專利名稱：堿溶性香菇多糖提取、分離、純化及分子量的測定的制作方法
堿瘠性香恭多l(xiāng)lli取、分離、純皿分子量的翻定撥術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明是對現(xiàn)有香菇多糖提取工藝的改進，公開了堿溶性番菇多 糖提取、分離、純化新工藝及分子量測定的新方法。以香菇子實體為 原料進行提取、分離、純化、涉及天然生物反應調(diào)節(jié)劑的制備及其檢 測方法。
背景技術(shù)：
香菇中富含蛋白質(zhì)、雜多糖和香菇多糖等多種成分，是我國傳統(tǒng) 的中藥材，具有補肝益氣的作用。香菇多糖(英文名Lentinan),其 —級餘構(gòu)是e-(卜3)葡萄糖為主鏈，0- (1-6)葡萄糖為側(cè)鏈的葡 聚糖:，是一種免疫調(diào)節(jié)型抗腫癯輔助藥物。1965年日本千原吳郎發(fā) 現(xiàn)^t抗腫瘤活性后，各國科學家就對香菇多糖進行廣泛研究，發(fā)現(xiàn) 香燕多糖不但治療多種免疫缺乏疾病，如慢性病毒性肝炎和由病毒引 起的慢性疾病，還能對多種腫癯有較強的抑制和治療作用。1985年 曰本首先開發(fā)成功注射用香菇多糖作為抗腫瘤新藥上市。我國1988 年開始進口日本味之素的香菇多糖，并用于臨床。香菇多糖提取工藝十分復雜，香菇除含有多糖物質(zhì)外，還含有一 定量蛋白質(zhì)、膠質(zhì)、粗纖維及脂肪等成分。目前常采用的方法是沸水 浸提乙醇析出的方法，而這樣提取多糖的純度并不高，仍需經(jīng)過一系 列后續(xù)處理才能使多糖含量達到90%左右。此提取步驟不僅耗費了大量的乙醇。而且得到的香菇多糖含量并不高,遣成后續(xù)工藝處理復雜。有關(guān)香菇多糖的分子量測定，目前我國均采用GPC凝膠色譜(示差儀)測定a由于所采用的凝膠柱型號各不相同，對分子量的測定誤差很大， 無法準確判斷香菇多糖原料是否合格。為了使香菇多糖原料分子量測定更準確，我們用GPC凝膠色譜儀激光光散射的方法來測定香菇多糖的分子量，該方法是通過香薛多糖粒徑來判斷分子量的大小，再計算 出重均分子量。具有測定分子量簡便、準確率高、無霈對照品，即可 測出香菇多糖樣品的準確分子量。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的就是為了尋找一種新的較為易于生產(chǎn)、成本低、目標 明確、檢測方便、可行的堿溶性番菇多糖的提取、分離、純化新工藝 及其分子量測定方法。香菇多糖提取、分離、純化具體過程通過下列步驟實施-千香菇一粉碎一堿提3次(40-50t:) 一濃縮一堿洗—水洗—級 分一低溫千燥一粗品溶解—離心一上淸液上DEAE纖維素純化，離子 交換樹脂柱吸附一過濾一超濾膜濃縮一測分子量一透析，透析物冷 凍干燥 操作工藝l.取干香薛子實體粉碎后，加8—10倍，0.3—lmol/LN幼H溶液、溫 控30-50 r攪拌提取3次。每次3—4小時。合并提取液，濾去不 溶物、濃縮至原液體積8—10分之一。用0.3mol/LNa0H濃縮液洗滌2次再用同樣體積去離子水洗滌2次濃縮液，用茚三酮檢測，基本無 殘余蛋白質(zhì),將洗滌后的濃縮液在快速攪拌下加不同含量的乙醇進行 級分，將級分粘稠物低溫干燥，得粗品，將粗品溶解后離心，取上層 清液上DME纖維素柱除雜純化，用0.15TOl/LNaoH洗脫，合并洗脫 液，上離子交換樹脂柱吸附脫色，合并洗脫液，過濾，按設(shè)定分子量 膜包分別超濾濃縮，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，按分 子量范圍，分別透析、凍干得各組份堿溶性香菇多糖。經(jīng)檢測分子量 為40^80萬Da的堿溶性香菇多糖其外觀、吸濕性、溶解度、比旋度、 熔點、特性粘度、酸堿度、千燥失重、分子量及分子量分布、純度、 含量、紅外吸收光譜(見

圖1、圖2)均與國家標準WS廣(X-032)-2004Z 香茲多糖的規(guī)定一致。提取、分離、純化番菇多糖具體實施方式
實施例1:取合格的干香菇原料8公斤，粉碎后，置于帶夾套的反應鍋中。 加入0.5mol/LNaoH的堿溶液80公斤加熱至40 t ，保溫攪拌4小時, 過濾，殘渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，濃縮至原體積的 十分之一，再加人0. 3mol/LNa0H 2倍于濃縮液的堿液濃縮洗滌2次， 再用同樣體積去離子水濃縮洗滌2次，洗滌后的濃縮液用茚三酮檢測 反應不顯藍紫色。將洗滌后的濃縮液在快速攪拌下用50-70%的乙醇 進行級分，繼續(xù)攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產(chǎn)生、傾去上清液, 沉淀物再用80-90%的酒精溶解攪拌15分鐘后靜置4小時,沉淀產(chǎn)生，沉淀物在50"低溫干燥得無蛋白殘留堿溶性番菇多糖粗品400克。將香菇多糖粗品按1: 100比例溶于0.15mol/L的堿溶液中溶解。 溶解后離心，取上清液，上DEAE纖維素柱除雜化，上離子交換樹脂 柱吸附脫色，洗脫液過濾后分別用5-30萬分子量膜包依次濃縮至最 小體積，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，將不同級別分子 量的濃縮液分別裝入透析袋，用去離子水透析48小時后凍干，得含 量為9挑以上。重均分子量為10萬一,萬Da的各組份香菇多糖共 20克。實施例2:取合格的干香菇原料10公斤，粉碎后，置于帶夾套的反應鍋中。 加入0.5mol/LnaoH的堿溶液100公斤加熱至40匸，保溫攪拌4小 時，過濾，殘渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，濃縮至原體 積的十分之一，再加人0.3mol/L Na0H 2倍于濃縮液的堿液濃縮洗滌 2次，再用同樣體積去離子水濃縮洗絳2次，洗滌后的濃縮液用茚三 酮檢測反應不顯藍紫色。將詵滌后的濃縮液在快速攪拌下用50-70% 的乙醇進行級分，繼續(xù)攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產(chǎn)生、傾去 上清液，沉淀物再用80-90%的酒精溶解攜拌15分鐘后靜置4小時， 沉淀產(chǎn)生，沉淀物在50TC低溫干燥得無蛋白殘留璩溶fe香菇多糖粗 品500克。將番菇多糖粗品按i: 100比例溶于0.15mol/L的堿溶液中溶解。 溶解后離心，取上清液，上腿AE纖維素柱除雜化，上離子交換樹脂柱吸附脫色，洗脫液過濾后分別用5-30萬分子量膜包依次濃縮至最 小體積，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，將不同級別分子 量的濃縮液分別裝入透析袋，用去離子水透析48小時后凍干，得含量為雜%以上。重均分子量為10萬一IOO萬Da的各組份眷菇多糖共 25克。實施例3:取合格的千香菇原料13公斤，粉碎后，置于帶夾套的反應鍋中， 加入0.5mol/LimoH的堿溶液130公斤加熱至40 保溫攪拌4小 時，過濾，殘渣再用上述方法提取2次，合并全部溶液，濃縮至原體 積的十分之一，再加人0.3mol/L NaOH 2倍于濃縮液的堿液濃縮洗滌 2次，再用同樣體積去離子水濃縮洗滌2次，洗滌后的濃縮液用茚三 醣檢測反應不顯藍紫色。將洗滌后的濃縮液在快速攬拌下用50-70% 的乙醇進行級分，繼續(xù)攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產(chǎn)生、傾去 上清液，沉淀物再用80-90%的酒精溶解攪拌15分鐘后靜置4小時， 沉淀產(chǎn)生，沉淀物在501C低溫千燥得無蛋白殘留堿溶性香菇多糖粗 品650克。將香菇多糖粗品按1: 100比例溶于0.15moi/L的堿溶液中溶解。 溶解后離心，取上清液，上DEAE纖維素柱除雜化，上離子交換樹脂 柱吸附脫色，洗脫液過濾后分別用5-30萬分子量膜包依次濃縮至最 小體積，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，將不同級別分子量的濃縮液分別裝入透析袋，用去離子水透析48小時后凍干，得含 量為98%以上。重均分子量為10萬一IOO萬Da的各組份香菇多糖共 32克。實施例4:取合格的千香菇原料12公斤，粉碎后，置于帶夾套的反應鍋中。 加入0.5mol/LnaoH的堿溶液120公斤加熱至40 1C,保溫攪拌4小 時，過濾，殘渣再用上述方法提取2次。合并全部溶液，濃縮至原體 積的十分之一，再加人0.3mol/L NaOH 2倍于濃縮液的堿液濃縮洗滌 2次，再用同樣體積去離子水濃縮洗滌2次，洗滌后的濃縮液用茚三 酮檢測反應不顯籃紫色。將洗滌后的濃縮液在快速攏拌下用50-70% 的乙醇進行級分，繼續(xù)攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產(chǎn)生、傾去 上清液，沉淀物再用80-90%的酒精溶解攪拌15分鐘后靜置4小時，沉淀產(chǎn)生，沉淀物在sot:低溫干燥得無蛋白殘留堿溶性香菇多糖粗品600克。將香菇多糖粗品按1: 100比例溶于O. i5啦l/L的堿溶液中溶解。 溶解后離心，取上清液，上DEAE纖維素柱除雜化，上離子交換樹脂 柱吸附脫色，洗脫液過濾后分別用5-30萬分子量膜包依次濃縮至最 小體積，用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，將不同級別分子 量的濃縮液分別裝入透析袋，用去離子水透析48小矽后凍干，得含 量為98%以上。重均分子量為10萬一IOO萬Da的各組份香菇多糖共 30克。番翁多糖分子量測定方法通過下列步驟實施豕操作工藝1. 流動相的處理采用純度較高的鹽水溶液作為流動相(使用其它 有機溶劑作為流動相處理方法相同)，將溶液過濾并超聲脫氣至少3(teiri,加入凝膠滲透色譜儀的流動相瓶中待用S2. 配制樣品用流動相作溶劑，將香菇多糖用流動相溶解，并稀釋至約.lmg/mL。3. 基線平衡分別將示差折光檢測器多角度靜態(tài)激光光散射儀、機械 泵、柱溫箱及其控制單元的電源打開，并打開儀器操作軟件 ASTRA4.90.08調(diào)節(jié)柱溫30-35^,調(diào)節(jié)機械泵，使流動相的流速緩慢 升至lmL/班in。通過示差折光控制面板上的TAB鍵選中Purge鍵，按 ENTER鍵使之處于Purge ON的狀態(tài)，流動相同時沖洗參比池和樣品 池，開機后，至少讓儀器平衡2h,待兩個檢測器基線穩(wěn)定后再進行 測定。4. 香菇多糖分子量的測定打開軟件Collect菜單，并進一步打開其 中的Sample set子菜單選擇Edit進行編輯，分別輸入香菇多糖樣品 與保存的文件名、保存目錄、采集時間、流動相流速及樣品的dn/dc 值、編輯完畢,按OK鍵。將樣品通過過濾頭注入進樣閥中,打開Inject 菜單選擇Sample Set即打開數(shù)據(jù)采幾窗口，連著按兩次OK按鈕，將 進樣閥的控制閥扳至Inject軟件自動開始采集數(shù)據(jù)。在設(shè)定的時間 內(nèi)采集完數(shù)據(jù)。將采集到數(shù)據(jù)的文件打開，選擇Vi柳菜單中的BaseWne選項，分別拖拽鼠標設(shè)定示差折光檢測器和多角靜態(tài)激光 光散射儀第十一角度檢測器的信號基線，然后選擇Options菜單中的 Autobaseline對其它角度的光散射信號自動設(shè)定基線，基線設(shè)定完 畢后，選擇View菜單中的Peaks項，通過鼠標選定色譜峰區(qū)域，點 擊Reports菜單的Suraary,看所得到的分子量及分子量結(jié)果，更詳 細的結(jié)果可以通過mstrbution菜單來査看。GPC激光光散射凝膠滲 透色譜儀的結(jié)構(gòu)(見圖3) 香雍多糖重均分子量測定方法具體實施方式
實鱅樹l 操作工藝-配制0.鄉(xiāng)Nacl水溶液作為流動相，過濾并超聲脫氣至少3toin，加 入凝膠滲透色譜儀的流動相瓶中待用。用流動相作溶劑，將香菇多糖 樣品A用流動相溶解，并稀釋至約lmg/mL。分別將示差折光檢測器 多角度靜態(tài)激光光散射儀、機械泵、柱溫箱及其控制單元的電源打開， 并打開儀器操作軟件ASTRA4.恥.08調(diào)節(jié)柱溫30-35'C ，調(diào)節(jié)機械泵, 使癱動相的流速緩慢升至1mL/min。通過示差折光控制面板上的TAB 鍵選中Purge鍵，按ENTER鍵使之處于Purge ON的狀態(tài)，流動相同 時沖洗參比池和樣品池，開機后，讓儀器平衡2h,待兩個檢測器基 線穩(wěn)定后，再打開軟件Collect菜單,并進一步打開其中的Sampleset 子菜單選擇Edit進行編輯，分別輸入香菇多糖樣品A與保存的文件 名、保存目錄、釆集時間、流動相流速及樣品的dn/dc值、編輯完畢,按OK鍵。將樣品A通過過濾頭注入進祥閥中，打開Iniect菜單選擇 Sample Set即打開數(shù)據(jù)采集窗口，連著按兩次OK按鈕，將進樣閥的 控制閥扳至Iniect軟件自動開始采集數(shù)據(jù)。在設(shè)定的時間內(nèi)采集完 數(shù)據(jù),將采集到數(shù)據(jù)的文件打開,選擇View菜單中的Baseline選頂， 分別拖拽鼠標設(shè)定示差折光檢測器和多角靜態(tài)激光光散射儀第十一 角度檢淵器的信號基線，然后選擇Options菜單中的Autobaseline 對其它角度的光散射信號自動設(shè)定基線，基線設(shè)定完畢后，選擇Vieir 菜單中的Peaks項，通過鼠標選定色譜峰區(qū)域，點擊R印orts菜單的 Sumary,對所有的級分進行加和計算得到香菇多糖樣品A數(shù)均分子 量為47萬，重均分子量為74萬，Z均分子量為94萬(見圖4)a 實鵬2操作工藝配制0.9% feci水溶液作為流動相，過濾并超聲脫氣至少30min,加 入凝膠滲透色譜儀的流動相瓶中待用。用流動相作溶劑，將香菇多糖 樣品B用流動相溶解，并稀釋至約lmg/iBL。分別將示差折光檢測器 多角度靜態(tài)激光光散射儀、機械泵、柱溫箱及其控制單元的電源打開, 并打開儀器操作軟件ASTRA4.90.08調(diào)節(jié)柱溫30-35'C ，調(diào)節(jié)機械泵, 使流動相的流速緩慢升至1raL/miri。通過示差折光控制面板上的TAB 鍵選中Purge鍵，按ENTER鍵使之處于Purge ON的狀態(tài)，流動相同 時沖洗參比池和樣品池，開機后，讓儀器平衡2h,待兩個檢測器基 線穩(wěn)定后,再打開軟件Collect菜單,并進一歩打開其中的Sample set子菜單選擇Edit進行編輯，分別輸入香菇多糖樣品B與保存的文件 名、保存目錄、采集時間、流動相流速及樣品的dn/dc值、編輯完畢， 按OK鍵。將樣品B通過過濾頭注入進樣閥中，打開IMect菜單選擇 SanpleSet即打開數(shù)據(jù)采集窗口，連著按兩次OK按鈕，將進樣閥的 控制閥扳至Iniect軟件自動開始采集數(shù)據(jù)。在設(shè)定的時間內(nèi)采集完 數(shù)據(jù)a將采集到數(shù)據(jù)的文件打開,選擇View菜單中的Baseline選項， 分別拖拽鼠標設(shè)定示差折光檢測器和多角靜態(tài)激光光散射儀第十一 角度檢測器的信號基線，然后選擇Options菜單中的Autobaseline 對其它角度的光散射信號自動設(shè)定基線，基線設(shè)定完畢后，選擇Vi柳 菜單中的Peaks項，通過鼠標選定色譜峰區(qū)域，點擊feports菜單的 SuraaWT，對所有的級分進行加和計算得到香菇多糖樣品B數(shù)均分子 量為41萬，重均分子量為66萬，Z均分子量為110萬(見圖5)。 實施倒3操作工藝配制0.擲Nacl水溶液作為流動相，過濾并超聲脫氣至少30min,加 入凝膠滲透色譜儀的流動相瓶中待用。用流動相作溶劑，將香菇多糖 樣品C用流動相溶解，并稀釋至約l呢/mL。分別將示差折光檢測器 多角度靜態(tài)激光光散射儀、機械泵、柱溫箱及其控制單元的電源打開, 并打開儀器操作軟件ASTRA4.90.08調(diào)節(jié)柱溫30-351,調(diào)節(jié)機械泵， 使流動相的流速緩慢升至lmL/ndri。通過示差折光控制面板上的TAB 鍵逸中Purge鍵，按ENTER鍵使之處于Purge ON的狀態(tài)，流動相時沖洗參比池和樣品池，開機后，讓儀器平衡2h,待兩個檢測器基 線穩(wěn)定后，再打開軟件Collect菜單,并進一歩打開其中的S,leset 子菜單選擇Edit進行編輯，分別輸入香燕多糖樣品C與保存的文件 名、保存目錄、采集時間、流動相流速及樣品的dn/dc值、編輯完畢, 按0K鍵。將樣品C通過過濾頭注入進樣閥中，打開Iniect菜單選擇 S卿leSet即打開數(shù)據(jù)采集窗口，連著按兩次OK按鈕，將進樣閥的 控制腳扳至Iniect軟件自動開始采集數(shù)據(jù)。在設(shè)定的時間內(nèi)采集完 數(shù)據(jù),將采集到數(shù)據(jù)的文件打開,選擇View菜單中的Baseline選項, 分別拖拽鼠標設(shè)定示差折光檢測器和多角靜態(tài)激光光散射儀第十--角度檢糊器的信號基線，然后選擇Options菜單中的Autobaseli亂、 對其它角度的光散射信號自動設(shè)定基線，基線設(shè)定完畢后，逸擇Vieir 菜單中的Pedes項，通過鼠標選定色譜峰區(qū)域，點擊R印orts菜單的 Sumiary,對所有的級分進行加和計算得到香菇多糖樣品C數(shù)均分子 量為50萬，重均分子量為66萬，Z均分子量為挑萬(見圖6)。
權(quán)利要求
1. 堿溶性香菇多糖提取、分離、純化新工藝及分子量的測定方法，其特征在于取干香菇子實體粉碎后，加水加熱浸提、過濾、濃縮、洗滌、級分、低溫干燥、溶解、離心、DEAE纖維素除雜純化、離子交換樹脂柱吸附脫色、過濾、超濾、濃縮，用GPC凝膠色譜儀測定分子量，按測定分子量的范圍透析、凍干即得本發(fā)明產(chǎn)物。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的浸提方法，其特征在于所用的堿為NaOH、 K0H、 NaHC0a、 K線、線。提取堿溶性香菇多糖的堿液濃度為 0. 3-lmol/L NaOH。溫度范圍在30-60°C 。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述分離方法，其特征在于離心機的轉(zhuǎn)數(shù)為每 分鐘4000-16000轉(zhuǎn)。洗滌應采用0. 1-0. 5mol/Na0H。 二次洗滌應采 用去離子水。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述分離方法，其特征在于中空纖維超濾器的 膜包分子量為1-30萬Da。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于低溫干燥，溫度為45-55 。C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述純化方法，其特征在于纖維素柱采用DEAE 纖維素A25.A50 (二乙胺基乙基纖維素)。陰離子樹脂采用717,陽離 子樹脂采用732。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述純化分離方法，其特征在于洗脫堿液的濃度 為0.1-0. 8mol/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述分子量測定方法，其特征在于釆用wyatt DAWN EOS型多角度激光光散射凝膠色譜儀測定分子量。G P C激光 光散射凝膠色譜儀測定分子量的固定相采用Shodex水系廣普線性凝 膠柱。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述分子量測定方法，其特征在于采用waters 515 高效液相機械泵和wyatt optiiad DSP型示差折光檢測器作為分子量 測定的配套儀器。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述分子量測定方法，其特征在于以 0. 5—l%Nacl水溶液為流動相，流速lmL/min，用于分子量的測定。
全文摘要
本發(fā)明公開了10-100萬Da堿溶性香菇多糖提取、分離、純化新工藝及分子量測定的方法，以香菇子實體為原料，通過粉碎、堿水浸提、過濾、濃縮、洗滌、級分、低溫干燥得粗品、粗品溶解、離心、DEAE纖維素柱除雜純化、離子交換樹脂吸附脫色、過濾通過不同分子量的膜包超濾濃縮。采用GPC激光光散射凝膠色譜儀測定分子量，按測定分子量的范圍，再分別裝入透析袋透析、凍干得分子量為10-100萬Da含量為98％以上的各組分堿溶性香菇多糖。本方法工藝先進、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、純度高、目標明確、易工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號G01N30/00GK101261203SQ20071005164
公開日2008年9月10日 申請日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者周曉海, 王務鼎, 王衛(wèi)健, 胡榮大, 金文準 申請人:金文準;王務鼎;王衛(wèi)健;周曉海;胡榮大