專利名稱：：一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性e2抗原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及作為抗原的E2蛋白的制備方法，具體說是一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原蛋白的方法。
背景技術(shù)：
：豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的是嚴(yán)重威脅養(yǎng)豬業(yè)，具有重要經(jīng)濟(jì)意義的烈性病毒性疾病之一，被國際獸疫局(OIE)列為A類15種傳染病之一，在我國也被列為一類傳染病，可導(dǎo)致各生長階段豬的死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。CSFV是有囊膜的RNA病毒，基因組長約12.3kb，含一個(gè)大的開放式閱讀框架(ORF)，翻譯成一條約含3898個(gè)氨基酸殘基的多聚前體蛋白，其中C、Erns、El、E2為結(jié)構(gòu)蛋白。豬瘟病毒E2蛋白作為病毒粒子囊膜上的主要結(jié)構(gòu)糖蛋白之一，是抗豬瘟中和抗體主要誘發(fā)者，是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原。近年來，證實(shí)了E2分子存在4個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)構(gòu)域A、B、C、D，位于E2N末端的690位866位氨基酸處。A區(qū)位于766位866位氨基酸處，A區(qū)又分為三個(gè)功能區(qū)A1、A2和A3，Al、A2亞區(qū)相連，位于A區(qū)C端的795位851位之間，是E2蛋白的中心部位，為一段保守區(qū)，Al亞區(qū)能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體；A3亞區(qū)靠近B、C區(qū)，位于766813位之間，無保守性，也不誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體；B區(qū)位于690773位之間，C區(qū)位于690位800位之間，兩者均為非保守區(qū)，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要部位；D區(qū)位于766800位之間，既不保守也不誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。功能上，Al亞區(qū)、B區(qū)與C區(qū)與CSFV的中和過程有關(guān)，是中和性抗原域，A2、A3亞區(qū)、D區(qū)不參與病毒的中和，是非中和抗原域。由于大腸桿菌表達(dá)的外源性蛋白常以無活性的包涵體的形式存在，需要通過變性、復(fù)性等過程才能部分恢復(fù)重組蛋白的生物學(xué)活性，更重要的是這個(gè)過程根本不可能使重組蛋白達(dá)到與天然蛋白相一致的生物學(xué)功能。這就嚴(yán)重限制了重組蛋白在科學(xué)研究中的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是利用帶有GST標(biāo)記原核表達(dá)載體，通過改善誘導(dǎo)表達(dá)條件獲得可溶性的重組E2蛋白，純化后的E2蛋白作為抗原建立檢測豬瘟病毒血清抗體間接ELISA方法，而提供一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法。本發(fā)明的技術(shù)問題通過下述技術(shù)方案解決一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，包括下述步驟1、一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，其特征在于，包括下述步驟A.克隆E2基因抗原結(jié)構(gòu)域部分A.1、設(shè)計(jì)1對特異性寡核苷酸引物uE和dE;A.2、提取總RNA，從豬瘟兔化弱毒疫苗中提取核糖核酸-RNA;A.3、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以提取的核糖核酸RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;A.4、PCR擴(kuò)增E2基因，用所述的1對特異性寡核苷酸引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增；B.構(gòu)建重組表達(dá)載體；C.在改良的LB培養(yǎng)基中表達(dá)，獲得可溶性的重組E2蛋白；D.親和層析純化重組E2蛋白；E.pGST-E2表達(dá)蛋白的鑒定，十二垸基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE和免疫印跡法WesternBlotting鑒定表達(dá)的重組E2蛋白；F.利用重組E2蛋白建立檢測豬瘟血清抗體間接ELISA方法。上述步驟C所述改良的LB培養(yǎng)基成分中含有蛋白胨0.8%;氯化鈉0.9%;酵母提取物0.6%，葡萄糖0.l%g加無離子水，調(diào)pH=7.4所述步驟C在改良的LB培養(yǎng)基中表達(dá)E2蛋白的誘導(dǎo)溫度為20-14°C，誘導(dǎo)時(shí)間12-20小時(shí)，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.10腿ol/ml。所述步驟C在改良的LB培養(yǎng)基中表達(dá)E2蛋白的誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間16小時(shí)。血清學(xué)檢測CSFV抗體是豬抗體水平監(jiān)測的主要手段，也是診斷豬瘟的重要工具。豬瘟病毒E2基因抗原結(jié)構(gòu)域編碼的蛋白與完整的CSF粒子相比，具有無感染性、易于大量生產(chǎn)和純化等明顯的優(yōu)勢。而改善誘導(dǎo)表達(dá)條件獲得的可溶性的E2蛋白，親和層析純化后的E2抗原可與豬瘟陽性血清發(fā)生反應(yīng)特異性很強(qiáng)，純化后的重組E2蛋白可直接作為檢測用抗原建立ELISA方法，應(yīng)用在臨床的豬瘟病毒血清抗體的檢測試驗(yàn)中。本發(fā)明制備的可溶性的E2蛋白具有良好生物學(xué)活性，將其與高效的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)及ELISA技術(shù)相結(jié)合，能建立檢測豬瘟病毒血清抗體的間接ELISA方法，具有與國外同類產(chǎn)品相當(dāng)?shù)拿舾行院吞禺愋?，其單份樣品的成本僅為進(jìn)口試劑盒的1/5，采用本方法純化的可溶性E2抗原與完整CSFV病毒粒子具有相同的特異性，完全可以替代其作為血清抗體檢測用抗原；在血清樣品稀釋液中添加的空載體重組菌裂解液，可以有效地阻斷因樣品血清中存在大腸桿菌抗體而產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)，克服了因大腸桿菌污染而導(dǎo)致的假陽性；檢測豬瘟病毒血清抗體的間接ELISA方法適合檢測豬體內(nèi)抗豬瘟病毒血清抗體水平，效果良好。本發(fā)明檢測豬瘟病毒血清抗體的間接ELISA方法為臨床豬瘟的科學(xué)免疫提供可靠的參考依據(jù)。1、本發(fā)明改良了傳統(tǒng)的LB培養(yǎng)基，在減少LB相應(yīng)成分的基礎(chǔ)上增加了葡萄糖，配制了iLB液體培養(yǎng)基，在與低溫誘導(dǎo)條件共同作用下，有效減少包涵體的形成，促進(jìn)可溶性的E2蛋白表達(dá)；2、本發(fā)明解決了豬瘟病毒E2抗原在大腸桿菌中主要以包涵體表達(dá)的難題，獲得的可溶性E2蛋白與完整豬瘟病毒粒子具有相似的免疫學(xué)效果，可作為替代豬瘟病毒粒子的抗原，建立敏感性、特異、安全和可靠的豬瘟病毒血清抗體的檢測間接ELISA方法。具體實(shí)施例方式反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)和用上、下游引物(uE、dE)擴(kuò)增抗原蛋白基因E2主要抗原區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后、酶切，與pGEX4T-l表達(dá)載體連接，BL21(Star)感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒命名為pGST-E2。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析純化重組E2蛋白，建立間接ELISA血清抗體診斷方法，用于豬瘟病毒血清抗體檢測。具體步驟為1.克隆E2基因抗原結(jié)構(gòu)域部分1)設(shè)計(jì)表達(dá)引物設(shè)計(jì)1對特異性寡核苷酸表達(dá)引物uE和dE，同時(shí)在5端分別增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，序列為uE:5，-GCGAATTCGGACTCACCACTACATGC-3，fc。//dE:5，-GCCTCGAGTAGCCATCTGTGCTGATTC-3，勘〃2)提取總RNA:使用組織裂解液(TRIZ0L試劑)從感染了豬瘟兔化病毒疫苗株的兔脾臟組織毒提取總RNA。3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:取所提取的RNA5~10u1，加入20u1反轉(zhuǎn)錄體系中，內(nèi)含1XRTbuffer(50mMTris-HCl(pH8.3)，75nMKCl，8mMMgCl2，10mMDTT)，dNTP(eachlOmM)，引物dE50pmo1，AMVRTaseIOU，RNaseinhibitor20U。在42t:下水浴lh，然后煮沸5min，置-2(TC備用。4)PCR擴(kuò)增E2基因取5)4反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入PCR反應(yīng)體系中，內(nèi)含1XPCRbuffer(10mMTris-HC1，50mMKC1，1.5mMMgCl2pH8.3)0,2mMdATP，dCTP,dGTP，0.19mMdTTP，0.OlmM，250nM特異性引物uE/dE。PCR循環(huán)參數(shù)為94。C40秒，55。C30秒，72°C50秒，第一循環(huán)94°C5分鐘，最后一循環(huán)72°C延伸IO分鐘。35個(gè)循環(huán)完成擴(kuò)增反應(yīng)。2.重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定LB液體和固體培養(yǎng)基，抗性及濃度均為Amp+100tig/mL。PCR擴(kuò)增的E2片段用DNA片段回收Kit純化回收。限制性內(nèi)切酶EcoR工和Xhol過夜雙酶切PGEX4T-1載體和E2片段，純化回收酶切后的產(chǎn)物。按照載體和目的片段的合適摩爾比(載體目的片段"l:3)混合后用T4DNA連接酶16。C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在LB平板培養(yǎng)1218h。挑取單克隆，增菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定得到的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(Star)感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒命名為pGST-E2。3.pGST-E2在LB培養(yǎng)基中的試表達(dá)挑取5個(gè)單克隆菌株，接種到5個(gè)5mLLB液體培養(yǎng)基試管中，220r/min，37。C過夜振蕩培養(yǎng)；然后分別從5管中取50uL菌液到新的5個(gè)LB液體培養(yǎng)基試管中，250r/min34h至OD,"O.50.6，在其中的4個(gè)管中加入IPTG的終濃度分別為0.lmol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L,剩余1管作為陰性對照，37°C200r/min振蕩培養(yǎng)46h。4.pGST-E2表達(dá)蛋白的鑒定1)SDS-PAGE鑒定重組E2蛋白取lmL重組菌到Ep管中，10000r/min離心lmin，棄掉上清，加入100uLTrisp朋.8，100。C煮5min，10000r/min離心15min。配制15X的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳凝膠，每個(gè)樣品加10uL上清，加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker5uL，80v濃縮膠，120v分離膠，膠塊考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察到了E2蛋白成功表達(dá)。2)WesternBlotting:結(jié)果表明，重組E2蛋白可以被豬瘟陽性血清識別，具有良好的特異性。3)重組E2抗原與完整豬瘟病毒抗原生物學(xué)活性的比較間接ELISA法分別將純化的重組E2抗原和充分滅活的豬瘟病毒抗原以適當(dāng)濃度包被96孔ELISA平板。按照標(biāo)準(zhǔn)的間接ELISA操作程序，利用事先制備的2份已知豬瘟抗體陽性血清(P)和已知無豬瘟特異性抗體的2份陰性血清(N)作為第一抗體，分別作1:20稀釋，與兩種抗原作用，每份血清作2孑L，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG作為第二抗體，TMB作為底物，酶標(biāo)儀0D450波段讀結(jié)果，見表一。表一重組E2抗原和豬瘟全病毒抗原活性比較0D450<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根據(jù)間接ELISA常用的結(jié)果判斷公式:陽性血清0D值/陰性血清0D值〉2.1(即P/N〉2.1)，可知重組E2抗原和全病毒抗原具有幾乎相同的與豬瘟病毒抗體陽性血清反應(yīng)原性，重組E2抗原完全可以替代全病毒抗原用于豬瘟病毒血清抗體的檢測。5.pGST-E2表達(dá)蛋白的大量表達(dá)及純化1)重組菌的大量表達(dá)LB培養(yǎng)基成分中含蛋白胨8.0g;氯化鈉9.0g;酵母提取物6g，葡萄糖lg加無離子水至1L，調(diào)pH二7.4，將重組菌1%的接種量接到1LLB，37。C震蕩增菌至OD6。。=0.50.6，然后分別在37。C誘導(dǎo)4h、3(TC誘導(dǎo)8h、20。C誘導(dǎo)12h、16。C誘導(dǎo)16h和14。C誘導(dǎo)24h;5000r/min，離心10min，用緩沖液lXPBS收集菌體，振蕩混勻；分別超聲破菌，冰浴條件下，工作4s，間歇6s，50cycles，超聲三次；4°C，15000r/min離心30min。保留上清樣品和沉淀樣品，進(jìn)行15%的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳凝膠鑒定重組E2蛋白的表達(dá)形式，見表二。表二E2蛋白誘導(dǎo)的表達(dá)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表一可知，E2重組蛋白的最佳表達(dá)條件為iLB，16'C，IPTG濃度為0.10,1/ml2)親和層析純化融合蛋白將離心后的上清樣品上樣到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱上，在4°C條件下，重復(fù)34次，用1XPBS(150咖ol/LNaCl，32mmol/LNa2HP04，4mmol/LNaH2P04，pH7.3)洗雜蛋白，然后用含有15腿ol/L還原型谷胱甘肽(GSH)的50mmol/LTris.ClpH8.0洗融合蛋白，整個(gè)洗脫過程中用蛋白指示劑監(jiān)測洗脫情況，并且預(yù)留穿透的樣品和洗脫后融合蛋白通過SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳觀察結(jié)果。3)蛋白質(zhì)濃縮洗脫后的E2重組蛋白在濃縮管3200r/min，離心濃縮，4。C條件下濃縮至體積為lmL，取樣留做鑒定，其余的樣品液氮速凍后，保存在-7(TC低溫冰箱。6.豬瘟病毒血清抗體間接ELISA方法的建立6.1抗原包被用碳酸鹽緩沖液(0.05mol/LNaC03/NaHC03,pH9.6)將抗原稀釋至工作濃度(13.75iig/ml)，每孔50u1，4°C過夜。以洗滌緩沖液1XPBST(0.01mol/LPBS加0.05XTween20，pH7.4)洗滌4次，每孔230ul，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，每孔加入50ul封閉液(0.5%明膠，5%蔗糖，10X馬血清的PBST)37。C封閉40分鐘，洗滌4次，拍干。風(fēng)機(jī)吹干或真空干燥后，每塊立即與4袋lg用干燥劑一起放入鋁箔真空袋內(nèi)，包裝機(jī)真空包裝，4'C保存。6.2加入待檢和標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性對照血清用血清稀釋液對陽性和陰性對照血清做1:20稀釋，每孔加入50化，陰陽性對照血清各做兩孔；同時(shí)待檢血清樣品用血清稀釋液做1:20稀釋，密封，37。C結(jié)合45分鐘。同時(shí)設(shè)兩孔不加任何血清樣品的空白對照；6.3洗板棄去孔內(nèi)液體，然后將25XPBST洗滌液用滅菌水或超純水稀釋成1XPBST，每孔加入220300叱洗板，重復(fù)4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體。6.4加入酶結(jié)合物濃縮酶標(biāo)記抗體用酶結(jié)合物稀釋液做1:100稀釋，每孔加入50化,密封,37"C結(jié)合45分鐘。注意(從加入第一孔時(shí)開始計(jì)時(shí)間；并且現(xiàn)用現(xiàn)配，配置好的工作溶液不易儲存超過6小時(shí))。6.5重復(fù)步驟6.3洗板。6.6加入底物將底物溶液A和B以1:50的體積比混勻，每孔加入50化,輕輕震蕩混勻，密封，37"C或室溫避光作用15分鐘。6.7終止反應(yīng)每孔加入50叱終止液，輕搖混勻，測定吸光度OD450nm。6.8結(jié)果計(jì)算試驗(yàn)成立條件陽性對照、陰性對照血清孔各有兩個(gè)值，需計(jì)算平均吸光度值，陽性標(biāo)準(zhǔn)血清0D450》0.60，陰性標(biāo)準(zhǔn)血清0D450《0.25，且陽性對照血清0D450/陰性對照血清0D450》2.10判定為試驗(yàn)成立。計(jì)算公式比值=血清樣品0D450/陰性對照血清OD450>2.106.8.2結(jié)果判定比值>2.10血清樣品豬瘟病毒抗體判定為陽性；比值〈2.10血清樣品豬瘟病毒抗體判定為陰性。本實(shí)施方式所用試材等來源1、毒株和血清樣品由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所采集保存。2、引物合成和測序由Takara公司合成。3、Sigma公司酶標(biāo)儀、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG、底物TMB、誘導(dǎo)劑IPTG、核酸電泳和蛋白電泳所用試劑。4、Takara公司組織總RNA提取試劑盒、擴(kuò)增用單核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、高保真的r^酶、限制性核酸內(nèi)切酶(fco/M、J力WI)、T4DNA連接酶。5、安瑪西亞瓊脂糖4B填料、還原型谷胱甘肽、超濾濃縮管和咪唑。6、深圳金燦華有限公司96孔板、血清管。實(shí)施例11.克隆E2基因抗原結(jié)構(gòu)域部分1)設(shè)計(jì)表達(dá)引物設(shè)計(jì)1對特異性寡核苷酸表達(dá)引物uE和dE，同時(shí)在5端分別增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，序列為uE:5，-GCGAATTCGGACTCACCACTACATGC-3，^c。vJdE:5'-GCCTCGAGTAGCCATCTGTGCTGATTC-3，J力o//2)提取總RNA:使用組織裂解液(TRIZOL試劑)從感染了豬瘟兔化病毒疫苗株的兔脾臟組織毒提取總RNA。3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:取所提取的RNA510u1，加入20u1反轉(zhuǎn)錄體系中，內(nèi)含1XRTbuffer(50mMTris-HC1(pH8.3)，75nMKCl，8mMMgCl2,lOmMDTT)，dNTP(eachlOmM)，引物dE50pmo1，AMVRTase10U，RNaseinhibitor20U。在42'C下水浴lh，然后煮沸5min，置-2(TC備用。4)PCR擴(kuò)增E2基因取5W反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入50WPCR反應(yīng)體系中，內(nèi)含1XPCRbuffer(10mMTris-HCl，50mMKC1，1.5mMMgCl2pH8.3)0.2mMdATP，dCTP，dGTP，0.19mMdTTP，0.OlmM，250nM特異性引物uE/dE。PCR循環(huán)參數(shù)為94。C40秒，55。C30秒，72°C50秒，第一循環(huán)94°C5分鐘，最后一循環(huán)72nC延伸10分鐘。35個(gè)循環(huán)完成擴(kuò)增反應(yīng)。2.重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定LB液體和固體培養(yǎng)基，抗性及濃度均為Amp+100ixg/mL。PCR擴(kuò)增的E2片段用DNA片段回收Kit純化回收。限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xhol過夜雙酶切PGEX4T-1載體和E2片段，純化回收酶切后的產(chǎn)物。按照載體和目的片段的合適摩爾比(載體目的片段"l:3)混合后用T4DNA連接酶16X:連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在LB平板培養(yǎng)1218h。挑取單克隆，增菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和PCR鑒定，鑒定得到的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(Star)感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒命名為pGST-E2。3.pGST-E2在LB培養(yǎng)基中的試表達(dá)挑取單克隆菌株，接種到5mLLB液體培養(yǎng)基試管中，220r/min，37。C過夜振蕩培養(yǎng)；然后取50uL菌液到新的LB液體培養(yǎng)基試管中，250r/min34h至0D6。。^0.50.6，在管中加入IPTG的終濃度為O.lmol/L，并留l管作為陰性對照，37°C200r/min振蕩培養(yǎng)46h。4.pGST-E2表達(dá)蛋白的鑒定1)SDS-PAGE鑒定重組E2蛋白取lmL重組菌到Ep管中，10000r/min離心lmin，棄掉上清，加入100txLTrispH6.8，100。C煮5min，10000r/min離心15min。配制15X的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳凝膠，每個(gè)樣品加10uL上清，加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker5uL，80v濃縮膠，120v分離膠，膠塊考馬斯亮藍(lán)染色，脫色后觀察到了E2蛋白成功表達(dá)。2)WesternBlotting:結(jié)果表明，重組E2蛋白可以被豬瘟陽性血清識別，具有良好的特異性。3)重組E2抗原與完整豬瘟病毒抗原生物學(xué)活性的比較間接ELISA法分別將純化的重組E2抗原和充分滅活的豬瘟病毒抗原以適當(dāng)濃度包被96孔ELISA平板。按照標(biāo)準(zhǔn)的間接ELISA操作程序，利用事先制備的2份已知豬瘟抗體陽性血清(P)和已知無豬瘟特異性抗體的2份陰性血清(N)作為第一抗體，分別作1:20稀釋，與兩種抗原作用，每份血清作2孔，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗豬IgG作為第二抗體，TMB作為底物，酶標(biāo)儀0D450波段讀結(jié)果。根據(jù)間接ELISA常用的結(jié)果判斷公式陽性血清OD值/陰性血清OD值〉2.1(即P/N〉2.1)，可知重組E2抗原和全病毒抗原具有幾乎相同的與豬瘟病毒抗體陽性血清反應(yīng)原性，重組E2抗原完全可以替代全病毒抗原用于豬瘟病毒血清抗體的檢測。5.pGST-E2表達(dá)蛋白的大量表達(dá)及純化1)重組菌的大量表達(dá)LB培養(yǎng)基成分中含蛋白胨8.0g;氯化鈉9.0g;酵母提取物6g，葡萄糖lg加無離子水至1L，調(diào)pH=7.4，將重組菌1%的接種量接到1LLB，37。C震蕩增菌至OD卿二O.50.6，然后在16。C誘導(dǎo)16h;5000r/min，離心10min，用緩沖液lXPBS收集菌體，振蕩混勻；超聲破菌，冰浴條件下，工作4s，間歇6s，50cycles，超聲三次；4°C，15000r/min離心30min。保留上清樣品和沉淀樣品，進(jìn)行15%的SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳凝膠鑒定重組E2蛋白的表達(dá)形式。2)親和層析純化融合蛋白將離心后的上清樣品上樣到谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B柱上，在4°C條件下，重復(fù)34次，用1XPBS(150咖ol/LNaCl，32mmol/LNa2HP04，4mmol/LNaH2P04，pH7.3)洗雜蛋白，然后用含有15mmol/L還原型谷胱甘肽(GSH)的50咖ol/LTris.ClpH8.0洗融合蛋白，整個(gè)洗脫過程中用蛋白指示劑監(jiān)測洗脫情況，并且預(yù)留穿透的樣品和洗脫后融合蛋白通過SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳觀察結(jié)果。3)蛋白質(zhì)濃縮洗脫后的E2重組蛋白在濃縮管3200r/min，離心濃縮，4。C條件下濃縮至體積為lmL，取樣留做鑒定，其余的樣品液氮速凍后，保存在-7(TC低溫冰箱。6.豬瘟病毒血清抗體間接ELISA方法的建立6.1抗原包被用碳酸鹽緩沖液(0.05mol/LNaC03/NaHC03，pH9.6)將抗原稀釋至工作濃度(13.75iig/ml)，每孔50u1，4。C過夜。以洗滌緩沖液1XPBST(0.Olmol/LPBS加0.05^Tween20，pH7.4)洗滌4次，每孔230ul，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，每孔加入50yl封閉液(0.5%明膠，5%蔗糖，10X馬血清的PBST)37。C封閉40分鐘，洗滌4次，拍干。風(fēng)機(jī)吹干或真空干燥后，每塊立即與4袋lg用干燥劑一起放入鋁箔真空袋內(nèi)，包裝機(jī)真空包裝，4"C保存。6.2加入待檢和標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性對照血清用血清稀釋液對陽性和陰性對照血清做1:20稀釋，每孔加入50叱，陰陽性對照血清各做兩孔；同時(shí)待檢血清樣品用血清稀釋液做1:20稀釋，密封,37"結(jié)合45分鐘。同時(shí)設(shè)兩孔不加任何血清樣品的空白對照；6.3洗板棄去孔內(nèi)液體，然后將25XPBST洗滌液用滅菌水或超純水稀釋成1XPBST，每孔加入220300叱洗板，重復(fù)4次，最后一次棄凈孔內(nèi)液體。6.4加入酶結(jié)合物濃縮酶標(biāo)記抗體用酶結(jié)合物稀釋液做1:100稀釋，每孔加入50叱，密封，37"C結(jié)合45分鐘。注意(從加入第一孔時(shí)開始計(jì)時(shí)間；并且現(xiàn)用現(xiàn)配，配置好的工作溶液不易儲存超過6小時(shí))。6.5重復(fù)步驟6.3洗板。6.6加入底物將底物溶液A和B以1:50的體積比混勻，每孔加入5(HiL，輕輕震蕩混勻，密封，37。C或室溫避光作用15分鐘。6.7終止反應(yīng)每孔加入50叱終止液，輕搖混勻，測定吸光度0D450nm。6.8結(jié)果計(jì)算試驗(yàn)成立條件陽性對照、陰性對照血清孔各有兩個(gè)值,需計(jì)算平均吸光度值，陽性標(biāo)準(zhǔn)血清0D450》0.60，陰性標(biāo)準(zhǔn)血清0D450《0.25，且陽性對照血清0D450/陰性對照血清0D450>2.10判定為試驗(yàn)成立。計(jì)算公式比值=血清樣品0D450/陰性對照血清0D450》2.106.8.2結(jié)果判定比值>2.10血清樣品豬瘟病毒抗體判定為陽性；比值〈2.10血清樣品豬瘟病毒抗體判定為陰性。實(shí)施例2重復(fù)實(shí)施例1的方法，只是步驟5大量誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)溫度為20°C，誘導(dǎo)時(shí)間12h。CSFV抗體檢測方法E2核苷酸序列表OrganizationApplicantStreet:徐家坪1，鹽場路City:蘭州State:甘肅Country:P.R.ChinaPostalCode:730046PhoneNumber二0931—8342706FaxNumber:0931—8342052EmailAddress:yinshuanghuikangri@163.com〈110〉0rganizationName:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所ApplicationProject<120〉Title:—種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法<130〉A(chǔ)ppFileReference:G.Swensvoort，1989.TopographicalandFunctionalMappingofEpitopesonHogCholeraVirus.J.Gen.Virol,70:2865-2876.<140〉CurrentAppNumber:<141>CurrentFilingDate:_-_-—Sequence<213>OrganismName:豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基因〈400〉PreSequenceString:gaagattacaggtacgcaatatcgtcaaccgatgagatagggctacttggggccggaggt60ctcaccaccacctggaaggaatacaaccacgatttgcaactgaatgacgggaccgtcaag120gccagttgcg180ttggcgtcat240ggg3CC33CC300gatacgagtc360tatcttgtct420actctgagga480gattgtgtga540tggacatgtg558〈212〉Type:DNA〈211〉Length:558SequenceName:E2SequenceDescription:FeaturetggcaggttcctttaaagtcacagcacttaatgtggtcagtaggaggtattgcataagaaggctttacccacttccgtgacattcgagctcctgttcgaccatcaactgaggaaatgggagatgacttcaggtccgggctgtgcccgtttctgttgttaagggaaagtacaatacgaccttgttgaacggtaatgctttcgcccaatagggtggacgggtgtcatagagtgcacagcagtgagcccaacacagaagtggtaaagaccttcaggagagacaagccctttccgcacagagrtgccaxxatagtggaaaatgaagatttattctattgtaagttggggggcaactgaaaggcSequence:E2:〈221〉FeatureKey:CDS<222〉LocationFrom:1<222〉LocationTo:558OtherInformation:CSFVE2geneCDSJoin:Yes權(quán)利要求1、一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，其特征在于，包括下述步驟A.克隆E2基因抗原結(jié)構(gòu)域部分A.1、設(shè)計(jì)1對特異性寡核苷酸引物uE和dE；A.2、提取總RNA，從豬瘟兔化弱毒疫苗中提取核糖核酸-RNA；A.3、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以提取的核糖核酸RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；A.4、PCR擴(kuò)增E2基因，用所述的1對特異性寡核苷酸引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增；B.構(gòu)建重組表達(dá)載體；C.在改良的LB培養(yǎng)基中表達(dá)，獲得可溶性的重組E2蛋白；D.親和層析純化重組E2蛋白；E.pGST-E2表達(dá)蛋白的鑒定，SDS-PAGE和WesternBlotting鑒定表達(dá)的重組E2蛋白；F.利用重組E2蛋白建立檢測豬瘟血清抗體間接ELISA方法。上述步驟C所述改良的LB培養(yǎng)基成分中含有蛋白胨0.8％；氯化鈉0.9％；酵母提取物0.6％，葡萄糖0.1％g加無離子水，調(diào)pH＝7.4。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，其特征在于所述步驟C在改良的LB培養(yǎng)基中表達(dá)E2蛋白的誘導(dǎo)溫度為20-16°C，誘導(dǎo)時(shí)間12-16小時(shí)，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.10mmol/ml。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，其特征在于所述步驟C在改良的LB培養(yǎng)基中表達(dá)E2蛋白的誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間16小時(shí)。全文摘要一種制備用于檢測豬瘟病毒血清抗體的可溶性E2抗原的方法，包括下述步驟A.克隆E2基因抗原結(jié)構(gòu)域部分；B.構(gòu)建重組表達(dá)載體；C.在LB培養(yǎng)基中表達(dá)，獲得可溶性的重組E2蛋白；D.親和層析純化重組E2蛋白；E.pGST-E2表達(dá)蛋白的鑒定，SDS-PAGE和WesternBlotting鑒定表達(dá)的重組E2蛋白；F.利用重組E2蛋白建立檢測豬瘟血清抗體間接ELISA方法。本發(fā)明改良了傳統(tǒng)的LB培養(yǎng)基，促進(jìn)可溶性的E2蛋白表達(dá)；解決了豬瘟病毒E2抗原在大腸桿菌中主要以包涵體表達(dá)的難題，獲得的可溶性E2蛋白與完整豬瘟病毒粒子具有相似的免疫學(xué)效果，可作為替代豬瘟病毒粒子的抗原，建立敏感性、特異、安全和可靠的豬瘟病毒血清抗體的檢測間接ELISA方法。文檔編號G01N33/53GK101418304SQ20081015030公開日2009年4月29日申請日期2008年7月6日優(yōu)先權(quán)日2008年7月6日發(fā)明者劉湘濤,劉艷紅,孫世琪,尚佑軍,尹雙輝,宏田,韓雪清申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所