專利名稱：：單胺氧化酶mao單試劑測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請涉及酶法單試劑測定單胺氧化酶活性的方法及試劑盒的制法。
背景技術(shù)：
：單胺氧化酶(MAO)能反映纖維化的生化過程，是反映肝纖維化及肝細(xì)胞損害的重要指標(biāo)，在肝硬化的診斷上越來越受到重視。MAO是含銅的蛋白質(zhì)，廣泛存在于肝、腎、腦等器官的結(jié)締組織巾和細(xì)胞線粒體內(nèi)，其分布肝>心〉腎>鵬1>肺>骨骼肌，血.小板和胎盤中也含有MAO，其同工酶有三種，分別為MAO—I、MAO—II和MAO—III，有兩個亞單位MA0—A和MA0—B。通過同源序列分析，發(fā)現(xiàn)單胺氧化酶有四個高度保守的區(qū)域。在單胺氧化酶B中，這些保守區(qū)域包括1)ADP結(jié)合位點；2)底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域；3)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)共價結(jié)合位點；4)C端區(qū)域，主要與形成一個跨膜相關(guān)的a螺旋。MA0是可以作用于不同單胺類化合物的水溶性酶，參與膠原成熟最后階段的架橋形成。當(dāng)纖維形成后，MAO脫離，從而導(dǎo)致血清中MAO活性升高。肝病患者因肝內(nèi)慢性炎癥性刺激而產(chǎn)生纖維結(jié)締組織增生，最終導(dǎo)致肝纖維化。由于在此過程中膠原合成增多，所以血清中MAO活性增加與肝纖維化程度正相關(guān)?，F(xiàn)有的測定技術(shù)中，其測定的主要方法有熒光法、免疫抑制法和化學(xué)分光光度法。熒光法是以P—苯乙基胺為底物來檢測單胺氧化酶。免疫學(xué)方法是利用單胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生發(fā)應(yīng)，檢測生成的單胺氧化酶的同工酶。分光光度法是通過用單胺氧化酶催化胺類釋放出過氧化氫去氧化10—N—甲基氨基甲?；?，7—二甲氨基4—IO—氫一吩噻嗪(MCDP)等發(fā)色劑進(jìn)行測定。目前，主要以芐胺和對苯甲胺一3—偶氮萘酚作為底物。目前市場上主要使用的測定MAO的技術(shù)是使用采用雙試劑試劑盒的方法，這是因為雙試劑的試劑盒通過控制酸堿度，可以增加試劑的穩(wěn)定性。但是由于所采用的雙試劑占用更多的試劑艙位，并且在半自動的儀器上操作繁瑣，耗時長，所以限制了它們的實用性。因此，目前還存在開發(fā)快速、操作簡單、具有良好檢測效果，并且可以在多種檢測儀器中使用的試劑盒的需要。本專利申請?zhí)峁┝艘环N單試劑診斷MAO的試劑盒，以及配制該試劑盒的方法。本申請?zhí)峁┑脑噭┖心軓V泛應(yīng)用于各種檢測儀器中對單胺氧化酶活性進(jìn)行檢測，通過在反應(yīng)體系中偶聯(lián)一個再生循環(huán)酶系統(tǒng)，緩慢補(bǔ)充輔酶的量，從而確保了試劑的穩(wěn)定性及臨床測值的準(zhǔn)確性。另夕卜，本申請?zhí)峁┑膯卧噭┱加玫呐撐簧?，操作簡便，使用方便，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，具有測定速度快，準(zhǔn)確度高，試劑穩(wěn)定等效果。
發(fā)明內(nèi)容因此，為了克服目前在檢測MA0領(lǐng)域屮存在的如上所述的諸多問題，本中請?zhí)峁┮环N穩(wěn)定的測定血清、血漿中單胺氧化酶活性的單試劑的試劑盒。本發(fā)明提供了--種包括50—250mM，pH7.0-10的緩沖液、5—30mM的胺類化合物、5-20mM的a—酮戊二酸、0.2—0.4mM的還原型輔酶、0.2—5Ku的谷氨酸脫氫酶的測定單胺氧化酶活性的單試劑試劑盒，其還包括由再生系統(tǒng)酶、底物和輔酶組成的再生酶循環(huán)系統(tǒng)。該再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括濃度為5—100mM的底物、10—1000u的系統(tǒng)酶。本申請所述的再生酶循環(huán)系統(tǒng)的反應(yīng)速率小于主反應(yīng)的速率，不干擾主反應(yīng)。本申請優(yōu)選的再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶一葡萄糖一還原型輔酶或其類似物系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸脫氫酶一葡萄糖6磷酸一還原型輔酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶—甘油—還原型輔酶或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶一丙酮酸一還原型輔酶或其類似物系統(tǒng)；或者葡萄糖脫氫酶一葡萄糖一氧化型輔酶或其類似物系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸脫氫酶一葡萄糖6磷酸一氧化型輔酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶一甘油一氧化型輔酶或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶一丙酮酸一氧化型輔酶或其類似物系統(tǒng)。本申請優(yōu)選的氧化型輔酶是氧化型煙酰輔酶或其類似物，優(yōu)選的還原型輔酶是氧化型煙酰輔酶或其類似物相應(yīng)的還原型煙酰輔酶或其類似物。更優(yōu)選的氧化型煙酰輔酶或其類似物是NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP，更優(yōu)選的還原型煙酰輔酶或其類似物是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH。特別地，本申請?zhí)峁┑脑噭┖兄兴龅陌奉惢衔镞x自芐胺、丁基胺、戊基胺、P—苯乙基胺、酪胺或其衍生物。所述的緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷一鹽酸緩沖液、三乙醇氨緩沖液、咪唑一鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液、硼酸一硼酸鈉緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液或者磷酸本申請?zhí)峁┑脑噭┖袃?yōu)選地還包括0.1-3g/L的螯合劑、0.1-3g/L的防腐劑、1-30%的穩(wěn)定劑、0.l一5g/L的表面活性劑、0.1一5mM的反應(yīng)加速劑；所述的穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、'牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、乳糖、黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸中的一種或幾種；所述的表面活性劑是陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性表面活性劑。另一方面，本申請?zhí)峁┑脑偕秆h(huán)系統(tǒng)還用于制備檢測二氧化碳、腺苷脫氨酶、氨、肌酐、尿素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的單試劑試劑盒中。本申請的有益效果主要表現(xiàn)在1)該方法所配制試劑為單一試劑，所以使用方便，操作簡單；2)該試劑可在全自動生化分析儀上快速檢測，也可在半自動或者手動儀器上使用，所以便于推廣應(yīng)用；3)參與偶聯(lián)反應(yīng)的成分都是外加的，不會引入額外的內(nèi)外源物質(zhì)的污染；4)本申請偶聯(lián)的再生酶循環(huán)系統(tǒng)速率要小于主反應(yīng)的速率，不干擾主反應(yīng)；5)本申請配制的單試劑試劑盒，穩(wěn)定性好，可以長時間使用，37度穩(wěn)定性實驗證明一年半后空白吸光度A0X).8。6目前市場上存在的檢測MAO的試劑盒均為雙試劑的試劑盒。本申請則提供了一種為單試劑的試劑盒。在設(shè)計本申請時需要考慮的幾個問題是1)根據(jù)選擇的底物選定單胺氧化酶測定的最適反應(yīng)條件，如緩沖液的濃度，離子強(qiáng)度和PH等等；2)還原型輔酶的最適穩(wěn)定pH及輔酶再生循環(huán)系統(tǒng)的慢反應(yīng)pH;3)樣本中氨干擾的去除；4)整個體系的穩(wěn)定性問題；5)兼顧上述所有條件下的反應(yīng)速率問題。在此基礎(chǔ)上，本申請人公開了一種用于檢測MA0的單試劑的試劑盒。在本申請的一個具體實施方案中，所述試劑盒主要采取以下的方法及歩驟首先，將需要測定的樣品與含有胺類化合物、a—酮戊二酸、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶及再生酶循環(huán)系統(tǒng)的各種物質(zhì)混勻，使之發(fā)生以下反應(yīng)，單胺氧化酶胺類化合物+2水+氧-------^相應(yīng)醛類產(chǎn)物+銨離子+過氧化氫+20H谷氨酸脫氫酶銨離子+a—酮戊二酸+還原型輔酶-------^谷氨酸+氧化型輔酶+水相應(yīng)葡萄糖脫氫酶氧化型輔酶+葡萄糖類底物-------^還原型輔酶十相應(yīng)醛+水然后，將反應(yīng)后的混合物在全自動生化分析儀上，檢測340nm處吸光度的下降速度，從而測算出單胺氧化酶的活性大小。本申請的試劑盒還包括一種在單試劑制備中的再生酶循環(huán)系統(tǒng)，通過在檢測試劑中加入指示性輔酶的生成補(bǔ)充體系，利用反應(yīng)的可逆性，由產(chǎn)物逆向生成原反應(yīng)物，從而補(bǔ)充原反應(yīng)物的量。該試劑盒通7酶循環(huán)系統(tǒng)，從而從技術(shù)上確保了單試劑中各組分在制備、儲存和應(yīng)用過程的穩(wěn)定。該再生酶循環(huán)系統(tǒng)還可以推廣應(yīng)用于例如下列單試劑的研制中二氧化碳試劑、腺苷脫氨酶試劑、氨試劑、肌酐試劑、尿素試劑、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑。具體的，本申請公開的單試劑的試劑盒中包括的再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括但不限于葡萄糖脫氫酶—葡萄糖一還原型煙酰胺酶或其類似物系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸脫氫酶一葡萄糖6磷酸一還原型煙酰胺酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶一甘油—還原型煙酰胺酶或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶一丙酮酸一還原型煙酰胺酶或其類似物系統(tǒng)；或者葡萄糖脫氫酶一葡萄糖—氧化型煙酰胺酶或其類似物系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸脫氫酶一葡萄糖6磷酸一氧化型煙酰胺酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶一甘油一氧化型煙酰胺酶或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶—丙酮酸一氧化型煙酰胺酶或其類似物系統(tǒng)。根據(jù)本申請公開的方法，配制成的單試劑的試劑盒主要成分如下，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解該試劑盒的成分并不限于下述成分，其可以包括與所述成分功能相同的其他等價試劑，也包括:技術(shù)人員所熟知的配制試劑盒所常用的其他成分或物質(zhì)緩沖液胺類化合物a—酮戊二酸還原型輔酶谷氨酸脫氫酶D-葡萄糖穩(wěn)定劑防腐劑螯合劑表面活性劑反應(yīng)加速劑50—250mM(pH7.O-ll.0)5—30mM5—20mM0.2-0.4mM0.2-5ku5-100mM10—1000U1-30%0.l—3g/L0.l—3g/L0.l_5g/L0.l—5mM8配制本申請的試劑盒所選擇的緩沖液的PH范圍在7.0-11.0之間。所述的緩沖液可以是下列緩沖體系的任意一種Tris—HCL緩沖液、三乙醇胺緩沖液、咪唑鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸緩沖液、磷酸緩沖液等等。上述提及的穩(wěn)定劑可以是選自下述成分的一種或多種乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸銨、硫基乙醇、牛血清白蛋白、乳糖等等。上述提及的螯合劑可以是選自下述成分的一種EDTA，NTA，CyDTA，DTPA，EDTA-OH，TTHA，HIDA酸或者金屬鹽。其使用目的主要在于螯合樣本中的二價金屬離子，減少二價金屬離子對測量的干擾。其優(yōu)選的濃度范圍是0.1-3.0g/L。上述提及表面活性劑為可以是選自下述成分的一種或多種陽離子表面活性劑指十六烷基三甲基溴化銨，十六烷基氯化吡啶等。陰離子表面活性劑是指十二烷基磺酸鈉，十二烷基苯磺酸鈉，膽酸鈉等。兩性表面活性劑是指TritonX系列，垸基、甜菜堿系列等。其優(yōu)選的濃度范圍是0.1-5g/L。木申請的一個具體實施方案中，其檢測MAO的方法操作為1)將樣品(校準(zhǔn)品作樣品)加入到試劑中，使得樣品與試劑的比例為1:91:11，混合均勻，37。C反應(yīng)5分鐘后，讀取固定時間間隔內(nèi)(例如2分鐘、3分鐘、5分鐘)的吸光度，并計算吸光度的變化速率；根據(jù)下述公式計算MA0的活性△A/min*Tv*1000MAO(U/L)=_e氺Sv氺Le:毫摩爾消光系數(shù)Tv:總反應(yīng)體積(mL)Sv:樣品體積(mL)L:比色杯光徑(cm)以下將結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，其中實施例僅僅是說明而非限定的作用，本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以在以下披露的具體實施例的技術(shù)上作出改進(jìn)，但是不超過本發(fā)明權(quán)利要求的范圍或者本發(fā)明精神之內(nèi)所作出的改進(jìn)都會落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體實施方案實施例1:試劑盒的單試劑的配制本申請示例性的配制了3種單試劑的試劑盒，其配制原料、配制步驟以及獲得的3種單試劑的成分分別為l)試劑的配制所需原料<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2)配置方法將各種物質(zhì)在室溫下在少量的去離子水中溶解，然后混勻在緩沖液中，調(diào)pH為7.0~11.0、定容體積，4一『C放置4一7天即可使用。3)獲得的3種單試劑的試劑盒(分別命名為試劑盒I、試劑盒n和試劑盒ni)的成分如下試劑盒I:Tris-Hcl緩沖液50mM芐胺5mMa—酮戊二酸5mM還原型輔酶0.2mM谷氨酸脫氫酶0.2kn甘露糖醇0.1%D-葡萄糖5mM葡萄糖脫氫酶10UEDTAlg/L關(guān)3lg/LADP—K0.lmMTritonx-100lg/L試劑盒n盒磷酸緩沖液100mM節(jié)胺20mMa—酮戊二酸10mM還原型輔酶0.25mM谷氨酸脫氫酶275u甘露糖醇0.1%丙酮酸20mM乳酸脫氫酶70UEDTA2g/LNaN32g/LADP—K1.5mMTritonx_1005g/L試劑in:雙甘氨肽緩沖液250mM節(jié)胺30mMa—酮戊二酸20rnM還原型輔酶0.4mM谷氨酸脫氫酶5ku甘露糖醇0.5%葡萄糖6磷酸lOOmM葡萄糖6磷酸脫氫酶1000UEDTA3g/LNaN33g/LADP—K5mMTritonx—1005g/L實施例2:用試劑盒檢測樣品中MAO的方法和歩驟1)檢測參數(shù)為溫度37°C波長340nm(主)&405nm(副)比色杯光徑1.0cm測試方法速率法反應(yīng)方向負(fù)反應(yīng)2)檢測歩驟為首先以水調(diào)零，進(jìn)行校準(zhǔn)；然后加入0.018ml的樣本；之后加入0.18ml試劑，在37。C孵育4分鐘后，測試2分鐘，計算測試時間段每分鐘平均吸光度的變化(AA/min)。理論K值為一1740。3)血清中MAO的正常參考值0—12U/L實施例3:檢測試劑盒i、n、in的抗干擾能力同時對實施例l配置的3種單試劑盒，即試劑盒i、n、in的性能進(jìn)行如下檢測1、試劑盒的抗干擾實驗分別按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)配置含有抗壞血酸、膽紅素、Hb不同濃度的待測樣品，采用試劑盒i、n、in在檢測儀器中檢測樣品中MAO的活性，從而檢測三種試劑盒對各種干擾物的抗干擾能力(每個樣品一式三份，取其平均值)。檢測結(jié)果(平均值)如表l所示12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表1的結(jié)果表明，當(dāng)抗壞血酸《50mg/dL、膽紅素《40mg/dL或者Hb《200mg/dL時，其不影響試劑盒I、II、III樣品中MAO的檢測，即所述的干擾物并不對試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾。2試劑盒的抗氨干擾試驗分別按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)配置含有不同濃度的氨的待測樣品，采用試劑盒I、II、III在檢測儀器中檢測樣品中MAO的活性，從而檢測三種試劑盒對氨的抗干擾能力(每個樣品一式三份，取其平均值)。實驗結(jié)果如表2所示表2:干擾物tJ配試劑盒檢測的MAO活性(U/L)對照試劑盒檢測的MAO活性(U/L)試劑盒I試劑盒II試劑盒ni10%水8.27.97.91.8310%250uM氨8.68.87.62.310%500uM氨8.98.58.92.37血.10%1000iiM氨10.19.89.73潔基質(zhì)10%2000uM氨12.1U.711.73.510%3000uM氨13.713.7n4.0310%4000uM氨15.314.815.44.7310%5000uM氨17.616.616.85.43表2的結(jié)果表明當(dāng)氨的干擾達(dá)到50uM吋，不會影響本申請的試劑盒對MAO的檢測，因此說明本申請公開的試劑盒可以抗《50uM的氨的干擾，而對照試劑盒不抗氨干擾。實施例4:檢測試劑盒工、II、III的準(zhǔn)確性和精密度分別采用本領(lǐng)域常規(guī)的檢測方法，對實施例1制備的試劑盒I、n、工n的準(zhǔn)確性和精密度進(jìn)行檢測。1.準(zhǔn)確性對靶值為8的質(zhì)控液在相同條件下，采用試劑盒I、II、III對同一質(zhì)控液的MAO活性連續(xù)檢測6次，將檢測結(jié)果的平均值與靶值范14圍(4-12)進(jìn)行比較，以檢測所述的試劑盒的準(zhǔn)確性。對試劑盒I、II、III的準(zhǔn)確性的檢測結(jié)果如表3所示表3<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>4表3的結(jié)果表明試劑盒I、II、III的6次檢測結(jié)果的平均值在靶值范圍(4-12)內(nèi)，不準(zhǔn)確度相對偏差(CV(%))不超過±5%。說明本申請公開的三種試劑盒的準(zhǔn)確度符合診斷試劑盒的技術(shù)指標(biāo)。1.精密度在相同條件下，采用試劑盒I、n、III對一份血清的MAO活性連續(xù)檢測20次，比較每個試劑盒的變異系數(shù)，以檢測所述的試劑盒的精密度。對試劑盒I、II、III的精密度的檢測結(jié)果如表4所示:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>178.26.52187.56.22.21985.92208.46.22平均值8.196.3452.15標(biāo)準(zhǔn)差0.2530.26050J55變異系數(shù)％3.14.17.2表4的結(jié)果表明試劑盒I、II、III檢測的同一樣品的MAO活性的變異系數(shù)不超過±10%，說明本申請公開的三種試劑盒的精密度符合診斷試劑盒的技術(shù)指標(biāo)。實施例5:試劑盒i、n、in的靈敏度檢測采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將空白液和同一份用生理鹽水進(jìn)行等比稀釋10個梯度的樣品，在檢測儀器上采用試劑盒i、n、III連續(xù)對吸光度測定14次，讀取每次測定原始吸光度值，然后計算出扣除空白吸光度后的各樣品的吸光度的值，計算其均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差。這里采用99.7%的可能性來計算檢測低限。將每個樣本的均值減去3倍的各自的標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后與空白液的3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差比較，如果前者高于后者，我們就認(rèn)定有99.7%的可能性出現(xiàn)的最小吸光度一定大于空白的吸光度，能定量的報告結(jié)果。1)試劑盒I的測值的原始吸光度的數(shù)據(jù)(表5)表5樣品濃度(U/L)00.78〗.552.333.113.894.665.446.226.997.77檢測次數(shù)吸光泣A(X10000)i-l251201927333740442045131721253135424317-l04418182132323847411714202230353745503513n1927353242426-104481821323238477-1651013192131393840810615192425293541469-l1510719253236415010-l55111718222534394811035101723243036374812026101717243132394313136112015273036394814網(wǎng)l351219192526344145均值-l341219192526344145sd-0.3333332.45.2142857217.42857119.2142862430.534.64285739.42857145.4285713sd0.81649662.44948972)扣除空白后的吸光度數(shù)據(jù)(表6)表6樣品濃度(u/L)00.781.552.333.113.894.665.446.226.997.77吸光度A—A0(X10000)1351221202734384145245131721253135424331515191922333339484061314192129343644_531317192735324242615151919223333394877611142322324039418-l514182024283440459261181926333742511066121823232635404911351017171930363748122610171424313239431325101920262935384714461320202627354246均值45132020262735424618<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表5和6的結(jié)果表明，試劑盒I的生物檢測限是0.00054△A/u/L2)試劑盒II的測值的原始吸光度的數(shù)據(jù)(表7)表7<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表7和8的結(jié)果表明，試劑盒II的生物檢測限是0.00044△A/u/L3)試劑盒III的測值的原始吸光度的數(shù)據(jù)(表9)表9<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>21吸光度A—A0(X10000)113101918253236394322311151923293340413-1313171920313137464-24111217192732344251311151725333040406-l313171720313137467549122120303837398隱33121618222632384390491617243135404910441016221243338471113815151728343546120481512222930374113038171824273336451424111818242533404415231118182425334044均值0.7333333333.410.33333315.86666717.6666672228.53333332.93333337.86666743.733oosd2.1201976550.50709261.67616341.99523242.19306272.42015352.79965982.18653891.95910572.8149262Cv%28914.9116.2212.5712.41119.816.645.176.44A扁3sd-5.62731.87875.3047(A-3sd)&3sd<<>>>(A-3sd)&3sd2.4492.4492.4492.44952.4495表9和10的數(shù)據(jù)表明，試劑盒III的生物檢測限是0.0010AA/u/L實施例6試劑盒I、II、ni的臨床肝癌、肝纖維化患者測值從醫(yī)院收取已經(jīng)確診為肝癌、肝纖維化等肝病患者血清樣本，在Olympus400上，用配制好的試劑盒按照常規(guī)方法檢測樣品的MAO活性，其結(jié)果如表ll所示表1122<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表11的結(jié)果說明用本申請公開的3種試劑盒對已確診的臨床樣品的MAO活性的檢測結(jié)果與臨床病癥相符，說明本申請公開的3種試劑盒可以適用于臨床對MAO活性的檢測。總之，本申請的優(yōu)勢在于，單試劑盒，操作簡單，使用方便，可以應(yīng)用于全自動和半自動等各種生化分析儀器上；通過加長反應(yīng)延遲時間加速反應(yīng)消除內(nèi)外源氨的干擾，偶聯(lián)輔酶的循環(huán)再生系統(tǒng)，增強(qiáng)試劑的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、抗干擾性，長時間存放之后仍可以準(zhǔn)確測定樣本中的單胺氧化酶的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本申請公開的方法及由此生產(chǎn)的單試劑盒可以廣泛應(yīng)用于Hitachi、Olympus和Synchron各種全自動生化分析儀。各儀器的測定條件如下溫度37攝氏度、反應(yīng)時間4分鐘、測試主波長340nm、副波長405nm、測定樣本與試劑盒的比例是1:10，反映方向為負(fù)反應(yīng)，延遲時間為4分鐘，檢測時間2分鐘，理論K值為一1746。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和臨床工作人員的經(jīng)驗，在不需要進(jìn)行創(chuàng)造性勞動的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對各種檢測儀器的最佳檢測參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。對各種檢測儀器的參數(shù)的優(yōu)化并沒有超出本申請要求保護(hù)的范圍之外。2權(quán)利要求1、一種測定單胺氧化酶活性的單試劑試劑盒，包括50—250mM，pH7.0-10的緩沖液、5—30mM的胺類化合物、5-20mM的α—酮戊二酸、0.2—0.4mM的還原型輔酶、0.2—5Ku的谷氨酸脫氫酶，其特征在于還包括由再生系統(tǒng)酶、底物和輔酶組成的再生酶循環(huán)系統(tǒng)。2、根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述的再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括濃度為5—100mM的底物、10—1000u的系統(tǒng)酶。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述的再生酶循環(huán)系統(tǒng)的反應(yīng)速率小于主反應(yīng)的速率，不干擾主反應(yīng)。4、根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其中所述的再生酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶一葡萄糖一還原型輔酶或其類似物系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸脫氫酶一葡萄糖6磷酸一還原型輔酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶一甘油一還原型輔酶或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶一丙酮酸一還原型輔酶或其類似物系統(tǒng)；或者葡萄糖脫氫酶一葡萄糖一氧化型輔酶或其類似物系統(tǒng)、葡萄糖6磷酸脫氫酶一葡萄糖6磷酸一氧化型輔酶或其類似物系統(tǒng)、甘油脫氫酶一甘油一氧化型輔酶或其類似物系統(tǒng)、乳酸脫氫酶一丙酮酸一氧化型輔酶或其類似物系統(tǒng)。5、根據(jù)權(quán)利要求4的試劑盒，其特征在于所述的氧化型輔酶是氧化型煙酰輔酶或其類似物，還原型輔酶是氧化型煙酰輔酶或其類似物相應(yīng)的還原型煙酰輔酶或其類似物。6、根據(jù)權(quán)利要求5的試劑盒，其特征在于氧化型煙酰輔酶或其類似物是NAD、NADP、thio-NAD或thio-NADP，還原型煙酰輔酶或其類似物是NADH、NADPH、thio-NADH或thio-NADPH。7、根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其特征在于所述的還原型輔酶NADH的吸光度在0.6—2.0之間，波長340nm，光徑10mm。8、根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于還包括0.l-3g/L的螯合劑、0.l-3g/L的防腐劑、1-30%的穩(wěn)定劑、0.l—5g/L的表面活性劑、0.l—5mM的反應(yīng)加速劑。9、根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述的胺類化合物選自芐胺、丁基胺、戊基胺、3—苯乙基胺、酪胺或其衍生物。10、根據(jù)權(quán)利要求1或2的試劑盒，其特征在于所述的緩沖液選自三羥甲基氨基甲烷一鹽酸緩沖液、三乙醇氨緩沖液、咪唑一鹽酸緩沖液、雙甘氨肽緩沖液、碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖液、硼酸一硼酸鈉緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液、磷酸緩沖液或者磷酸鹽緩沖液。11、根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其特征在于所是的穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、牛血清白蛋白、乙二胺四乙酸、硫基乙醇、甘露醇、乳糖、黃素腺嘌呤二核苷酸和黃素單核苷酸中的一種或幾種。12、根據(jù)權(quán)利要求8的試劑盒，其特征在于所述的表面活性劑是陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性表面活性劑。13、一種再生酶循環(huán)系統(tǒng)可擴(kuò)展用于制備檢測二氧化碳、腺苷脫氨酶、氨、肌酐、尿素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的單試劑試劑盒中的用途。全文摘要本申請公開了一種單試劑檢測血清中單胺氧化酶MAO的診斷試劑盒。該試劑盒利用單胺氧化酶水解芐胺、丁基胺、戊基胺、β-苯乙基胺等胺類化合物產(chǎn)生氨，再偶聯(lián)谷氨酸脫氫酶反應(yīng)，將還原型輔酶反應(yīng)成氧化型輔酶，通過測定340nm處吸光度的下降速度，定量反應(yīng)出樣本中單胺氧化酶活性的大小，另外本申請在體系中加入能緩慢生成還原型煙酰輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，在試劑中形成酶—底物—輔酶的慢反應(yīng)系統(tǒng)，使得輔酶能緩慢循環(huán)補(bǔ)充，當(dāng)濃度達(dá)到一定平衡的時候，就可以使試劑達(dá)到穩(wěn)定的目的。這種單試劑的試劑盒使用方便、簡潔，可以在普通紫外/可見光分析儀或者半自動/全自動生化分析儀上快速檢測，不需要特殊或者額外的儀器，其成本也低廉。文檔編號G01N21/31GK101498662SQ20081005702公開日2009年8月5日申請日期2008年1月29日優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日發(fā)明者溫云飛申請人:北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司