物綴合(Bioconjuation)，MacMillan參考文獻公司(MacMillanReferenceLtd.)(1999),第50-IOO頁中。術(shù)語"固相"意指非-流體物質(zhì)，且包括由材料諸如聚合物、金屬(順磁性、鐵磁性顆粒)、玻璃和陶瓷制成的顆粒(包括微顆粒和珠)；凝膠物質(zhì)諸如硅石、礬土、和聚合物凝膠；可由聚合物、金屬、玻璃、和/或陶瓷制成的毛細管；沸石和其他多孔物質(zhì)；電極；微量滴定板；固體條帶；和杯，試管或其他光譜儀樣品容器。測定的固相元件(component)與該測定可以接觸的惰性固體表面不同，因為"固相"在其表面上包含至少一個部分，所述部分意欲與第二抗體相互作用。固相可以是靜止的元件，諸如試管、條帶、杯或微量滴定板，或可以是非-靜止的元件，諸如珠和微顆粒。微顆粒還可以用作均勻測定形式的固相?？梢允褂枚喾N容許蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)非-共價或共價附著的微顆粒。所述顆粒包括聚合物顆粒諸如聚苯乙烯和聚(異丁烯酸甲酯)；金顆粒諸如金納米顆粒和金膠體；和陶瓷顆粒諸如硅石、玻璃、和金屬氧化物顆粒。見例如Martin,C.R.，等，分析化學(xué)(Anal.Chem.)70(1998)322A-327A，將其引入本文作為參考。發(fā)色團(熒光或發(fā)光基團和染料)、酶、NMR-活性基團或金屬顆粒、半抗原、洋地黃毒苷是可檢測標記的實例?？蓹z測的標記還可以是可光活化的交聯(lián)基團，例如疊氮基或azirine基團?？梢酝ㄟ^電化學(xué)發(fā)光檢測的金屬螯合物也優(yōu)選地是信號-發(fā)射基團，特別優(yōu)選地是釕螯合物，例如釕(二吡啶基)32+螯合物。合適的釕標記基團記述在，例如，EP0580979,WO90/05301，WO90/11511和WO92/14138中。提供下列實例和附圖幫助理解本發(fā)明，其真正的范圍在所附的權(quán)利要求中闡述。應(yīng)該理解，可以在不偏離本發(fā)明精神的條件下對所述程序進行修改。附圖描述圖l在標記為l-5的5個獨立實驗中測量的相同樣品的水平。相同的顏色表示相同樣品。標準偏差在11-14%范圍內(nèi)。圖2測試由食蟹猴(Cynomolgus)(起始群體)新鮮分離的外周白細胞，以獲得它們的IGF-1R濃度，并與細胞(未處理的)的過夜培養(yǎng)物和用抗體18處理的細胞(處理的)的過夜培養(yǎng)物相比較。在左圖上，繪制相對單位(arbitraryunits)/mg蛋白。實施例lPBL分離和溶胞a)分離人PBL將200piLiquemine(羅什診斷學(xué)股份有限公司(RocheDiagnosticsGmbH)，德國)加入到160mlRPMI/Hepes(在RPMI中的10mMHepes緩沖液)中。將來自0.51血液的外周血細胞("暗黃覆蓋層")重新混懸在該溶液中。血細胞類型的分離在50mlGREINERLeucosep試管(商品號7.227.290)中進行。使用6個試管從一種暗黃覆蓋層中分離PBL。為了準備所述試管，將15ml淋巴細胞選擇培養(yǎng)基(LymphocyteSelectionMedium)(LSM,ICNNo.50494)轉(zhuǎn)移到每個試管中，并在1000xg離心所述試管30秒。39ml血液混懸液在LSM溶液上部形成層，并在1000xg，18°C，離心10分鐘。PBL呈現(xiàn)為直接位于隔膜上的白色條帶，并用10ml移液管回收并轉(zhuǎn)移到4個50ml的試管中。然后用RPMI/Hepes將所述試管中充滿至50ml并在250xg，18°C，離心10分鐘。棄去上清液，并將細胞重新混懸在小體積RPMI/Hepes中。將所有細胞合并在單一的50ml試管中，并在RPMI/Hepes中再次洗滌。棄去上清液，并將細胞重新混懸在10ml預(yù)暖的ALT中，從而裂解污染的紅細胞。ALT是通過組合300ml溶液A(0.16MNH4Cl)和100ml溶液B(0.18MTris-HCl，pH7.65)，調(diào)節(jié)pH為7.2并通過過濾(0.22(am)滅菌溶液制備的。在ALT中在37。C溫育所述細胞混懸液3分鐘后，用RPMI/Hepes將所述試管充滿至50ml并在250xg離心細胞5分鐘。最后，在RPMI/Hepes中再次洗滌細胞兩次，并重新混懸在50mlRPMI/Hepes中。最后，對細胞進行計數(shù)。對新鮮制備的細胞備選地，在一些情形中還可以使用冷凍的PBL。為了冷凍，將細胞以l千萬細胞/ml的密度重新混懸在冷凍培養(yǎng)基(處于熱-滅活的人血清中的10%DMSO)中。使混懸液緩慢變涼至-80。C。為了解凍，快速解凍細胞，并然后在不攪動的條件下，通過逐步加入培養(yǎng)基對其進行緩慢稀釋。b)分離食蟹猴PBL15將血液(24ml，從8只不同的猴各獲得3ml)收集在包含肝素的vacutainer中。加入56mlPBS，且混懸液在LSM(ICNNo.50494)墊層上形成層。在IOOOxg離心所述試管10分鐘。移出PBL，在PBS中洗滌2次并計數(shù)。c)PBL處理在6-孔細胞培養(yǎng)板中的2ml培養(yǎng)基(具有10。/。FCS的RPMI)中接種2百萬-l千萬細胞/L。保持對照不進行處理。對一半的孔，加入針對IGF-1R的抗體(2.0mg/ml)直到最終濃度100nM。在37。C，5%C02，溫育細胞過夜。作為對照，在細胞培養(yǎng)步驟前，離心并冷凍細胞等分試樣，以進行進一步的分析。d)PBL溶胞通過離心收獲細胞，并在PBS中洗滌2次。冷凍沉淀。在分析之前不久，解凍細胞沉淀并重新混懸在200jnl溶胞緩沖液(50mMTris-HCl,pH7.5,1mMEDTA,1mMEGTA，100mMNaF，1%Triton-X-lOO,20%甘油)中，渦旋，將其置于超聲波水浴中2分鐘并離心。實施例2ELISA測定外周血淋巴細胞中的IGF-1受體通過針對鏈霉抗生物素蛋白包被的微量板(SA-MTP)上的受體a-鏈的生物素化抗體(抗體18)捕獲。結(jié)合的IGF-lR通過兔多克隆IGF-lR抗體和抗-兔-HRP偶聯(lián)抗體檢測。將IGF-1R水平測量為相對于細胞總蛋白量的IGF-1R蛋白量。生成細胞溶胞產(chǎn)物，調(diào)節(jié)到相同蛋白質(zhì)濃度，并在ELISA測定中測量。在測定的線性范圍內(nèi)，在450nm處的吸光度信號對應(yīng)于IGF-lR水平的相對量。材料-96-孔鏈霉抗生物素蛋白包被的聚苯乙烯板(Nunc)-PBST:用H201:10稀釋的10xPBS-緩沖溶液+0，2%吐溫20-BSA-PAK<IGF-lR(3>Ra-C20-IgG(SantaCruz生物技術(shù)(SantaCmzBiotechnology),#sc-713)-PAK〈兔〉G-IgG-HRP(細胞信號傳導(dǎo)(CellSignaling)#7074)-3,3，-5,5，-四甲聯(lián)苯胺-1MH2S04-生物素化的MAK<IGF-lRa〉Hu-AKla-IgG(DSMACC2586)板包被-在3。/。BSA/PBST中l(wèi):200稀釋生物素化的抗體-向SA-MTP加入100pl/孔-在搖動器上室溫溫育l小時-用200(ilPBST/孔洗滌樣品制備-用PBS洗滌后，外周血淋巴細胞(PBLs，lxl(^細胞)通過離心再分離，并將細胞沉淀溶解在250pl溶胞緩沖液中。為了確保溶胞產(chǎn)物的IGF-1R濃度處于ELISA測定的線性范圍內(nèi)，進行連續(xù)稀釋。測定程序-向測定板中加入100lil/孔樣品-室溫溫育l小時-用200ialPBST/孔清洗-向該板中加入以1:1000處于3%BSA/PBST中的PAK<IGF-lR(3>Ra-C20-IgG(SantaCruz生物技術(shù)(SantaCruzBiotechnology)，#sc-713)，100inl/孑L-室溫下溫育l小時-用200plPBST/孔洗滌-向該板中加入以1:5000處于3%BSA/PBST中的PAK<兔>G-IgG-HRP，兩nl/孑L-室溫下溫育l小時-用200plPBST/孔洗滌-向測定板中加入IOOpl/孔3，3'-5，5，-四甲聯(lián)苯胺-室溫下溫育0,5小時-用25pl/孔lMH2S04終止反應(yīng)-測量450nm處的吸光度在缺乏純重組蛋白的條件下，將用陽性對照的1:100稀釋物獲得的ELISA信號定義為相對單位"U"。測量不同的樣品稀釋物并計算至少兩個值的平均值。確定用針對IGF-1R的抗體處理的PBL培養(yǎng)物中IGF-1R水平的改變來自20名捐獻者的PBL在存在和缺乏抗體18的條件下培養(yǎng)。樣品中的9份來自冷凍儲液，ll份由新鮮制備的細胞確定。在用針對IGF-1R的抗體處理24小時后確定IGF-1R水平的下調(diào)。在所有細胞培養(yǎng)物中，與未處理的細胞相比，IGF-1R水平在抗體處理中降低。處理后IGF-1R水平是在對照培養(yǎng)物中檢測的水平的0%-62%范圍內(nèi)。因此，受體的下調(diào)呈現(xiàn)出由治療性抗體引起的信號級聯(lián)放大下調(diào)后的一般現(xiàn)象。受體表達的基線水平在捐獻者之間強烈變化，因此似乎不可能確定"閾值"水平，且水平的時間過程必須對每名患者貫穿治療期間確定，包括治療前作為基線對照的數(shù)值。對于19/20捐獻者，細胞培養(yǎng)前的水平低于細胞培養(yǎng)后的水平(不處理的條件下)。然而，對于17/20捐獻者，這些水平仍然高于在用所述治療性抗體處理后的細胞培養(yǎng)物中測量的那些。對于2種細胞制備物，用不同濃度的huMabIGF-lR檢測IGF-1R水平的降低。在較低濃度時檢測的甚至更低的IGF-1R水平(圖1和2)。為了證實所述測定可以在預(yù)-臨床實驗中應(yīng)用于食蟹猴，在存在和不存在所述治療性抗體的條件下進行猴PBL的溫育。如在人樣品中地，在食蟹猴淋巴細胞中檢測到IGF-1R濃度的下調(diào)。受體水平下調(diào)率與也用人材料檢測的那些相似。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>權(quán)利要求1.用于通過固相免疫測定確定樣品中IGF-1R的方法，所述方法的特征在于所述樣品是溶胞哺乳動物外周血淋巴細胞制備物(溶胞PBL樣品)。2.按照權(quán)利要求1的方法，所述方法的特征在于所述哺乳動物是人或猿。3.按照權(quán)利要求1或2的方法，所述方法的特征在于將所述IGF-1R蛋白水平確定為向所述哺乳動物施用的針對IGF-1R的抗體的體內(nèi)活性的測量標準。4.用于評估針對IGF-1R的抗體在用所述抗體處理的哺乳動物中的體內(nèi)活性的方法，所述方法的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為所述抗體的體內(nèi)活性的測量標準。5.用于預(yù)測針對IGF-1R的抗體在用所述抗體處理的哺乳動物中的藥效學(xué)或藥物動力學(xué)特性的方法，所述方法的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為所述預(yù)測的測量標準。6.用于在施用針對IGF-1R的抗體的患者中預(yù)測臨床結(jié)果或確定治療過程的方法，所述方法的特征在于包括下列步驟在第一時間確定所述患者的溶胞PBL樣品中的IGF-1R蛋白水平，比較所述蛋白水平和在第二時間確定的所述水平。7.按照權(quán)利要求6的方法，所述方法的特征在于取樣的時間是施用之前、過程中和/或之后。8.按照權(quán)利要求l-7的方法，所述方法的特征在于通過ELISA測量IGF-1R蛋白水平。9.按照權(quán)利要求l-8的方法，所述方法的特征在于使用的第一和第二抗體是針對IGF-1R的結(jié)合不同表位的兩種單克隆抗體、或單克隆抗體和多克隆抗體。10.針對IGF-1R的第一和第二抗體用于制造免疫學(xué)測定從而評估針對IGF-1R的第三抗體的體內(nèi)活性的用途，其中所述哺乳動物是已用所述第三抗體抗體處理的，所述用途的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為關(guān)于所述第三抗體的體內(nèi)活性的測量標準。11.針對IGF-1R的第一和第二抗體用于制造免疫學(xué)測定從而預(yù)測針對IGF-1R的第三抗體在用所述第三抗體處理的哺乳動物中的藥效學(xué)或藥物動力學(xué)特性的用途，所述用途的特征在于在所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中，將IGF-1R蛋白水平確定為關(guān)于所述預(yù)測的測量標準。12.針對IGF-1R的第一和第二抗體用于制造免疫學(xué)測定從而在向患者施用第三抗體的哺乳動物中預(yù)測臨床結(jié)果或確定治療過程的用途，所述用途的特征在于包括下列步驟在第一時間確定所述哺乳動物的溶胞PBL樣品中的IGF-1R蛋白水平，并且比較所述蛋白水平和在第二時間確定的所述水平。13.按照權(quán)利要求12的用途，所述用途的特征在于取樣的時間是施用所述第三抗體之前、過程中和/或之后。14.按照權(quán)利要求10-13的用途，所述用途的特征在于免疫學(xué)測定中使用的所述抗體是針對IGF-1R的結(jié)合不同表位的兩種單克隆抗體、或單克隆抗體和多克隆抗體。全文摘要用于評估抗體在用所述抗體處理的哺乳動物的溶胞PBL樣品中抑制IGF-1和/或IGF-2與IGF-1R的結(jié)合的抑制活性的方法，所述方法的特征在于將所述PBL的IGF-1R蛋白水平測量為關(guān)于所述抗體抑制活性的測量標準。文檔編號G01N33/50GK101617228SQ200880005371公開日2009年12月30日申請日期2008年2月25日優(yōu)先權(quán)日2007年2月27日發(fā)明者克勞斯-彼得·金克勒,安德烈斯·欣茨,斯特凡·埃弗斯申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司