專(zhuān)利名稱(chēng)：可溶性共同刺激分子增強(qiáng)免疫應(yīng)答的用途的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求1999年5月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/132,944號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。
背景技術(shù)：
T細(xì)胞為了響應(yīng)外來(lái)蛋白質(zhì)，抗原呈遞細(xì)胞(APC)必須向靜息T淋巴細(xì)胞提供兩種信號(hào)(Jenkins，M.和Schwartz，R.(1987)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》165，302-319；Mueller，D.L.等(1990)《免疫學(xué)雜志》144，3701-3709)。第一種信號(hào)賦予免疫應(yīng)答以特異性，它是在呈遞在主要組織相容性復(fù)合物(MHC)中的外來(lái)抗原肽的識(shí)別之后經(jīng)由T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)導(dǎo)的。第二種信號(hào)稱(chēng)為共同刺激，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖而成為功能性的(Lenschow等1996《免疫學(xué)年評(píng)》14233)。共同刺激既不是抗原特異性的，也不是MHC限制性的，據(jù)認(rèn)為它是由一種或多種被APC表達(dá)的不同細(xì)胞表面分子所提供的(Jenkins，M.K.等1988《免疫學(xué)雜志》140，3324-3330；Linsley，P.S.等1991《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》173，721-730；Gimmi，C.D.等1991《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》88，6575-6579；Young，J.W.等1992《臨床研究雜志》90，229-237；Koulova，L.等1991《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》173，759-762；Reiser，H.等1992《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》89，271-275；van-Seventer，G.A.等(1990)《免疫學(xué)雜志》144，4579-4586；LaSalle，J.M.等1991《免疫學(xué)雜志》147，774-80；Dustin，M.I.等1989《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》169，503；Armitage，R.J.等1992《自然》357，80-82；Liu，Y.等1992《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》175，437-445)。如果T細(xì)胞是僅通過(guò)T細(xì)胞受體而被刺激的，沒(méi)有接收另外的共同刺激信號(hào)，那么它們會(huì)成為無(wú)應(yīng)答性的、無(wú)反應(yīng)性的，或者死亡，導(dǎo)免疫應(yīng)答的下調(diào)。
在APC上表達(dá)的CD80(B7-1)與CD86(B7-2)蛋白是決定性的共同刺激分子(Freeman等1991《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》174625；Freeman等1989《免疫學(xué)雜志》1432714；Azuma等1993《自然》36676；Freeman等1993《科學(xué)》262909)。B7-2似乎在初次免疫應(yīng)答期間扮演主要角色，而B(niǎo)7-1在免疫應(yīng)答過(guò)程后期受到上調(diào)，它可能對(duì)延長(zhǎng)初次T細(xì)胞應(yīng)答或共同刺激再次T細(xì)胞應(yīng)答來(lái)說(shuō)是重要的(Bluestone，1995《免疫》2555)。
一種與B7-1和B7-2結(jié)合的配體是CD28，它在靜息T細(xì)胞上組成型表達(dá)，在活化之后表達(dá)增加。通過(guò)T細(xì)胞受體發(fā)信號(hào)之后，CD28的連接反應(yīng)和共同刺激信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌IL-2(Linsley，P.S.等1991《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》173，721-730；Gimmi，C.D.等1991《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》88，6575-6579；June，C.H.等1990《今日免疫學(xué)》11，211-6；Harding，F(xiàn).A.等1992《自然》356，607-609)。第二種配體稱(chēng)為CTLA4(CD152)，它與CD28是同源的，但不在靜息T細(xì)胞上表達(dá)，而出現(xiàn)在T細(xì)胞活化之后(Brunet，J.F.等1987《自然》328，267-270)。與CD28相反，CTLA4似乎對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)來(lái)說(shuō)是決定性的(Waterhouse等1995《科學(xué)》270985)。CTLA4的阻斷已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可除去抑制信號(hào)，而CTLA4的聚集已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可提供下調(diào)T細(xì)胞應(yīng)答的抑制信號(hào)(Allison和Krummel，1995《科學(xué)》270932)。
對(duì)開(kāi)發(fā)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法一直存在迫切需要。例如，迄今為止利用本領(lǐng)域公認(rèn)的方法還難以增加對(duì)某些病毒和腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。用于普遍增強(qiáng)免疫應(yīng)答、特別是增強(qiáng)對(duì)腫瘤抗原和感染因子(例如病毒、細(xì)菌和/或寄生物抗原)的應(yīng)答將大有裨益。
發(fā)明概述本發(fā)明提供通過(guò)操縱共同刺激途徑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法。這些方法對(duì)增加對(duì)腫瘤抗原和來(lái)自感染因子的抗原的應(yīng)答來(lái)說(shuō)是特別有效的。本發(fā)明至少在部分程度上基于這樣的發(fā)現(xiàn)，共同刺激分子的可溶形式能夠預(yù)防性和治療性增強(qiáng)免疫應(yīng)答。盡管本發(fā)明的可溶性共同刺激分子不是在固相上給藥的(例如不是在細(xì)胞上給藥的)，而且是在沒(méi)有交聯(lián)劑的存在下給藥的，也見(jiàn)到了這種增強(qiáng)作用。這些發(fā)現(xiàn)是特別驚人的，因?yàn)楦鶕?jù)現(xiàn)有教導(dǎo)，B7-1和B7-2分子的可溶形式不能產(chǎn)生共同刺激應(yīng)答(Hayden等1996《組織抗原》48242；U.S.專(zhuān)利5,580,756)。
因此，本發(fā)明在一方面提供預(yù)防性增強(qiáng)受治療者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，即，將包含共同刺激分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性組合物給藥，以便增強(qiáng)該受治療者對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明在另一方面提供治療性增強(qiáng)受治療者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，即，將包含共同刺激分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性組合物給藥，以便增強(qiáng)該受治療者對(duì)該抗原的免疫應(yīng)答。
在一種實(shí)施方式中，該共同刺激分子選自由B7-1和B7-2組成的組。
另一方面，本發(fā)明提供增強(qiáng)受治療者對(duì)I類(lèi)限制性抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，即，將包含I類(lèi)限制性抗原或其片段的第一種試劑和包含B7分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性組合物給藥，以便一旦對(duì)該受治療者給藥即增強(qiáng)對(duì)I類(lèi)限制性抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
在一種實(shí)施方式中，這些方法進(jìn)一步包括將II類(lèi)限制性抗原對(duì)該受治療者給藥。在另一種實(shí)施方式中，這些方法進(jìn)一步包括將佐劑對(duì)該受治療者給藥。
在一種實(shí)施方式中，該B7分子是B7-1分子。在另一種實(shí)施方式中，該B7分子是B7-2分子。
在一種實(shí)施方式中，該共同刺激分子是單特異性的。在另一種實(shí)施方式中，該共同刺激分子是二聚體和二價(jià)的。在一種實(shí)施方式中，該可溶性共同刺激分子是單特異性的和二聚體和二價(jià)的。
在本發(fā)明的另外一種實(shí)施方式中，B7分子的細(xì)胞外部分是與包含免疫球蛋白分子一部分的第二種蛋白質(zhì)或多肽融合的。在一種實(shí)施方式中，該部分免疫球蛋白分子包含半胱氨酸殘基。在一種實(shí)施方式中，該部分免疫球蛋白分子包含人免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2與CH3區(qū)。在另一種實(shí)施方式中，該部分免疫球蛋白分子包含人免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH1、CH2與CH3區(qū)。在一種實(shí)施方式中，該免疫球蛋白分子已經(jīng)經(jīng)過(guò)修飾，減少了補(bǔ)體固定和/或Fc受體結(jié)合。
在一種實(shí)施方式中，該抗原是腫瘤細(xì)胞抗原。
在另一種實(shí)施方式中，該受治療者患有選自下組類(lèi)型的癌癥結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肥大細(xì)胞瘤、肉瘤和膀胱癌。
在一種實(shí)施方式中，該抗原選自由細(xì)菌抗原、病毒抗原和寄生物抗原組成的組。
在一種實(shí)施方式中，該免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫應(yīng)答。在另一種實(shí)施方式中，該免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答。
圖例說(shuō)明

圖1顯示用II類(lèi)限制肽免疫小鼠細(xì)胞的抗原特異性增殖應(yīng)答，同時(shí)有或沒(méi)有B7-2Ig(100μg)的共同給藥。
圖2顯示在初次免疫時(shí)接受單一B7-2Ig治療的小鼠細(xì)胞在再次免疫后比從未接受B7-2Ig的小鼠具有更大的增殖應(yīng)答。數(shù)據(jù)來(lái)自平行實(shí)驗(yàn)。
圖3顯示B7-2Ig的共同給藥增強(qiáng)對(duì)I類(lèi)限制肽免疫的CTL應(yīng)答。
圖4顯示在有或沒(méi)有II類(lèi)限制肽和B7-2Ig治療的存在下，用I類(lèi)限制肽免疫小鼠的CTL應(yīng)答。
圖5顯示B7-IgG為脾細(xì)胞的體外增殖和淋巴因子分泌提供共同刺激信號(hào)。
圖6顯示B7Ig在預(yù)防性腫瘤疫苗模型中是有效的佐劑。
圖7顯示用混合有B7-1-或B7-2-IgG的輻射處理P815腫瘤細(xì)胞治療性接種小鼠誘導(dǎo)腫瘤消退，延長(zhǎng)存活期。
圖8顯示用以B7-IgG作為佐劑的治療性輻射處理腫瘤細(xì)胞疫苗免疫小鼠對(duì)若干不同的小鼠腫瘤模型是有效的。
圖9顯示單獨(dú)的B7-IgG的治療性給藥對(duì)小鼠的抗腫瘤作用與其作為疫苗佐劑的作用相當(dāng)。
圖10顯示T或B細(xì)胞是B7-IgG-介導(dǎo)的抗腫瘤活性所需的。
圖11顯示CD8+、而非CD4+T細(xì)胞是介導(dǎo)B7-IgG抗腫瘤活性所需的。
圖12顯示已建立腫瘤的B7-IgG療法與宿主IFN-γ無(wú)關(guān)。
詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明提供增強(qiáng)免疫應(yīng)答的改進(jìn)方法，即，將可溶性共同刺激分子(例如B7分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或B7融合蛋白)給藥，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答?？扇苄怨餐碳し肿釉诮o藥時(shí)沒(méi)有交聯(lián)劑，仍然驚人地刺激T細(xì)胞應(yīng)答。事實(shí)上，申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本方法比呈遞在表面上的共同刺激分子增加了共同刺激水平，例如細(xì)胞表面上的共同刺激分子。
在發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明之前，為了方便起見(jiàn)，這里收集了用在說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例和附后權(quán)利要求書(shū)中的某些術(shù)語(yǔ)。
I、定義本文所用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防性”包括共同刺激分子在接觸抗原之前或與此同時(shí)給藥，針對(duì)該抗原形成、增加和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療性”包括共同刺激分子給藥治療現(xiàn)有或進(jìn)行中的感染或疾病(例如癌癥或者病毒或細(xì)菌感染)，用共同刺激分子治療將對(duì)該感染或疾病有益。關(guān)于治療性處理，將共同刺激分子在接觸抗原之后某一時(shí)間點(diǎn)給藥，針對(duì)該抗原形成、增加和/或增強(qiáng)免疫應(yīng)答。不言而喻，用共同刺激分子治療性處理對(duì)受治療者的免疫應(yīng)答還可能具有其他有益效果，例如不是該特定抗原所特有的。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫細(xì)胞”包括造血起源的并且在免疫應(yīng)答中扮演角色的細(xì)胞。免疫細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞，例如B細(xì)胞和T細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞；骨髓細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和粒細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”包括T和/或B細(xì)胞應(yīng)答，也就是細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。在一種實(shí)施方式中，所要求保護(hù)的方法可以用于減少T輔助細(xì)胞應(yīng)答。在另一種實(shí)施方式中，所要求保護(hù)的方法可以用于減少細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。所要求保護(hù)的方法可以用于減少初次與再次免疫應(yīng)答。受治療者的免疫應(yīng)答例如可以通過(guò)測(cè)定抗體產(chǎn)生、免疫細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)、細(xì)胞毒性等加以測(cè)定。
本文所用的關(guān)于活化免疫細(xì)胞的術(shù)語(yǔ)“共同刺激”包括共同刺激分子提供第二種非活化受體介導(dǎo)信號(hào)(“共同刺激信號(hào)”)的能力，該信號(hào)誘導(dǎo)增殖或效應(yīng)器功能。例如，共同刺激信號(hào)能夠例如在已經(jīng)接受T細(xì)胞受體介導(dǎo)信號(hào)的T細(xì)胞中導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌。本文所用的術(shù)語(yǔ)“共同刺激分子”包括存在于抗原呈遞細(xì)胞上的分子(例如B7-1、B7-2、B7RP-1(Yoshinaga等1999《自然》402827)、B7h(Swallow等1999《免疫》11423)和/或有關(guān)分子(例如同系物))，它們與T細(xì)胞上的共同刺激受體(例如CD28、CTLA4、ICOS(Hutloff等1999《自然》397263)、B7h配體(Swallow等1999《免疫》11423)和/或有關(guān)分子)。本文也將這些分子總稱(chēng)為“B7分子”。
本文所用的措辭“B7”或“B7分子”包括天然存在的B7-1分子、B7-2分子、B7RP-1分子(Yoshinaga等1999《自然》402827)、B7h分子(Swallow等1999《免疫》11423)、結(jié)構(gòu)上有關(guān)的分子、這些分子的片段和/或其功能等價(jià)物。術(shù)語(yǔ)“等價(jià)物”試圖包括編碼功能相當(dāng)?shù)墓餐碳し肿拥陌被嵝蛄校鼈兙哂蠦7分子的活性，例如與免疫細(xì)胞上的天然B7配體結(jié)合的能力，例如T細(xì)胞上的CTLA4、ICOS和/或CD28，和/或調(diào)制免疫細(xì)胞共同刺激的能力。
本文所用的“多肽”指的是任意包含兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的肽或蛋白質(zhì)，這些氨基酸通過(guò)肽鍵或改性肽鍵彼此連接?！岸嚯摹敝傅氖嵌替?，通常稱(chēng)為肽、寡肽和寡聚物，和長(zhǎng)鏈，一般稱(chēng)為蛋白質(zhì)。多肽可以含有除20種基因編碼氨基酸以外的氨基酸。“多肽”不僅包括經(jīng)過(guò)自然過(guò)程修飾的那些，例如加工和其他轉(zhuǎn)譯后修飾，而且包括經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾技術(shù)修飾的那些。這樣的修飾充分描述在基礎(chǔ)文章和更詳細(xì)的專(zhuān)著以及長(zhǎng)篇研究文獻(xiàn)中，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。人們將領(lǐng)會(huì)到，在給定的多肽中，相同類(lèi)型的修飾可以在相同或不同程度上存在于若干位置上。而且，給定的多肽可以含有多種類(lèi)型的修飾。修飾可以發(fā)生在多肽中的任意各處，包括多肽骨架、氨基酸側(cè)鏈和氨基或羧基末端。修飾例如包括乙酰化、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵生成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)的生成、半胱氨酸的生成、焦谷氨酸鹽的生成、甲?；ⅵ?羧基化、糖基化、GPI錨定物生成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊烯基化、外消旋化、脂質(zhì)連接、硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧基化、羥基化與ADP-核糖基化、硒酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸加成為蛋白質(zhì)(例如精氨?；?和遍在蛋白化。例如參見(jiàn)《蛋白質(zhì)——結(jié)構(gòu)與分子性質(zhì)》第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)；Wold，F(xiàn).“轉(zhuǎn)譯后的蛋白質(zhì)修飾觀點(diǎn)與展望”，《蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯后共價(jià)修飾》pgs.1-12，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York(1983)；Seifter等《酶學(xué)方法》182626-646(1990)；Rattan等“蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)譯后修飾與老化”《Ann.N.Y.Acad.Sci.》66348-62(1992)。多肽可以是支鏈的或者是帶有或不帶有分支的環(huán)狀。環(huán)狀、支鏈和帶有分支的環(huán)狀多肽可以從轉(zhuǎn)譯后的自然過(guò)程獲得，也可以完全利用合成方法制備。
本文所用的“分離的多肽”或“分離的蛋白質(zhì)”指的是這樣的多肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)從細(xì)胞中分離后或者用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)時(shí)，基本上不含其他多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞材料和培養(yǎng)基，或者當(dāng)用化學(xué)方法合成時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品?！胺蛛x的”或“純化的”多肽或其生物活性部分基本上不含來(lái)自該細(xì)胞或衍生B7多肽的組織來(lái)源的細(xì)胞材料或其他污染性多肽，或者當(dāng)用化學(xué)方法合成時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。措辭“基本上不含細(xì)胞材料”包括其中該多肽是從該細(xì)胞的細(xì)胞組分中分離的B7多肽制劑，從該細(xì)胞分離或者用重組方法生產(chǎn)該多肽。在一種實(shí)施方式中，措辭“基本上不含細(xì)胞材料”包括非B7多肽(本文也稱(chēng)為“污染性多肽”)少于約30％(以干重計(jì))的B7多肽制劑，更優(yōu)選為非B7多肽少于約20％，進(jìn)而更優(yōu)選為非B7多肽少于約10％，最優(yōu)選為非B7多肽少于約5％。當(dāng)B7多肽或其生物活性部分是用重組方法生產(chǎn)的時(shí)，它還優(yōu)選地基本上不含培養(yǎng)基，也就是說(shuō)，培養(yǎng)基占多肽制劑體積的不到約20％，更優(yōu)選為少于約10％，最優(yōu)選為少于約5％。
措辭“基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品”包括其中該多肽是從參與該多肽合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)品中分離的B7多肽制劑。在一種實(shí)施方式中，措辭“基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品”包括化學(xué)前體或非B7化學(xué)品少于約30％(以干重計(jì))的B7多肽制劑，更優(yōu)選為化學(xué)前體或非B7化學(xué)品少于約20％，進(jìn)而更優(yōu)選為化學(xué)前體或非B7化學(xué)品少于約10％，最優(yōu)選為化學(xué)前體或非B7化學(xué)品少于約5％。
優(yōu)選的B7核酸分子與多肽是“天然存在的”。本文所用的“天然存在的”分子指的是具有天然存在的核苷酸序列(例如編碼天然B7多肽)的B7分子。另外，還有這些多肽與核酸分子的天然或非天然存在的變體，它們保留了相同的功能活性，例如調(diào)制對(duì)應(yīng)激反應(yīng)的適應(yīng)作用和/或微生物毒力的能力。這樣的變體可以這樣制備，例如利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)進(jìn)行突變。作為替代選擇，變體可以用化學(xué)方法合成。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“變體”包括這樣的核酸分子或多肽，它們?cè)谛蛄猩喜煌趨⒄蘸怂岱肿踊蚨嚯模潜Ａ羝浔匾再|(zhì)。變體核苷酸序列的變化可能改變、也可能不改變被參照核酸分子編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸的變化可以導(dǎo)致在被參照序列編碼的多肽中發(fā)生氨基酸的取代、加成、刪去、融合和截?cái)?，討論?jiàn)下。典型的多肽變體在氨基酸序列上不同于另一種參照多肽。差異一般是有限的，以致參照多肽與變體的序列總的說(shuō)來(lái)是非常相似的，并且在很多區(qū)域是同一的。變體和參照多肽在氨基酸序列上可以通過(guò)任意組合的一種或多種取代、加成和/或刪去加以區(qū)別。核酸分子或多肽的變體可以是天然存在的，例如等位變體，或者它可以是未知是否天然存在的變體。非天然存在的核酸分子與多肽變體可以通過(guò)技術(shù)人員已知的誘變技術(shù)、直接合成和其他重組方法加以制備。
例如，不言而喻的是，本文所述的B7多肽還包括其等價(jià)物。這樣的變體例如可以這樣制備，利用本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行突變。作為替代選擇，變體可以用化學(xué)方法合成。例如，利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)可以制備B7多肽的突變形式，它們?cè)诠δ苌鲜堑葍r(jià)的(例如具有與CTLA4和/或CD28結(jié)合的能力)。突變例如可以包括至少一種分散的點(diǎn)突變，后者可以引起取代，或者包括至少一種刪去或插入。例如，可以使用隨機(jī)誘變。突變還可以通過(guò)隨機(jī)誘變或者利用盒式誘變來(lái)完成。關(guān)于前者，分子的完整編碼區(qū)被若干方法(化學(xué)、PCR、摻雜寡核苷酸合成)之一誘變，對(duì)隨機(jī)突變的分子集合進(jìn)行選擇或篩選操作。關(guān)于后者，對(duì)相當(dāng)于所定義的結(jié)構(gòu)或功能決定子的多肽分散區(qū)進(jìn)行飽和或半隨機(jī)誘變，再將這些被誘變的盒重新引入到其他野生型等位基因構(gòu)造中。在一種實(shí)施方式中，可以使用PCR誘變。例如，可以使用大引物PCR(O.H.Landt，1990《基因》96125-128)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)免疫應(yīng)答”包括利用所要求保護(hù)的方法治療受治療者，增加T和/或B細(xì)胞應(yīng)答，即細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答。在一種實(shí)施方式中，所要求保護(hù)的方法可以用于增強(qiáng)T輔助細(xì)胞應(yīng)答。在另一種實(shí)施方式中，所要求保護(hù)的方法可以用于增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答。所要求保護(hù)的方法可以用于增強(qiáng)初次與再次免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，當(dāng)與未經(jīng)治療的受治療者或者未用所要求保護(hù)的方法治療的受治療者相比，所要求保護(hù)的方法增加受治療者的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的增加例如可以表現(xiàn)為一旦用所要求保護(hù)的方法治療后，受治療者免疫細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答增加。受治療者的免疫應(yīng)答例如可以利用各種體外或體內(nèi)免疫細(xì)胞活化作用測(cè)量加以測(cè)定，例如測(cè)定抗體產(chǎn)生、免疫細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的釋放、細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)、細(xì)胞毒性等。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“可溶性”包括不與細(xì)胞締合的分子，例如共同刺激分子。從細(xì)胞締合分子衍生的可溶性共同刺激分子保留了前者的功能，也就是說(shuō)它們能夠與T細(xì)胞上的關(guān)連配體結(jié)合，經(jīng)由T細(xì)胞上的CD28和/或CTLA4介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，不過(guò)，它們是可溶性的，也就是不與膜結(jié)合的。優(yōu)選地，可溶性組合物包含B7分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“共同刺激分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”包括共同刺激分子的一部分，它在共同刺激分子的細(xì)胞締合形式中是細(xì)胞外的。優(yōu)選地，共同刺激分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含B7分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。B7細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括共同刺激分子介導(dǎo)與CD28和/或CTLA4結(jié)合的部分。例如，人B7-1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含成熟型B7-1的約氨基酸1至約氨基酸208(SEQ ID NO1)，人B7-2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含成熟型B7-2的約氨基酸24至約氨基酸245(SEQ ID NO2)。在一種實(shí)施方式中，可溶性共同刺激分子包含B7分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步包含信號(hào)序列。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“I類(lèi)限制抗原”包括這樣的抗原，它與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類(lèi)溝結(jié)合，并且在MHC I類(lèi)分子構(gòu)造中被呈遞給T細(xì)胞。I類(lèi)限制抗原主要刺激CD8+T細(xì)胞。本文所用的術(shù)語(yǔ)“II類(lèi)限制抗原”包括這樣的抗原，它與MHC II類(lèi)溝結(jié)合，并且在MHC II類(lèi)分子構(gòu)造中被呈遞給T細(xì)胞。II類(lèi)限制抗原主要刺激CD4+T細(xì)胞。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“佐劑”包括強(qiáng)化對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的試劑。佐劑可以與共同刺激分子聯(lián)合給藥，以另外增加免疫應(yīng)答。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“單特異性”包括僅具有一種特異性的可溶性共同刺激分子，也就是說(shuō)，它們與T細(xì)胞上的關(guān)連配體結(jié)合，例如CD28或CTLA4。這樣的單特異性試劑還不包括另外的特異性，因而不以定向方式與其他細(xì)胞表面分子結(jié)合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“寡特異性”包括具有一種以上特異性的可溶性共同刺激分子，例如對(duì)除B7配體以外的分子具有另外的特異性，例如對(duì)細(xì)胞表面分子的特異性，例如腫瘤細(xì)胞抗原或T細(xì)胞受體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“二價(jià)”包括每個(gè)可溶性共同刺激分子具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，用于與其關(guān)連配體、例如CD28和/或CTLA4發(fā)生相互作用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“二聚體”包括以同型二聚體存在的可溶形式，也就是由兩個(gè)相同的亞單位組成的單位，二者例如通過(guò)二硫鍵連接在一起。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多聚的”包括具有兩個(gè)以上亞單位的可溶形式。
II、可溶性共同刺激分子B7抗原是在B淋巴細(xì)胞、專(zhuān)業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞(例如單核細(xì)胞、樹(shù)狀細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞)和向免疫細(xì)胞呈遞抗原的細(xì)胞(例如角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星形細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞)表面上發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)共同刺激分子。這些共同刺激分子與T細(xì)胞表面上的CTLA4、CD28和/或ICOS或者免疫細(xì)胞上其他已知或尚不明確的受體結(jié)合。這類(lèi)共同刺激分子的成員能夠向活化的T細(xì)胞提供共同刺激作用，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞因子分泌。
人們已經(jīng)確立了B7分子的純化技術(shù)，另外已經(jīng)從許多物種克隆了B7基因(cDNA)，包括人和小鼠(例如參見(jiàn)Freeman，G.J.等(1993)《科學(xué)》262909-911；Azuma，M.等(1993)《自然》36676-79；Freeman，G.J.等(1993)《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1782185-2192)。
共同刺激分子的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的，可以在文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫(kù)中找到，例如GenBank。例如參見(jiàn)B7-2(Freeman，G.J.等1993《科學(xué)》262909或GenBank入藏號(hào)P42081或A48754)、B7-1(Freeman等《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1991.174625或GenBank入藏號(hào)P33681或A45803)、CTLA4(例如參見(jiàn)Ginsberg等1985《科學(xué)》2281401或GenBank入藏號(hào)P16410或291929)、CD28(Aruffo和Seed《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》848573或GenBank入藏號(hào)180091)、ICOS(Hutloff等1999《自然》397263；WO 98/38216)和相關(guān)的序列。
除了共同刺激分子的天然存在形式以外，術(shù)語(yǔ)“共同刺激分子”還包括非天然存在的形式，例如共同刺激分子的變體或突變體形式，它們保留有共同刺激分子的功能，例如與關(guān)連反受體結(jié)合的能力。例如，在避免與非共同刺激分子基因雜交的條件下(例如在等價(jià)于65℃5×SSC(1×SSC＝150mM NaCl/0.15M檸檬酸鈉)的條件下)，能夠與編碼B7分子的DNA雜交的DNA序列可以用于制備抗B7抗體。作為替代選擇，在核酸分子編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的區(qū)域保留序列同一性的DNA序列可以用于生產(chǎn)可用作免疫原的共同刺激蛋白，這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)餐碳し肿拥墓δ軄?lái)說(shuō)是重要的，例如與其他共同刺激分子結(jié)合。優(yōu)選地，非天然存在的共同刺激分子與天然存在的共同刺激分子細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列具有顯著的氨基酸同一性(例如大于70％，優(yōu)選為大于80％，更優(yōu)選為大于90-95％)。
為了測(cè)定可能對(duì)共同刺激分子與其反受體結(jié)合來(lái)說(shuō)是重要的共同刺激分子的氨基酸殘基，可以對(duì)比包含不同物種、例如小鼠和人的共同刺激分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，記錄保守的(例如同一的)殘基。例如這可以利用任意的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比程序進(jìn)行，例如MegAlign(DNASTAR)。這樣的對(duì)比程序詳細(xì)描述如下。這類(lèi)保守或同一的殘基對(duì)共同刺激分子與其受體的正確結(jié)合來(lái)說(shuō)可能是必要的，因而不可能會(huì)改變。
例如，對(duì)介導(dǎo)與CD28和CTLA4的功能相互作用來(lái)說(shuō)是重要的B7-1分子區(qū)域已經(jīng)通過(guò)突變進(jìn)行了鑒別。B7-1V-樣結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)疏水性殘基、包括在從各種物種克隆的所有B7-1與B7-2分子中都是保守的Y87殘基，被發(fā)現(xiàn)是決定性的(Fargeas等1995《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》182667)。利用這些或相似的技術(shù)，可以測(cè)定決定性共同刺激分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基，它們是決定性的，因此不會(huì)改變。
使用B7 cDNA分子，具有B7活性的肽可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以生產(chǎn)。為表達(dá)肽而被轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可以是任意的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。例如，具有B7活性的肽可以在下列細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)細(xì)菌細(xì)胞、例如大腸桿菌，昆蟲(chóng)細(xì)胞(桿狀病毒)，酵母，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞、例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)和NS0細(xì)胞。其他適合的宿主細(xì)胞和表達(dá)載體可以參見(jiàn)Goeddel，(1990)，見(jiàn)上，或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。釀酒酵母內(nèi)的表達(dá)載體實(shí)例包括pYepSecl(Baldari等(1987)《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)《細(xì)胞》30933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)《基因》54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。在所培養(yǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞(SF9細(xì)胞)內(nèi)可用于蛋白質(zhì)表達(dá)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等(1983)《分子細(xì)胞生物學(xué)》32156-2165)和pVL系列(Lucklow，V.A.和Summers，M.D.，(1989)《病毒學(xué)》17031-39)。一般地，COS細(xì)胞(Gluzman，Y.，(1981)《細(xì)胞》23175-182)與諸如pCDM8等載體(Seed，B.，(1987)《自然》329840)聯(lián)合用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的短暫擴(kuò)增/表達(dá)，而CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞與諸如pMT2PC等載體(Kaufman等(1987)《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》6187-195)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定擴(kuò)增/表達(dá)。優(yōu)選用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的細(xì)胞系是NS0骨髓瘤細(xì)胞系，可從ECACC獲得(目錄#85110503)，描述在Galfre，G.和Milstein，C.中((1981)《酶學(xué)方法》73(13)3-46；和《單克隆抗體的制備策略與操作》AcademicPress，N.Y.，N.Y.)。載體DNA可以經(jīng)由常規(guī)技術(shù)引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，例如磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑或電穿孔。適合于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法可以參見(jiàn)Sambrook等(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989))和其他實(shí)驗(yàn)室教科書(shū)。當(dāng)用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)時(shí)，表達(dá)載體的控制功能經(jīng)常由病毒材料提供。例如，常用的啟動(dòng)子是從多瘤、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒衍生的，最常見(jiàn)的是猿病毒40。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或其他細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)的具有B7活性的肽可以按照本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行純化，包括硫酸銨沉淀、分級(jí)柱色譜(例如離子交換、凝膠過(guò)濾、電泳、親和色譜等)，最后包括結(jié)晶(一般參見(jiàn)“酶的純化與相關(guān)技術(shù)”《酶學(xué)方法》22233-577(1971))。
用于制備本方法所用可溶性B7分子的B7分子可以來(lái)源于任意哺乳動(dòng)物物種，優(yōu)選為人。若干來(lái)源B7分子的核苷酸序列是本領(lǐng)域已知的。人B7-1的完整DNA序列(CD80)的GenBank入藏號(hào)為L(zhǎng)25259，公布在Freeman等《科學(xué)》1993，2629090或Azuma等《自然》1993，36676中(另見(jiàn)WO 96/40915關(guān)于B7-1和B7-2的序列)。人B7-1和人B7-2的核苷酸序列還如SEQ ID Nos 1與2(B7-1)和SEQ ID Nos 3與4(B7-2)所示。作為替代選擇，這樣一種序列可以這樣測(cè)定，基于序列與已知的、例如人B7序列雜交的能力，從所需來(lái)源分離B7核酸分子。例如，可以檢測(cè)B7分子在高或低嚴(yán)格條件下與已知編碼具有B7活性的肽的核酸分子雜交的能力。適當(dāng)?shù)拇龠M(jìn)DNA雜交的嚴(yán)格條件例如在約45℃下的6.0×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然后在50℃下用2.0×SSC洗滌，這些條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或者可以參見(jiàn)《分子生物學(xué)流行方案》JohnWiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從約2.0×SSC 50℃的低嚴(yán)格條件到0.2×SSC 50℃的高嚴(yán)格條件中加以選擇。另外，洗滌步驟中的溫度可以從室溫約22℃的低嚴(yán)格條件增加到約65℃的高嚴(yán)格條件。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，B7分子是人B7分子。
在一種實(shí)施方式中，可溶性共同刺激分子是從天然存在的B7-1或B7-2分子衍生的。具有如本文所述B7分子活性、并且因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而具有不同于天然存在B7分子的序列的多肽也可以以可溶形式被表達(dá)，也屬于本發(fā)明的范圍。這樣的核酸編碼功能上等價(jià)于B7的多肽(例如具有B7活性的多肽)，但是在序列上不同于本領(lǐng)域已知的B7-1或B7-2。例如，大量氨基酸由一個(gè)以上三聯(lián)體命名。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，可能存在指定相同氨基酸的密碼子或同義密碼子(例如CAU和CAC是組氨酸的同義密碼子)。作為一個(gè)實(shí)例，B7分子核苷酸序列內(nèi)(尤其在密碼子的第三個(gè)堿基內(nèi))的DNA序列多態(tài)性可能導(dǎo)致DNA中的“沉默”突變，這并不影響所編碼的氨基酸。不過(guò)，預(yù)期在某一種群內(nèi)將存在確實(shí)引起B(yǎng)7抗原氨基酸序列改變的DNA序列多態(tài)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，由于天然的等位基因變異，在某一種群個(gè)體中可能存在編碼具有新穎B淋巴細(xì)胞抗原活性的肽的核酸的一種或多種核苷酸中的這些變異(高達(dá)核苷酸的約3-4％)。這樣的核苷酸變異和所致氨基酸多態(tài)性也屬于本發(fā)明的范圍。此外，還可能存在一種或多種同種型或有關(guān)的交叉反應(yīng)性B7分子。
除了天然存在的等位基因變體以外，本發(fā)明范圍內(nèi)的B7分子可以利用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)進(jìn)行制備。在另一種實(shí)施方式中，可溶性共同刺激分子是B7-1或B7-2的修飾形式，它保留了B7共同刺激分子的功能，也就是在功能上是完全相同的。B淋巴細(xì)胞抗原的DNA序列經(jīng)過(guò)遺傳技術(shù)修飾，可以產(chǎn)生氨基酸序列改變了的蛋白質(zhì)或多肽。這樣的序列視為屬于本發(fā)明的范圍，其中被表達(dá)的多肽能夠與CTLA4和/或CD28結(jié)合，并且調(diào)制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和免疫功能。
例如，在一種實(shí)施方式中，按照大量方法的任意一種可以向DNA分子中引入突變，包括用于產(chǎn)生簡(jiǎn)單的刪去或插入、有系統(tǒng)的刪去、堿基簇的插入或取代或者單一堿基的取代，生成B淋巴細(xì)胞抗原DNA的變體或修飾后的等價(jià)物。例如，B7-1或B7-2 cDNA序列的改變、例如氨基酸的取代或刪去優(yōu)選地是通過(guò)定向誘變而獲得的。定向誘變系統(tǒng)是本領(lǐng)域熟知的。方案和試劑在商業(yè)上可以從Amersham International PLC，Amersham，U.K.獲得。
具有B7分子活性、也就是具有與B7分子的天然配體結(jié)合并且調(diào)制T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力的修飾后的多肽視為屬于本發(fā)明的范圍，這種能力例如由已經(jīng)接收初級(jí)活化信號(hào)的T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或T細(xì)胞增殖作用所證實(shí)。
具有B7分子活性的肽的另一種修飾實(shí)例是半胱氨酸殘基優(yōu)選地被丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或谷氨酸殘基取代，以減少經(jīng)由二硫鍵的二聚作用。另外，具有B7活性的肽的氨基酸側(cè)鏈可以用化學(xué)方法修飾。另一種修飾是肽的環(huán)化。
為了增強(qiáng)穩(wěn)定性和/或反應(yīng)性，具有B7活性的多肽經(jīng)過(guò)修飾，可以在抗原氨基酸序列中摻入一種或多種多態(tài)性，這是由任意天然的等位基因變異所引起的。另外，D-氨基酸、非天然氨基酸或非氨基酸類(lèi)似物經(jīng)過(guò)取代或加成，可以產(chǎn)生屬于本發(fā)明范圍的修飾后的蛋白質(zhì)。此外，按照A.Sehon及合作者的方法(Wie等，同上)，肽可以用聚乙二醇(PEG)修飾，產(chǎn)生與PEG共軛結(jié)合的肽。另外，可以在肽的化學(xué)合成期間加入PEG。肽的其他修飾包括還原/烷基化(Tarr《蛋白質(zhì)微特性化方法》J.E.Silver ed.，Humana Press，Clifton NJ 155-194(1986))；?；?Tarr，同上)；與適當(dāng)載體的化學(xué)偶聯(lián)(Mishell和Shiigi，eds《細(xì)胞免疫學(xué)精選方法》WH Freeman，San Francisco，CA(1980)，美國(guó)專(zhuān)利4,939,239)或稀福爾馬林處理(Marsh(1971)《國(guó)際變態(tài)反應(yīng)與應(yīng)用免疫學(xué)文獻(xiàn)》41199-215)。
優(yōu)選的B7多肽具有B7活性，并且與天然存在的B7氨基酸序列具有至少約60％的同一性，優(yōu)選為至少約70％的同一性，更優(yōu)選為至少約80％的同一性。具有B7活性、并且與天然存在的B7分子具有至少約90％同一性、優(yōu)選為至少約95％、更優(yōu)選為至少約98-99％同一性的多肽也屬于本發(fā)明的范圍。術(shù)語(yǔ)在給定位置上的氨基酸“同一性”指的是當(dāng)對(duì)比兩種肽的氨基酸序列時(shí)，在對(duì)應(yīng)位置上具有相同的氨基酸。若所比較的序列中某一位置被相同的氨基酸占據(jù)，則分子在該位置上是同一的。序列之間同一性的程度(或百分率)是由這些序列共享的匹配或同一位置數(shù)量的函數(shù)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠輕易對(duì)比兩種氨基酸序列，以提供生物學(xué)有義對(duì)比。序列的比較和兩種序列之間同一性百分率的測(cè)定還可以利用數(shù)學(xué)算法來(lái)完成。在一種實(shí)施方式中，兩種氨基酸序列之間的同一性百分率是利用Needleman和Wunsch(《分子生物學(xué)雜志》(48)444-453(1970))算法測(cè)定的，該算法已經(jīng)結(jié)合在GCG軟件包(可從http//www.gcg.com獲得)中的GAP程序內(nèi)，采用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，間距權(quán)重為16、14、12、10、8、6、5或4，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另外一種實(shí)施方式中，兩種核苷酸序列之間的同一性百分率是利用GCG軟件包(可從http//www.gcg.com獲得)中的GAP程序測(cè)定的，采用NWSgapdna.CMP矩陣，間距權(quán)重為40、50、60、70或80，長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另一種實(shí)施方式中，兩種氨基酸或核苷酸序列之間的同一性百分率是利用E.Meyers和W.Miller算法(CABIOS，411-17(1989))測(cè)定的，該算法已經(jīng)結(jié)合在ALIGN程序(2.0版)內(nèi)，采用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長(zhǎng)度補(bǔ)償為12，缺口補(bǔ)償為4。
本發(fā)明的核酸與蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步用作“查詢序列”，以在公用數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)例如對(duì)其他家族成員或有關(guān)序列進(jìn)行檢索。這樣的檢索可以利用Altschul等(1990)《分子生物學(xué)雜志》215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行。BLAST核苷酸檢索可以利用NBLAST程序、得分＝100、字長(zhǎng)＝12進(jìn)行，以得到與本發(fā)明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可以利用XBLAST程序、得分＝50、字長(zhǎng)＝3進(jìn)行，以得到與本發(fā)明B7蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了得到帶有缺口的對(duì)比以利比較，可以采用Gapped BLAST，如Altschul等(1997)《核酸研究》25(17)3389-3402所述。當(dāng)采用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，可以使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。見(jiàn)http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
“B7分子的至少一部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”被定義為這樣一種氨基酸序列，它包含B7的完整細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列或其一部分，該序列編碼具有活性(也就是與免疫細(xì)胞上的天然B7配體結(jié)合的能力，例如與T細(xì)胞上的CTLA4和/或CD28結(jié)合)的多肽。具有B7活性的肽結(jié)合CTLA4和/或CD28，調(diào)制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這例如得到與這些配體結(jié)合或者誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或已經(jīng)接收初級(jí)活化信號(hào)的T細(xì)胞增殖作用的證實(shí)，如附后實(shí)施例所示。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，“B7分子的至少一部分細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域”包括這樣一種多肽，它包含人B7抗原的完整細(xì)胞外部分(例如B7-1序列的大約第1-208個(gè)氨基酸殘基或B7-2序列的大約第24-245個(gè)氨基酸殘基)，這部分可用于結(jié)合CTLA4和/或CD28。
除了僅包含天然存在的氨基酸的B7多肽以外，還提供了B7肽模擬物。肽類(lèi)似物在藥物工業(yè)中常用作非肽藥物，具有類(lèi)似于模板肽的性質(zhì)。這些類(lèi)型的非肽化合物稱(chēng)為“肽的模擬物”或“肽模擬物”(Fauchere，J.(1986)《藥物研究進(jìn)展》1529；Veber和Freidinger(1985)《TINS》p.392；Evans等(1987)《醫(yī)藥化學(xué)雜志》301229，引用在此作為參考文獻(xiàn))，在開(kāi)發(fā)中通常借助計(jì)算機(jī)分子建模。
在結(jié)構(gòu)上與具有治療價(jià)值的肽相似的肽的模擬物可以用于產(chǎn)生等價(jià)的治療或預(yù)防作用。一般地，肽模擬物在結(jié)構(gòu)上與多肽范例(也就是具有生物或藥理活性的多肽)、例如B7相似，但是其中一條或多條肽鍵可選地被選自下組的鍵代替-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式與反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-，方法是本領(lǐng)域已知的，進(jìn)一步描述在下列參考文獻(xiàn)中Spatola，A.F.《氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)與生物化學(xué)》B.Weinstein，eds.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983)；Spatola，A.F.《Vega Data》(1983.3.)，1卷，3期，“肽主鏈修飾”(綜述)；Morley，J.S.《藥物科學(xué)趨勢(shì)》(1980)pp.463-468(綜述)；Hudson，D.等《國(guó)際肽與蛋白質(zhì)研究雜志》(1979)14177-185(-CH2NH-，CH2CH2-)；Spatola，A.F.等《生命科學(xué)》(1986)381243-1249(-CH2-S)；Hann，M.M.《英國(guó)化學(xué)會(huì)志柏爾金匯刊I》(1982)307-314(-CH-CH-，順式與反式)；Almquist，R.G.等《醫(yī)藥化學(xué)雜志》(1980)231392-1398(-COCH2-)；Jennings-White，C.等《四面體快報(bào)》(1982)232533(-COCH2-)；Szelke，M.等，歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP 45665(1982)CA9739405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay，M.W.等《四面體快報(bào)》(1983)244401-4404(-C(OH)CH2-)；Hruby，V.J.《生命科學(xué)》(1982)31189-199(-CH2-S-)，它們分別引用在此作為參考文獻(xiàn)。特別優(yōu)選的非肽鍵是-CH2NH-。
這類(lèi)肽的模擬物可以具有顯著優(yōu)于多肽實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)，例如包括生產(chǎn)更經(jīng)濟(jì)、化學(xué)穩(wěn)定性更高、藥理性質(zhì)增強(qiáng)(半衰期、吸收、效力、功效等)、特異性改變(例如廣譜生物活性)、抗原性降低以及其他等等。肽模擬物的標(biāo)記通常涉及一種或多種標(biāo)記物直接或者通過(guò)間隔基團(tuán)(例如酰胺基)與肽模擬物上的非干擾性位置共價(jià)結(jié)合，這些位置是通過(guò)定量結(jié)構(gòu)-活性數(shù)據(jù)和/或分子建模來(lái)預(yù)測(cè)的。這樣的非干擾性位置一般是這樣的位置，它們不與大分子形成直接接觸，而肽模擬物與這些大分子結(jié)合產(chǎn)生治療效果。肽模擬物的衍生(例如標(biāo)記)應(yīng)當(dāng)基本上不干擾肽模擬物的所需生物或藥理活性。
B7氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被相同類(lèi)型的D-氨基酸有系統(tǒng)地取代(例如D-賴(lài)氨酸代替L-賴(lài)氨酸)，可以用于生成更穩(wěn)定的分子。另外，按照本領(lǐng)域已知的方法可以生成包含B7氨基酸序列或基本上同一的序列變異的約束肽(Rizo和Gierasch(1992)《生物化學(xué)年評(píng)》61387，引用在此作為參考文獻(xiàn))；例如，加入內(nèi)在的半胱氨酸殘基，這些殘基能夠形成分子內(nèi)二硫橋，使肽環(huán)化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)度的實(shí)驗(yàn)方法即可生產(chǎn)相當(dāng)于B7肽序列及其序列變體的多肽。這類(lèi)多肽可以這樣生產(chǎn)，在原核動(dòng)物或真核動(dòng)物宿主細(xì)胞中，表達(dá)編碼B7肽序列的多核苷酸，經(jīng)常作為更大多肽的一部分。作為替代選擇，這樣的肽可以用化學(xué)方法合成。異種多肽在重組宿主中的表達(dá)、多肽的化學(xué)合成和體外轉(zhuǎn)譯的方法是本領(lǐng)域熟知的，進(jìn)一步描述在Maniatis等《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(1989)第2版，Cold SpringHarbor，N.Y.；Berger和Kimmel《酶學(xué)方法》152卷“分子克隆技術(shù)指南”(1987)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Merrifield，J.(1969)《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》91501；Chaiken I.M.(1981)《CRC Crit.Rev.Biochem.》11255；Kaiser等(1989)《科學(xué)》243187；Merrifield，B.(1986)《科學(xué)》232342；Kent，S.B.H.(1988)《生物化學(xué)年評(píng)》57957；Offord，R.E.(1980)《半合成蛋白質(zhì)》Wiley Publishing，引用在此作為參考文獻(xiàn)。
肽例如可以通過(guò)直接的化學(xué)合成加以生產(chǎn)。肽可以被制成修飾的肽，其中非肽部分通過(guò)共價(jià)鍵與N-端和/或C-端結(jié)合。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，羧基末端或氨基末端或二者都是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的。末端氨基與羧基的最普通的修飾分別是乙?；王０坊０被┒诵揎椑珲；?例如乙?；?或烷基化(例如甲基化)，羧基末端修飾例如酰胺化，以及其他末端修飾，包括環(huán)化，這些都可以體現(xiàn)在本發(fā)明的各種實(shí)施方式中。某些氨基末端和/或羧基末端修飾和/或肽延長(zhǎng)為核心序列，能夠提供有利的物理、化學(xué)、生物化學(xué)和藥理性質(zhì)，例如穩(wěn)定性增強(qiáng)、效力和/或功效增加、耐受血清蛋白酶、可取的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)以及其他等等。
本發(fā)明還提供B7嵌合或融合多肽。本文所用的B7“嵌合多肽”或“融合多肽”包含用手術(shù)方法與非B7多肽連接的B7多肽?！癇7多肽”指的是具有相當(dāng)于B7多肽的氨基酸序列的多肽，而“非B7多肽”指的是具有相當(dāng)于這樣一種多肽的氨基酸序列的多肽，前者多肽與B7多肽基本上不是同源的，例如不同于B7多肽并且來(lái)源于相同或不同生物體的多肽。在B7融合多肽內(nèi)，B7多肽可以相當(dāng)于B7多肽的全部或一部分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，B7融合多肽包含B7多肽的至少一個(gè)生物活性部分。在融合多肽內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“用手術(shù)方法連接”意在表明B7多肽與非B7多肽彼此是框架內(nèi)融合的。非B7多肽可以與B7多肽的N-端或C-端融合。
優(yōu)選的核酸片段編碼長(zhǎng)度為至少約40個(gè)氨基酸殘基的B7多肽，優(yōu)選地長(zhǎng)度為至少約80個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選地長(zhǎng)度為至少約120個(gè)氨基酸殘基。特別優(yōu)選的片段在長(zhǎng)度上為至少約200個(gè)氨基酸，例如包含B7分子的完整細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。大量方法可以用于生成分離DNA序列的片段。編碼B7-1或B7-2蛋白質(zhì)、例如1-30個(gè)堿基長(zhǎng)度的核酸亞區(qū)或片段可以按照標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)化學(xué)合成手段加以制備。該技術(shù)也可用于制備引物，引物用于生成更大的合成B7 DNA片段。
編碼B淋巴細(xì)胞抗原的基因的更大亞區(qū)或片段可以這樣被表達(dá)為肽，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)合成有關(guān)的DNA碎片(Sambrook，F(xiàn)ritsch和Maniatis《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第2版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989))，將所得DNA連接在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體內(nèi)。利用PCR，生成了所克隆的雙鏈DNA的特定序列，克隆在表達(dá)載體內(nèi)，然后測(cè)定CTLA4/CD28結(jié)合活性。例如，為了利用PCR表達(dá)人B7-1或B7-2蛋白的分泌(可溶)形式，可以合成不編碼蛋白質(zhì)的跨膜與胞質(zhì)區(qū)的DNA。這種DNA分子可以連接在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體內(nèi)，引入到宿主細(xì)胞中，例如CHO，在那里合成和分泌B7蛋白片段。然后能夠輕易地從培養(yǎng)基中獲得B7蛋白片段。
在一種實(shí)施方式中，編碼B7分子的至少一部分、例如缺乏分子跨膜部分的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域部分的核酸分子被置于表達(dá)載體中，被宿主細(xì)胞表達(dá)，以便B7分子不在細(xì)胞表面上被表達(dá)。例如，編碼B7分子細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA在合成時(shí)可以使用從公開(kāi)的B7-1或B7-2序列(參見(jiàn)Freeman等《免疫學(xué)雜志》1989.1432714或《科學(xué)》1993.2629090)衍生的引物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(美國(guó)專(zhuān)利4,683,202)。所得cDNA序列然后可以裝配成真核生物或原核生物表達(dá)載體，該載體可以用于定向適當(dāng)宿主細(xì)胞、例如COS或CHO細(xì)胞合成B7的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
在另一種實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括編碼具有B7抗原活性的肽的DNA和編碼第二種多肽的DNA。第二種多肽優(yōu)選地不是從共同刺激分子衍生的。優(yōu)選地，本發(fā)明的B7嵌合或融合蛋白是用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的。例如，將編碼不同多肽序列的DNA片段按照常規(guī)技術(shù)框架內(nèi)連接在一起，利用采用鈍端或交錯(cuò)端進(jìn)行連接，限制酶消化以提供適當(dāng)?shù)哪┒?，酌情填入粘端，堿性磷酸酶處理以避免不可取的連接，和酶的連接。在另一種實(shí)施方式中，融合基因可以用常規(guī)技術(shù)合成，包括自動(dòng)DNA合成儀。作為替代選擇，基因片段的PCR擴(kuò)增可以利用錨定引物進(jìn)行，該引物引起兩個(gè)連續(xù)基因片段之間的互補(bǔ)突出端，隨后可以進(jìn)行退火和重新擴(kuò)增，產(chǎn)生嵌合的基因序列(例如參見(jiàn)《分子生物學(xué)最新方案》eds.Ausubel等John Wiley & Sons1992)。而且，很多表達(dá)載體都是商業(yè)上可得到的，并且已經(jīng)編碼融合部分(例如GST多肽)。編碼B7的核酸分子可以被克隆在這樣的表達(dá)載體中，以便該融合部分與B7蛋白質(zhì)進(jìn)行框架內(nèi)連接。例如，可以向肽中加入六-組氨酸，用于固定化金屬離子親和色譜純化(Hochuli，E.等(1988)《生物工程學(xué)》61321-1325)。另外，為了促進(jìn)不含無(wú)關(guān)序列的B淋巴細(xì)胞抗原的分離，可以在融合部分與肽的序列之間引入特異性內(nèi)蛋白酶裂解位點(diǎn)。增加肽的溶解度可能是必要的，例如向肽中加入官能團(tuán)，或者刪去肽的疏水區(qū)。
在一種實(shí)施方式中，將編碼B7分子或其部分的DNA與編碼免疫應(yīng)答所需抗原的DNA進(jìn)行框架內(nèi)連接，該抗原例如病毒抗原或腫瘤細(xì)胞抗原。
在一種實(shí)施方式中，將編碼相當(dāng)于B7抗原細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的DNA與編碼相當(dāng)于免疫球蛋白分子恒定區(qū)的氨基酸序列的DNA連接(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,580,756或WO 97/28267)。第二種肽可以包括免疫球蛋白恒定區(qū)，例如人Cγ1結(jié)構(gòu)域或Cγ4結(jié)構(gòu)域或Cμ或其部分(例如人IgCγ1或人IgCγ4的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)，例如參見(jiàn)Capon等US 5,116,964，引用在此作為參考文獻(xiàn))。所得B7Ig融合蛋白可以具有改變了的溶解度、結(jié)合親合性、穩(wěn)定性和/或化合價(jià)(也就是每個(gè)分子可利用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù))，并且可以增加蛋白質(zhì)純化的效率。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫球蛋白恒定區(qū)中的半胱氨酸殘基是保守的，有助于二硫化物的鍵合和可溶性二聚B7Ig蛋白的生成。在一種實(shí)施方式中，B7分子的一部分與IgM抗體或其部分的恒定區(qū)融合，有助于可溶性多聚形式的B7Ig蛋白的生成。
特別優(yōu)選的B7Ig融合蛋白包括與免疫球蛋白恒定區(qū)偶聯(lián)的人B7-1或B7-2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域部分或可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)域。用在可溶性B7分子中的免疫球蛋白恒定區(qū)可以含有遺傳修飾，這些修飾減少或消除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)固有的效應(yīng)器活性(例如參見(jiàn)WO 97/28267)。例如，編碼B7-1或B7-2的細(xì)胞外部分的DNA以及編碼B7-1或B7-2的可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)域或者B7-1或B7-2的恒定區(qū)樣結(jié)構(gòu)域的DNA可以與編碼經(jīng)過(guò)位點(diǎn)定向誘變修飾的人IgCγ1和/或IgCγ4的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的DNA連接。
如果使用非人免疫球蛋白恒定區(qū)，優(yōu)選地該恒定區(qū)被人源化。用于制備嵌合或人源化抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(例如參見(jiàn)Morrison等《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》816851(1985)；Takeda等《自然》314452(1985)；Cabilly等美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567；Boss等美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,397；Tanaguchi等歐洲專(zhuān)利公報(bào)EP 171496；歐洲專(zhuān)利公報(bào)0173494；英國(guó)專(zhuān)利GB 2177096B；Teng等《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》807308-7312(1983)；Kozbor等《今日免疫學(xué)》47279(1983)；Olsson等《酶學(xué)方法》923-16(1982)；PCT公報(bào)WO 92/06193和EP 0239400)。
用于裝配和表達(dá)編碼相當(dāng)于B7抗原和可溶性B7Ig分子的氨基酸序列的DNA的技術(shù)例如寡核苷酸的合成、PCR、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、構(gòu)建載體、表達(dá)系統(tǒng)等，都已得到本領(lǐng)域的充分確認(rèn)。
由重組技術(shù)生產(chǎn)的B7融合蛋白和多肽可以從含有蛋白質(zhì)或肽的細(xì)胞與培養(yǎng)基的混合物中分泌和分離。作為替代選擇，蛋白質(zhì)或肽可以保留在細(xì)胞質(zhì)中，收獲細(xì)胞，溶解，分離蛋白質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)物通常包括宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和其他成分。適合于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的。蛋白質(zhì)和多肽可以從細(xì)胞培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞中分離，或者利用本領(lǐng)域已知的用于純化蛋白質(zhì)和多肽的技術(shù)。用于轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞和純化蛋白質(zhì)與肽的技術(shù)在本文中有進(jìn)一步詳細(xì)描述。
III、結(jié)構(gòu)相關(guān)的可溶性共同刺激分子的活性篩選利用一種或多種若干不同的測(cè)定法可以完成結(jié)構(gòu)相關(guān)的B7分子篩選，如本文所述它們保留特有的B淋巴細(xì)胞抗原活性。例如，肽的篩選可以看出它們保持對(duì)與天然存在的B7分子結(jié)合的抗-B7單克隆抗體的特異反應(yīng)性。具體來(lái)說(shuō)，將適當(dāng)?shù)募?xì)胞、例如COS細(xì)胞可以用編碼供試多肽的DNA轉(zhuǎn)染。在免疫沉淀測(cè)定法中，可以利用抗-B7單克隆抗體或CTLA4Ig或CD28融合蛋白評(píng)價(jià)分泌形式B7的產(chǎn)生。通過(guò)移動(dòng)，還可以試驗(yàn)表達(dá)有關(guān)肽的細(xì)胞與CTLA4或CD28在平板上結(jié)合的能力。作為替代選擇，還可以試驗(yàn)供試肽與天然存在的B7分子競(jìng)爭(zhēng)與CD28或CTLA4結(jié)合的能力。
其他更優(yōu)選的測(cè)定法試驗(yàn)B7抗原的功能特征。已如前述，T細(xì)胞合成細(xì)胞因子的能力不僅取決于T細(xì)胞受體對(duì)抗原的占據(jù)或交聯(lián)(例如由抗-CD3或佛波酯提供的“初級(jí)活化信號(hào)”，產(chǎn)生“活化的T細(xì)胞”)，而且取決于共同刺激信號(hào)的誘導(dǎo)，在這種情況下是由與B淋巴細(xì)胞抗原的相互作用誘導(dǎo)的，例如B7-1或B7-2與T細(xì)胞上的CD28和/或CTLA4分子的相互作用。B7分子與T細(xì)胞上的已經(jīng)經(jīng)由T細(xì)胞受體接收信號(hào)的其天然配體的結(jié)合具有傳遞信號(hào)給T細(xì)胞的作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子、特別是白介素-2的水平增加，后者進(jìn)而刺激T淋巴細(xì)胞的增殖。其他關(guān)于B7功能的測(cè)定法因而涉及測(cè)定細(xì)胞因子的合成，例如白介素-2、白介素-4或其他細(xì)胞因子，和/或測(cè)定已經(jīng)接收初級(jí)活化信號(hào)的CD28+T細(xì)胞的T細(xì)胞增殖作用。
體外可以這樣向T細(xì)胞提供第一或初級(jí)活化信號(hào)，使它們與抗-T3單克隆抗體(例如抗-CD3)或佛波酯接觸，或者更優(yōu)選地，由與I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子有關(guān)的抗原提供。已經(jīng)接收初級(jí)活化信號(hào)的T細(xì)胞在本文中稱(chēng)為活化的T細(xì)胞。B7功能是這樣測(cè)定的，向T細(xì)胞培養(yǎng)物中加入B7源(例如表達(dá)具有B7活性的肽或B7的分泌形式的細(xì)胞)和初級(jí)活化信號(hào)(例如與I類(lèi)或II類(lèi)MHC有關(guān)的抗原)，測(cè)定功能結(jié)果，例如測(cè)定培養(yǎng)物上清液中的白介素-2、γ-干擾素或其他已知或未知的細(xì)胞因子。例如，可以采用若干常規(guī)的白介素-2測(cè)定法的任意一種，例如《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》861333(1989)所述測(cè)定法，有關(guān)部分引用在此作為參考文獻(xiàn)。用于干擾素產(chǎn)生測(cè)定的試劑盒可從Genzyme Corporation(Cambridge，MA)獲得。還可以如下實(shí)施例所述測(cè)量T細(xì)胞增殖。與缺乏共同刺激信號(hào)的陰性對(duì)照相比，如本文所述保留B7抗原特征的肽可以導(dǎo)致每個(gè)T細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子增加，例如IL-2，還可以導(dǎo)致T細(xì)胞增殖作用增強(qiáng)。
IV、可溶性共同刺激分子的給藥方法本文所述的組合物和/或藥物對(duì)需要促進(jìn)免疫應(yīng)答的受治療者給藥。在一種實(shí)施方式中，可溶性B7分子是與抗原預(yù)防性給藥的，例如在被病原體感染之前或者對(duì)未患癌癥的受治療者給藥。在另一種實(shí)施方式中，可溶性B7分子是治療性給藥的，例如對(duì)將從增強(qiáng)共同刺激獲益的患病受治療者給藥，例如患有癌癥或被病原體感染的受治療者。
在一種實(shí)施方式中，共同刺激分子是與抗原制劑共同給藥的?？乖梢允堑鞍踪|(zhì)、多糖、脂多糖、脂肽，或者它可以是任意這些的組合。例如，抗原可以包括天然蛋白或蛋白片段、合成蛋白或蛋白片段、或肽；它可以包括糖蛋白、糖肽、脂蛋白、脂肽、核蛋白、核肽；它可以包括肽-肽綴合物；或者它可以包括重組的核酸表達(dá)產(chǎn)物。
在一種實(shí)施方式中，抗原制劑包含抗原的混合物，例如抗原是以輻射處理細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞)、病毒顆?；虼謩驖{的形式給藥的。在另一種實(shí)施方式中，將抗原肽或抗原肽的重組形式的純化制劑對(duì)受治療者給藥，例如病毒肽或腫瘤相關(guān)抗原。在一種實(shí)施方式中，抗原制劑包含I類(lèi)MHC限制肽。在另一種實(shí)施方式中，抗原制劑包含II類(lèi)MHC限制肽。在另一種實(shí)施方式中，抗原制劑包含I類(lèi)限制肽與II類(lèi)限制肽的組合，用于對(duì)受治療者給藥。
在一種實(shí)施方式中，抗原是通過(guò)“遺傳免疫”給藥的。在這種實(shí)施方式中，將編碼有關(guān)肽的DNA表達(dá)載體注入宿主動(dòng)物，例如注入受治療者的皮膚或肌肉。基因產(chǎn)物被正確地合成和糖基化，折疊，被受治療者表達(dá)。利用這種方法，可以將難以足量獲得或純化的抗原給藥。在一種實(shí)施方式中，通過(guò)粒子轟擊裝置“基因槍”將DNA注入肌肉或者釋放到皮膚中，DNA是涂在金微粒上的。已經(jīng)顯示遺傳免疫誘導(dǎo)特異性體液應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答(例如參見(jiàn)Mor等1995《免疫學(xué)雜志》1552039；Xu和Liew.1995《免疫學(xué)》84173；Davis等1994《疫苗》121503)。
可溶性B7分子的最優(yōu)給藥過(guò)程可以因所治療的受治療者而異。例如，可溶性B7分子可以與抗原給藥和/或可以在抗原給藥之前單獨(dú)給藥，或者可以在抗原給藥之后若干天單獨(dú)給藥。在一種實(shí)施方式中，可溶性B7分子可以“遺傳”給藥，也就是將編碼可溶性B7分子或其部分的核酸分子給藥。在另外一種實(shí)施方式中，可溶性B7分子與抗原是以綴合物的形式給藥的。
可溶性B7分子的給藥劑量方案經(jīng)過(guò)調(diào)整，可以為每名受治療者提供最佳治療反應(yīng)，無(wú)需進(jìn)行過(guò)度的實(shí)驗(yàn)。例如，可以測(cè)量對(duì)抗原的抗體效價(jià)或?qū)乖募?xì)胞免疫應(yīng)答(例如DTH應(yīng)答(Puccetti等1994《歐洲免疫學(xué)雜志》241446))，以確定受治療者是否對(duì)抗原正在形成免疫應(yīng)答或者正在表現(xiàn)增強(qiáng)了的免疫應(yīng)答，相應(yīng)地可以調(diào)整劑量方案。
活性藥物或組合物還可以通過(guò)腸胃外或腹膜內(nèi)方式給藥。藥物例如可以通過(guò)鼻內(nèi)、口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或黏膜方式給藥。還可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物和油中制備分散系。在普通的貯存和使用條件下，這些制劑可以含有防腐劑，以防止微生物的生長(zhǎng)。
適合注射的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液(若是水溶性的)或分散系，和用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散系的無(wú)菌粉末。本發(fā)明的藥物組合物經(jīng)過(guò)配制，可以適合于特定的給藥途徑。例如，在各種實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物可以適合于注射、吸入或吹入(通過(guò)口或鼻)，或者適合于鼻內(nèi)、黏膜、口服、頰、腸胃外、直腸、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和皮下釋放。
藥物或組合物將是無(wú)菌的。另外，它們應(yīng)當(dāng)在制備和貯存條件下是穩(wěn)定的，應(yīng)當(dāng)防止微生物、例如細(xì)菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適合的混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以這樣保持，例如利用包衣、例如卵磷脂，在分散系的情況下保持所需的粒徑，和利用表面活性劑。各種抗細(xì)菌和抗真菌劑可以防止微生物的作用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫汞撒等。在很多情況下，優(yōu)選的是在組合物中包括等滲劑，例如糖，多元醇、例如甘露糖醇、山梨糖醇，氯化鈉。在組合物中包括延遲吸收的試劑可以延長(zhǎng)可注射組合物的吸收，例如一硬脂酸鋁和明膠。
無(wú)菌注射溶液可以這樣制備，向適當(dāng)?shù)娜軇┲屑尤胨枇康幕钚越M合物或藥物，以及根據(jù)需要的一種如上列舉的成分或其組合，然后無(wú)菌過(guò)濾。一般地，分散系是這樣制備的，向含有基本分散介質(zhì)和如上列舉的所需其他成分的無(wú)菌載體中加入活性化合物(例如共同刺激分子和/或抗原和任意另外的藥物)。在用于無(wú)菌注射溶液制備的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，從其預(yù)先無(wú)菌過(guò)濾的溶液中得到活性成分(例如藥物或組合物)加任意另外的所需成分的粉末。藥物或組合物在給藥時(shí)可以是適用于無(wú)針注射藥具的形式(這樣的藥具是本領(lǐng)域已知的，例如參見(jiàn)5,383,851、5,581,198、5,846,233)，例如《分子醫(yī)學(xué)》1998.4109所述。
當(dāng)活性藥物或組合物被適當(dāng)保護(hù)時(shí)，如上所述，蛋白質(zhì)例如可以與惰性稀釋劑或可同化的食用載體一起口服給藥。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任意所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌與抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這類(lèi)介質(zhì)和試劑關(guān)于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域熟知的。除了與活性化合物不相容的那些常規(guī)介質(zhì)或試劑以外，其在治療組合物中的用途是被期待的。也可以向組合物中加入補(bǔ)充的活性化合物。
尤其有利的是配制腸胃外組合物的劑量單元形式，有利于給藥和劑量的均勻。本文所用的劑量單元形式指的是物理上不連續(xù)的單元，適合作為哺乳動(dòng)物受治療者的單元?jiǎng)┝?；每個(gè)單元含有預(yù)定量的活性化合物以及所需的藥物載體，該預(yù)定量經(jīng)過(guò)計(jì)算，產(chǎn)生所需的治療效果。本發(fā)明劑量單元形式的規(guī)范聽(tīng)命于和直接取決于(a)活性化合物的獨(dú)特特征和所要達(dá)到的治療效果，和(b)復(fù)合這樣一種活性藥物或組合物用于個(gè)體治療領(lǐng)域所固有的限制。
本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”例如包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌與抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這類(lèi)介質(zhì)和試劑關(guān)于藥學(xué)活性物質(zhì)的用途是本領(lǐng)域熟知的。也可以加入補(bǔ)充的試劑。
本發(fā)明的藥物以適合于體內(nèi)藥物給藥的生物學(xué)上可相容的形式對(duì)受治療者給藥，以增強(qiáng)免疫應(yīng)答?！斑m合于體內(nèi)給藥的生物學(xué)上可相容的形式”表示所要給藥的蛋白質(zhì)形式，其中藥物的治療效果重于任何毒性作用。術(shù)語(yǔ)受治療者打算包括其中能夠引起免疫應(yīng)答的活生物體，例如哺乳動(dòng)物。受治療者的實(shí)例包括人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉(zhuǎn)基因物種。如本文所述具有B7分子活性的肽的給藥可以是任意藥理學(xué)形式，其中包括治療有效量的單獨(dú)的可溶性B7肽、可溶性B7肽與抗原的組合和可溶性B7肽與藥學(xué)上可接受的載體的組合。
治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明組合物的給藥被定義為在達(dá)到所需結(jié)果所必要的劑量和時(shí)間階段下有效的量。優(yōu)選地，可溶性B7分子的給藥(含有或不含抗原)導(dǎo)致對(duì)抗原(例如病毒或腫瘤細(xì)胞抗原)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)。
受治療者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答(例如細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答)可以利用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)加以測(cè)量。對(duì)抗原的免疫應(yīng)答測(cè)量可以在體內(nèi)或體外進(jìn)行。例如，通過(guò)進(jìn)行活組織檢查并尋找細(xì)胞浸潤(rùn)，可以測(cè)量免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性。在感染部位或腫瘤部位附近或者在引流淋巴結(jié)中可以進(jìn)行原位細(xì)胞因子染色?？梢赃M(jìn)行細(xì)胞的體外培養(yǎng)，以試驗(yàn)細(xì)胞對(duì)抗原的反應(yīng)性(例如在抗原存在下的增殖和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生，和/或?qū)乖募?xì)胞毒活性)。例如，具有B7活性的多肽的治療或預(yù)防有效量可因各種因素而異，例如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別與體重、和肽引起個(gè)體所需應(yīng)答的能力。劑量方案經(jīng)過(guò)調(diào)整，可以提供最佳的治療或預(yù)防應(yīng)答。例如，可以每日分若干次給藥或者可以適當(dāng)減少劑量，這視治療情形的緊急程度而定。
活性化合物可以按適宜的方式給藥，例如注射(皮下、靜脈內(nèi)等)、口服給藥、吸入、透皮用藥或直腸給藥。根據(jù)給藥途徑，活性化合物可以是包衣的，以保護(hù)化合物不受酶、酸和其他自然條件的作用，這些可能使化合物失去活性。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥物形式的活性化合物，用在本文所述的療法中。活性化合物還可以用于治療藥物的制備。
V、其他藥物的給藥治療可以得到其他藥物給藥的補(bǔ)充，以進(jìn)一步增加免疫應(yīng)答。例如，可以將佐劑和/或細(xì)胞因子對(duì)受治療者給藥。
在一種實(shí)施方式中，可以將細(xì)胞因子給藥，例如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、白介素1、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素10和/或白介素12。也可以將干擾素給藥，例如α、β和/或γ干擾素。優(yōu)選地，將諸如IL-12等細(xì)胞因子給藥，它們有助于Th1-型T輔助應(yīng)答的形成和細(xì)胞免疫的形成。在另一種實(shí)施方式中，可以將其他調(diào)制共同刺激信號(hào)的藥物對(duì)受治療者給藥，例如抗-CD28抗體。
在另一種實(shí)施方式中，可以將已知為佐劑的藥物給藥。如今唯一廣泛用于人的佐劑是明礬(磷酸鋁或氫氧化鋁)。其他佐劑例如皂甙及其純化組分Quil A、Freund完全佐劑和其他用于研究與獸醫(yī)應(yīng)用的佐劑在人用疫苗中具有潛在的用途。不過(guò)，也可以使用新的化學(xué)限定的制劑，例如胞壁酰二肽、一磷?；|(zhì)A、磷脂綴合物(例如Goodman-Snitkoff等《免疫學(xué)雜志》147410-415(1991)所述的那些)、雷瑣酚、非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯油酰醚和正十六烷基聚乙烯醚)、酶抑制劑(包括胰蛋白酶抑制劑)、二異丙基氟代磷酸酯(DEP)和抑肽酶。在將抗原給藥的實(shí)施方式中，抗原例如可以被包封在脂蛋白體內(nèi)，如Miller等《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1761739-1744(1992)所述，引用在此作為參考文獻(xiàn)，或者被包封在脂質(zhì)囊中，例如Novasome TM脂質(zhì)囊(Micro Vescular Systems，Inc.，Nashua，N.H.)，以進(jìn)一步增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
除非另有指示，本發(fā)明的實(shí)施將采用本領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)技術(shù)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)解釋。例如參見(jiàn)《遺傳學(xué)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第2版Sambrook，J.等編(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))；《分子生物學(xué)簡(jiǎn)明方案》第3版Ausubel，F(xiàn).等編(Wiley，NY(1995))；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover編，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編(1984))；Mullis等美國(guó)專(zhuān)利No4,683,195；《核酸雜交》(B.D.Hames & S.J.Higgins編(1984))；專(zhuān)著《酶學(xué)方法》(Academic Press，Inc.，N.Y.)；《細(xì)胞與分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Mayer和Walker編，Academic Press，London(1987))；《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)》第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編(1986))；Miller，J.《分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)》(Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1972))。
所有引述在本申請(qǐng)中的參考文獻(xiàn)、未決專(zhuān)利申請(qǐng)和公布的專(zhuān)利的內(nèi)容據(jù)此特意加以引用作為參照。本文公開(kāi)的每篇參考文獻(xiàn)都是全文引用的。作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的所有專(zhuān)利申請(qǐng)也都全文引用在此作為參考文獻(xiàn)。
下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，它們不應(yīng)當(dāng)被解釋為進(jìn)一步的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1可溶性共同刺激分子增強(qiáng)CTL應(yīng)答最佳的T細(xì)胞活化作用既要求通過(guò)T細(xì)胞受體發(fā)信號(hào)，也要求共同刺激作用。B7-1和B7-2是APC表面上的兩種有力的共同刺激分子。已經(jīng)檢查了B7-2的可溶形式體內(nèi)對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的作用?？扇苄苑肿邮且环N嵌合蛋白，含有B7-2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，與小鼠IgG2a的Fc區(qū)融合。在用II類(lèi)限制肽免疫之時(shí)將B7-2Ig融合蛋白給藥，顯著增強(qiáng)抗原-特異性T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子應(yīng)答。B7-2Ig給藥還增強(qiáng)對(duì)I類(lèi)限制肽免疫的CTL應(yīng)答。在對(duì)II類(lèi)限制肽的T輔助細(xì)胞應(yīng)答的存在下，B7-2Ig對(duì)CTL應(yīng)答的增強(qiáng)作用顯著增加。這些發(fā)現(xiàn)證明了共同刺激分子、例如B7-2的可溶性蛋白形式對(duì)多T細(xì)胞免疫應(yīng)答參數(shù)的免疫刺激活性，并且證明，這些分子在傳染病和疫苗適應(yīng)征中具有臨床應(yīng)用。
實(shí)施例1所用材料和方法小鼠本研究使用7至10周齡的雌性BALB/cJ小鼠(Jackson Labs，BarHarbor，ME)。
肽免疫原的制備所用全部肽都是H-2d-限制的優(yōu)勢(shì)免疫表位，來(lái)自流感病毒A/PR18/34的核蛋白(NP)。借助HOBT/DCC氨基酸活化作用，利用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc/NMP化學(xué)，在PE Biosystems 430A肽合成儀上合成I類(lèi)限制肽aa 147-155 TYQRTRALV(Taylor，P.M.等1987《免疫遺傳學(xué)》26267)和II類(lèi)限制肽aa 55-77 RLIQNSLTIERMVLSAFDERRNK-OH與aa 206-229 FWRGENGRKTRIAYERMCNILKGK(Brett，S.J.等1991《免疫學(xué)雜志》1471647)。在Beckman HPLC上分析和純化，利用Bruker MALDI質(zhì)譜儀確認(rèn)質(zhì)量。
AIPR18/34病毒原種的制備為了制備和滴定AIPR18/34流感病毒原種，將種病毒按104稀釋比注射到10天含胚雞卵中。培養(yǎng)42小時(shí)后，逐個(gè)收獲被感染卵的尿囊液，在血液瓊脂板上加以無(wú)菌確認(rèn)。匯集無(wú)菌的尿囊液，制備等分試樣，速凍貯存在-70℃下。在病毒的快速融化和稀釋(在尿囊液中)之后進(jìn)行噬斑滴定(Bucher，D.J.等1991《臨床微生物學(xué)雜志》292484)。
B7-2Ig融合蛋白如前人所述表達(dá)和純化B7-2Ig融合蛋白(Fields，P.E.等1998《免疫學(xué)雜志》1615268)。簡(jiǎn)而言之，表達(dá)質(zhì)粒pED是這樣構(gòu)建的，連接編碼小鼠B7-2的信號(hào)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的cDNA與編碼小鼠IgG2a鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)的基因組DNA。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞系中，用前人所述技術(shù)擴(kuò)增(Kaufman，R.J.等1988《生物化學(xué)雜志》2636352)。使?jié)饪s后的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液通過(guò)蛋白A瓊脂糖快速流動(dòng)柱(PharmaciaBiotech)。將B7-2Ig用20mM檸檬酸鹽pH3.0洗脫，用1M Tris(Sigma)pH8.0中和，通過(guò)緩沖交換配制在PBS pH7.2中。利用280nm吸光度計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，消光系數(shù)為1.33cm/mg/ml。內(nèi)毒素水平小于0.25EU/mg，這是用凝膠凝塊測(cè)定法測(cè)定的(Cape Cod Associates)。多聚體形式蛋白質(zhì)的百分率小于1％，這是用TSK 3000 SWXL柱測(cè)定的(TosoHaas USA，Mongomeryville，PA)。B7-2Ig的體外共同刺激活性已經(jīng)得到證實(shí)(Fields，P.E.等1998《免疫學(xué)雜志》1615268)。這里列舉的實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次，結(jié)果是相似的。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)進(jìn)行一次，使用抗無(wú)關(guān)人蛋白GDF-9的純化小鼠單克隆IgG2a(Genetics Institute，CambridgeMA)作為B7-2Ig處理的對(duì)照。
肽免疫將100μg指定肽或肽混合物按體積1∶1與IFA(Sigma)混合，乳化。向尾根部皮下給以100μl抗原/IFA乳劑，致小鼠免疫。在鄰近肽免疫部位的部位將100μl B7-2Ig皮下給藥。在收獲淋巴結(jié)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，小鼠在尾根部和頸后部都接受肽和B7-2Ig給藥，如上所述。每個(gè)治療組由5只小鼠組成。所給藥的是B7-2Ig的0.1氫氧化鋁溶液(Rehydragel，Rehies，Dublin，Ireland)。
活病毒免疫和攻擊將Metafane(Mallinckrodt Veterinary，Mundelein，IL)通過(guò)頭錐體給藥，直至小鼠喪失反射應(yīng)答。將稀釋在PBS中的活病毒鼻內(nèi)給藥，最終濃度為40μl。病毒致死劑量(4,000PFU/小鼠)導(dǎo)致未免疫小鼠100％死亡。40PFU/小鼠的免疫劑量導(dǎo)致沒(méi)有死亡，完全保護(hù)小鼠不受致死攻擊。
增殖測(cè)定在指定日期收集淋巴結(jié)(腸系膜結(jié)除外)和脾臟，制備單細(xì)胞懸液，在200μl RPMI 1640(Gibco/BRL)中，按5×105細(xì)胞/孔培養(yǎng)在平底96孔平板中，培養(yǎng)基補(bǔ)充有5×10-5M 2ME、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(Gibco/BRL)和10％FCS。在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)按指定濃度加入II類(lèi)限制肽。利用1450 Microbeta平板讀數(shù)器(Wallac)，通過(guò)18小時(shí)脈沖處理(1μC/孔)后的3H胸苷結(jié)合作用測(cè)量增殖作用。初次免疫后第3、5、7和9天進(jìn)行淋巴結(jié)細(xì)胞的增殖應(yīng)答比較。再次免疫后三天收獲脾臟，評(píng)估再次應(yīng)答。
細(xì)胞因子測(cè)定如上關(guān)于增殖測(cè)定所述培養(yǎng)細(xì)胞。在第3天收獲上清液，利用商業(yè)上可得到的試劑盒，通過(guò)ELISA法測(cè)定IFN-γ、IL-5和IL-13的水平(IFN-γ用Genzyme，Cambridge MA測(cè)定，IL-5用Endogen，Woburn MA測(cè)定，IL-13用R&D Systems，Minneapolis，MN測(cè)定)。
個(gè)別未分離的小鼠血細(xì)胞樣本的CTL測(cè)定初次免疫后兩至三周，從Aerrane(Ohmeda Caribe，Inc，Guayama，PR)麻醉的小鼠眼眶后放血，收集血液樣本(每份150μl至200μl)。將樣本用100μl含有50U肝素的PBS稀釋。取40μl樣本進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。樣本的微分計(jì)數(shù)不是例行方法。在研究期間不同時(shí)間取100份樣本進(jìn)行微分計(jì)數(shù)，淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞部分的百分率為69％±8％。洗滌細(xì)胞，以除去肝素。將總計(jì)8×105WBC/小鼠重新懸浮在10ml如上關(guān)于增殖測(cè)定所述經(jīng)過(guò)補(bǔ)充的RPMI 1640培養(yǎng)基中，另外，為產(chǎn)生體外初次CTL應(yīng)答而作下列補(bǔ)充4μg/ml抗-CD28(PV1.17)與10U/ml重組鼠IL-12(rmIL-12，Genetics Institute，Cambridge，MA)、10U/ml IL-2與200U/mlIL-6(Genzyme，Cambridge，MA)、0.1pM I類(lèi)限制肽(TYQRTRALV，aa147-155)和1×106/ml輻射處理(2,000rads)同基因脾細(xì)胞，脾細(xì)胞用經(jīng)過(guò)0.017M Tris緩沖的0.17M NH4Cl處理過(guò)，以溶解RBC(Gajewski，T.F.1996《免疫學(xué)雜志》156465)。
將體積為100μl的細(xì)胞平板接種在96孔圓底Costar平板中，每孔總計(jì)8×103個(gè)白細(xì)胞。每份血液樣本總共平板接種80個(gè)孔。每個(gè)平板上有16個(gè)孔僅接受含有輻射處理脾細(xì)胞的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)的第7天，倒置平板以傾瀉上清液，攪拌平板以懸浮細(xì)胞顆粒。將P815細(xì)胞用10μg/mlI類(lèi)限制肽脈沖處理過(guò)夜，制備抗原-陽(yáng)性(Ag-陽(yáng)性)靶。向50％孔的100μl培養(yǎng)基中加入1×103Ag-陽(yáng)性、51Cr標(biāo)記的P815靶，向其余50％加入1×103Ag-陰性、51Cr標(biāo)記的對(duì)照P815靶。每個(gè)平板不含效應(yīng)細(xì)胞的16個(gè)孔中，8個(gè)用來(lái)自發(fā)釋放，8個(gè)用于最大釋放測(cè)量。加入20μl 10％Triton X100達(dá)到全體釋放。培養(yǎng)4小時(shí)后，將50μl上清液/孔收獲到Wallac 96孔平板(1450-401)內(nèi)，加入125μl閃爍劑(OptiPhase SuperMix，Wallac，Turku，F(xiàn)inland)，在Wallac Microbeta 1450中計(jì)數(shù)平板。
平均特異性溶胞率的計(jì)算按照標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算每孔的溶胞率 其中全體釋放是所有接受靶和triton-X100的孔的平均cpm，培養(yǎng)基釋放是所有僅接受靶和培養(yǎng)基的孔的平均cpm+SD。按照下列公式計(jì)算每孔的平均特異性溶胞率 數(shù)據(jù)以平均特異性溶胞±SD表示，這是通過(guò)每組五只小鼠所得每孔平均特異性溶胞值再取平均而計(jì)算得到的。利用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
結(jié)果B7-2Ig增強(qiáng)對(duì)II類(lèi)限制肽免疫的初次CD4+T細(xì)胞增殖應(yīng)答為了測(cè)定B7-2Ig是否會(huì)增強(qiáng)或抑制對(duì)肽免疫的初次T細(xì)胞應(yīng)答，在有或沒(méi)有B7-2Ig給藥的存在下將小鼠用肽免疫。將來(lái)自A/PR/8/34流感病毒NP的II類(lèi)限制肽aa 55-77和aa 206-229在IFA中的混合物皮下給藥。這些肽已經(jīng)顯示是免疫顯性CD4+Th細(xì)胞表位(Brett，S.J.等1991《免疫學(xué)雜志》1471647，Brett，S.J.和J.P.Tite.1996)。與及不與H-2連接的基因都影響流感核蛋白表位被CD4+T細(xì)胞識(shí)別(《免疫學(xué)》8742)。在鄰近部位將B7-2Ig(0.1％明礬溶液)給藥。在預(yù)備研究中，在免疫后第3、5、7和9天測(cè)量淋巴結(jié)細(xì)胞的肽特異性增殖應(yīng)答。應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)不受B7-2Ig給藥的影響。在免疫后第7和9天，B7-2Ig和對(duì)照處理的小鼠都觀察到最佳的增殖應(yīng)答。如圖1所示，在肽免疫之時(shí)用B7-2Ig處理導(dǎo)免疫9天后收獲的淋巴結(jié)細(xì)胞的抗原特異性增殖應(yīng)答顯著增加(p＝0.014，體外用50μg/ml肽重新刺激)。圖1中，將每組五只小鼠在兩個(gè)皮下部位用IFA乳劑免疫，每次注射的IFA乳劑各含有100μg兩種II類(lèi)限制肽或PBS。在鄰近免疫部位的部位將100μg B7-2IgG2a的0.1％明礬溶液或單獨(dú)的0.1％明礬給藥。將小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞用單獨(dú)的肽免疫(-○-)、用單獨(dú)的B7-2Ig處理(-△-)或者用肽免疫且用B7-2Ig處理(-■-)，在免疫9天后收獲，體外各用指定濃度的免疫所用兩種肽重新刺激。不接受B7-2Ig的肽免疫小鼠接受明礬作為對(duì)照。通過(guò)3H-胸苷結(jié)合作用測(cè)定增殖作用。數(shù)據(jù)以每組5只小鼠的平均cpm/孔±SD表示。當(dāng)使用IgG2a mAb小鼠作為對(duì)照時(shí)得到相似結(jié)果。數(shù)據(jù)來(lái)自三次代表性實(shí)驗(yàn)之一。在沒(méi)有免疫作用下的B7-2Ig給藥不導(dǎo)致增殖應(yīng)答，證明了B7-2Ig作用在初次免疫后的抗原依賴(lài)性。這些結(jié)果證明，B7-2Ig的體內(nèi)給藥增強(qiáng)對(duì)肽免疫的CD4+Th細(xì)胞應(yīng)答。
B7-2Ig增強(qiáng)回憶應(yīng)答為了試驗(yàn)初次抗原特異性增殖應(yīng)答的B7-2Ig依賴(lài)性增強(qiáng)作用是否增強(qiáng)回憶應(yīng)答，在有或沒(méi)有B7-2Ig處理的存在下將小鼠用肽免疫，四十六天后加強(qiáng)，而沒(méi)有進(jìn)一步的B7-2Ig給藥。再次免疫后3天收集脾細(xì)胞，測(cè)量肽特異性增殖應(yīng)答。如圖2所示，在初次免疫之時(shí)已經(jīng)接受單一B7-2Ig處理的小鼠在再次免疫后比從未接受B7-2Ig的小鼠具有更大的增殖應(yīng)答(p＝0.0006，體外用100pg/ml肽重新刺激)。將每組五只小鼠用單獨(dú)的肽免疫(-○-)、用單獨(dú)的B7-2Ig處理(-△-)或者用肽免疫且用B7-2Ig處理(-■-)。初次免疫后第46天，在沒(méi)有B7-2Ig共同給藥的存在下將兩組肽免疫小鼠都用肽重新免疫。非免疫小鼠僅接受IFA。重新免疫后三天，將脾細(xì)胞體外各用指定濃度的免疫所用兩種肽重新刺激。通過(guò)3H-胸苷結(jié)合作用測(cè)定增殖作用。數(shù)據(jù)以每組5只小鼠的平均cpm/孔±SD表示。數(shù)據(jù)來(lái)自兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)之一。這些數(shù)據(jù)表明，B7-2Ig當(dāng)用作初次T細(xì)胞應(yīng)答的佐劑時(shí)，增強(qiáng)回憶應(yīng)答。
B7-2Ig增強(qiáng)Th1與Th2依賴(lài)性初次細(xì)胞因子應(yīng)答為了測(cè)定作為免疫佐劑的B7-2Ig是否有差別地促進(jìn)Th1或Th2應(yīng)答的形成，在免疫后第3、5、7和9天分析免疫小鼠淋巴結(jié)細(xì)胞在初次免疫后的肽特異性細(xì)胞因子應(yīng)答。正如增殖應(yīng)答一樣，在第9天觀察到最佳的細(xì)胞因子應(yīng)答。如表I所示，在用肽免疫之時(shí)的B7-2Ig給藥導(dǎo)致與Th1有關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ(p＝0.017)、與Th2有關(guān)的細(xì)胞因子IL-5(p＝0.011)和IL-13(p＝0.002)的產(chǎn)生水平顯著增加。在來(lái)自用B7-2Ig處理的未免疫小鼠的培養(yǎng)物中沒(méi)有觀察到抗原特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生作用。這些結(jié)果表明，B7-2Ig增強(qiáng)Th1與Th2表型的初次T細(xì)胞應(yīng)答。
B7-2Ig增強(qiáng)對(duì)I類(lèi)限制肽的CTL應(yīng)答膜結(jié)合B7與CD28的相互作用已經(jīng)顯示可以在沒(méi)有CD4+細(xì)胞的存在下誘導(dǎo)體外CTL應(yīng)答(Harding，F(xiàn).A.等1993《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1771791)。為了試驗(yàn)B7-2Ig對(duì)初次CTL應(yīng)答的作用，將小鼠用免疫顯性I類(lèi)限制肽的IFA乳劑免疫，伴隨或者不伴隨B7-2Ig給藥。利用少量血樣測(cè)量未分離外周血細(xì)胞的肽特異性CTL應(yīng)答，CTL測(cè)定如材料和方法所述。該測(cè)定有可能實(shí)現(xiàn)在單一實(shí)驗(yàn)中分析大量小鼠、評(píng)估組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異、在免疫應(yīng)答期間重復(fù)個(gè)別小鼠的CTL測(cè)定和研究CTL應(yīng)答與體內(nèi)結(jié)果之間的相互關(guān)系。
數(shù)據(jù)以每只小鼠的單一數(shù)值(平均特異性溶胞率)表示(圖3)。將肽的IFA乳劑給藥(100μg/小鼠)。將B7-2Ig皮下共同給藥(100μg的0.1％明礬溶液/小鼠)。免疫后三周收集未分離的血液，測(cè)量CTL。數(shù)據(jù)以平均特異性溶胞率±SD表示。活病毒免疫組的數(shù)值來(lái)自2只小鼠的單一匯集物，在9項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中試驗(yàn)18只小鼠，得到該組的平均特異性溶胞率為52±12。所有其他組中，每組有五只小鼠。所示數(shù)據(jù)來(lái)自三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)之一。對(duì)I類(lèi)限制肽IFA乳劑的應(yīng)答不明顯高于背景。該發(fā)現(xiàn)與Fayolle等1991《免疫學(xué)雜志》147406的發(fā)現(xiàn)是一致的，他們指出在沒(méi)有T細(xì)胞的幫助下，對(duì)I類(lèi)限制肽IFA乳劑的CTL應(yīng)答接近于背景水平。當(dāng)在用I類(lèi)限制肽IFA乳劑免疫之時(shí)將B7-2Ig給藥時(shí)，觀察到應(yīng)答有微小而統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著(p＝0.013)的增加(圖3)。不過(guò)，與用活病毒免疫的小鼠的肽特異性應(yīng)答相比，用肽免疫且用B7-2Ig共同給藥的小鼠的肽特異性CTL應(yīng)答的幅度小。因此，100μg B7-2Ig的共同給藥不升高對(duì)I類(lèi)限制肽免疫作用的應(yīng)答至用有效活病毒免疫法所達(dá)到的最大水平。
B7-2Ig對(duì)CTL應(yīng)答的最佳增強(qiáng)作用需要T細(xì)胞的幫助由于最佳的CTL應(yīng)答取決于Th細(xì)胞(Fayolle，C.等1991《免疫學(xué)雜志》1474069；Keene，J.A.等1982《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》155768；vonHerrath，M.G.等1996《病毒學(xué)雜志》701072和Ossendorp，F(xiàn).等1998《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》187693)，因此在將小鼠用已知引起Th細(xì)胞應(yīng)答的肽共同免疫的條件下試驗(yàn)B7-2Ig對(duì)CTL應(yīng)答的作用。將小鼠用含有單獨(dú)的I類(lèi)限制肽或I類(lèi)限制肽與兩種II類(lèi)限制肽的混合物的IFA乳劑免疫，如圖1與2和下表I所述。測(cè)量未分離的外周血細(xì)胞的CTL應(yīng)答(圖4)。以單一的IFA乳劑形式進(jìn)行肽免疫作用。按指定方法將小鼠免疫和處理。三周后，測(cè)量外周血液的CTL應(yīng)答。數(shù)據(jù)以平均特異性溶胞率±SD表示。活病毒免疫組的數(shù)值來(lái)自2只小鼠的單一匯集物，在9項(xiàng)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中試驗(yàn)18只小鼠，得到該組的平均特異性溶胞率為52±12。所有其他組中，每組有五只小鼠。接受II類(lèi)限制肽IFA乳劑和對(duì)照Ig明礬溶液的組的平均特異性溶胞率減去接受對(duì)照Ig的組的平均特異性溶胞率。接受II類(lèi)限制肽IFA乳劑和B7-2Ig明礬溶液的組的平均特異性溶胞率減去接受B7-2Ig的組的平均特異性溶胞率。所示數(shù)據(jù)來(lái)自四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)之一。
用I類(lèi)與II類(lèi)限制肽的混合物免疫的小鼠細(xì)胞的平均特異性溶胞率顯著高于用單獨(dú)的I類(lèi)限制肽免疫的小鼠細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)顯示p＝0.046，重復(fù)實(shí)驗(yàn)為.004)。用I類(lèi)與II類(lèi)限制肽的混合物免疫且用100μg B7-2Ig處理導(dǎo)致平均特異性溶胞率顯著大于不接受B7-2Ig的肽免疫小鼠(四次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中p＝0.003、p＝0.0001、p＝0.045和p＝0.0012)。當(dāng)B7-2Ig的劑量增加一倍至200μg/小鼠時(shí)，并不增加這種應(yīng)答，說(shuō)明100μg劑量誘導(dǎo)最大的B7-2Ig依賴(lài)性增強(qiáng)作用。
肽混合物免疫與B7-2Ig處理的結(jié)合導(dǎo)致肽特異性CTL應(yīng)答在幅度上類(lèi)似于活病毒免疫作用所引起的應(yīng)答。將9項(xiàng)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中18只活病毒免疫小鼠所得數(shù)值取平均后，得到平均特異性溶胞值為52±12，證明了少量外周血樣CTL測(cè)定法的可再現(xiàn)性和在T細(xì)胞的幫助與B7-2Ig的存在下的肽的免疫作用所引起的應(yīng)答相當(dāng)于有效活病毒免疫法所引起的應(yīng)答這一結(jié)論的有效性。從外周血細(xì)胞檢測(cè)的CTL應(yīng)答在2至3周達(dá)到峰值，在第五周淡化，用活病毒免疫的小鼠和用肽免疫且用B7-2Ig處理的小鼠都是如此，再次說(shuō)明應(yīng)答的相似性。不過(guò)正如下文所討論的，用肽混合物免疫且用B7-2Ig處理的小鼠不被保護(hù)免受致死病毒的攻擊。
圖3和4數(shù)據(jù)是由配制在0.1％明礬中的B7-2Ig所產(chǎn)生的，前者本身是一種經(jīng)過(guò)臨床批準(zhǔn)的免疫佐劑(Aprile，M.A.等1966《加拿大公共衛(wèi)生雜志》57343)。單獨(dú)的明礬或?qū)φ誌g的明礬溶液給藥不影響抗肽應(yīng)答，明礬制劑也不是B7-2Ig依賴(lài)性免疫增強(qiáng)作用所需的。不過(guò)，明礬制劑的確強(qiáng)化B7-2Ig的作用。若直接比較B7-2Ig的明礬溶液的作用與B7-2Ig的PBS溶液的作用，在將B7-2Ig的明礬溶液給藥時(shí)觀察到更大的CTL應(yīng)答增強(qiáng)作用(平均溶胞率含有明礬為72±13，不含明礬為38±12，p＝0.007)。
T細(xì)胞的最佳抗原特異性活化作用和調(diào)節(jié)作用需要共同刺激信號(hào)從APC表面上的B7分子釋放到T細(xì)胞表面上的CD28與CTLA-4(Boussiotis，V.A.等1996《免疫學(xué)評(píng)論》1535；Lenschow，D.J.等1996《免疫學(xué)年評(píng)》14233；Green，J.M.等1994《免疫》1501；Tivol，E.A.等1995《免疫》3541和Waterhouse，P.1995《科學(xué)》270985)。多種小鼠模型研究顯示，通過(guò)增加B7的細(xì)胞表面表達(dá)能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答。在這些研究中，B7表達(dá)的增加是如下誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)(Baskar，S.等1993《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》905687；Cavallo，F(xiàn).等1995《歐洲免疫學(xué)雜志》251154；Coughlin，C.M.等1995《癌癥研究》554980；Chen，L.等1992《細(xì)胞》711093；Chen，L.等1994《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》179523；Gajewski，T.F.等1996《免疫學(xué)雜志》82909；Yang，G.等1995《免疫學(xué)雜志》154279和Dunussi-Joannopoulos K.等1996《血液》872938)、cDNA注入(Kim，J.J.等1997《天然生物工程》15641；Kim，J.J.等1998《新疫苗》161828和Horspool，J.H.等1998《免疫學(xué)雜志》1602706)或用病毒載體感染(Chamberlain，R.S.等1996《癌癥研究》562832；Emtage，P.C.等1998《免疫學(xué)雜志》1602531；Hodge，J.W.等1994《癌癥研究》545552和Putzer，B.M.等1997《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》9410889)。利用增加體內(nèi)B7水平的不同策略，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了B7-2的可溶性蛋白形式B7-2Ig，由小鼠IgG2a的Fc組成，該Fc與B7-2的細(xì)胞外部分融合，該部分與每條Ig鏈連接。B7-2Ig的體內(nèi)給藥增強(qiáng)抗原特異性Th細(xì)胞與CTL應(yīng)答。因而，B7-2Ig的體內(nèi)給藥是腫瘤細(xì)胞的來(lái)自體外B7轉(zhuǎn)導(dǎo)或者使用病毒或DNA載體優(yōu)化B7-2介導(dǎo)共同刺激的簡(jiǎn)單的替代選擇。
因?yàn)閭魅静『妥泽w免疫疾病的后果大大受到應(yīng)答性Th細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的模式的影響，所以人們有興趣確定B7途徑是否能夠用來(lái)向Th1或Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答偏斜(Kuchroo，V.K.等1995《細(xì)胞》8010；Lenschow，D.J.等1995《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1811145；Corry，D.B.等1994《免疫學(xué)雜志》1534142；Freeman，G.J.等1995《免疫》2523；Schweitzer，A.N.等1997《免疫學(xué)雜志》158713；Rulifson，I.C.等1997《免疫學(xué)雜志》158658和McAdam，A.J.等1998《免疫學(xué)評(píng)論》165231)。大量實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)表明，Th2分化比Th1分化更依賴(lài)于B7的共同刺激作用(Lenschow，D.J.等1995《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1811145；Corry，D.B.等1994《免疫學(xué)雜志》1534142；Freeman，G.J.等1995《免疫》2523和Rulifson，I.C.等1997《免疫學(xué)雜志》158658)?？?B7 mAb已經(jīng)成功地用于體內(nèi)操縱T細(xì)胞分化。B7-1被mAb阻斷據(jù)報(bào)道有助于Th2分化，而B(niǎo)7-2的阻斷有助于Th1分化(Kuchroo，V.K.等1995《細(xì)胞》80Mar 10(5)；Lenschow，D.J.等1995《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1811145；Corry，D.B.等1994《免疫學(xué)雜志》1534142；Freeman，G.J.等1995《免疫》2523和Rulifson，I.C.等1997《免疫學(xué)雜志》158658)。相反，Schweitzer等利用B7失效小鼠APC發(fā)現(xiàn)，B7-1或B7-2體外似乎都不選擇性調(diào)節(jié)Th1或Th2的分化(Schweitzer，A.N.等1997《免疫學(xué)雜志》158713)。該例數(shù)據(jù)顯示，B7-2Ig的體內(nèi)給藥增強(qiáng)Th1和Th2型的抗原特異性細(xì)胞因子應(yīng)答。因此，治療潛在性B7-2Ig很可能在以升高而非偏斜應(yīng)答為目標(biāo)的情況下是最好的。
為了試驗(yàn)B7-2Ig對(duì)CTL應(yīng)答的作用，比較用來(lái)自流感病毒A/PR/8/34的NP的肽所引起的肽特異性CTL應(yīng)答和用來(lái)自活病毒免疫小鼠的相同的肽所引起的應(yīng)答。B7-2Ig處理誘導(dǎo)對(duì)I類(lèi)限制肽IFA乳劑的應(yīng)答的小而顯著的增強(qiáng)作用。這些數(shù)據(jù)是一致的，證明在沒(méi)有外來(lái)幫助的存在下，用B7轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞足以產(chǎn)生體外CTL應(yīng)答(Harding，F(xiàn).A.等1993《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》1771791)。
不過(guò)，被B7-2Ig增強(qiáng)的應(yīng)答顯著低于對(duì)活病毒免疫小鼠的相同的肽的CTL應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)顯示，小鼠能夠比通過(guò)I類(lèi)限制肽免疫且B7-2Ig共同給藥所引起的小鼠應(yīng)答產(chǎn)生大得多的抗肽應(yīng)答。
在進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)I類(lèi)限制肽的應(yīng)答的努力中，研究了向含有I類(lèi)限制CTL肽抗原的IFA乳劑中加入Th細(xì)胞、II類(lèi)限制肽抗原的作用。前人報(bào)道最佳的CTL應(yīng)答取決于Th細(xì)胞(Fayolle，C.等1991《免疫學(xué)雜志》1474069；Keene，J.A.等1982《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》155768；von Herrath，M.G.等1996《病毒學(xué)雜志》701072和Ossendorp，F(xiàn).等1998《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》187693)。在用I類(lèi)與II類(lèi)限制肽免疫的小鼠中，CTL應(yīng)答顯著升高。這些數(shù)據(jù)表明，Th細(xì)胞抗原的共同免疫能夠提供對(duì)抗肽抗原的CTL應(yīng)答的幫助。CTL與Th肽表位之間的共價(jià)連接并不是所需要的，提示任何免疫原性蛋白質(zhì)都可以用作共同免疫原，以提供對(duì)CTL應(yīng)答的幫助。我們的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了該結(jié)論，也就是向含有I類(lèi)限制肽的IFA乳劑中加入KLH，導(dǎo)致肽特異性CTL應(yīng)答的顯著增強(qiáng)作用。
盡管得到增強(qiáng)，用I類(lèi)與II類(lèi)限制肽免疫的小鼠的肽特異性CTL應(yīng)答也小于用活病毒免疫的小鼠。向方案中加入B7-2Ig增加用肽混合物免疫的小鼠的CTL應(yīng)答至用活病毒免疫的小鼠的水平。這兩組的應(yīng)答是相當(dāng)?shù)模乔罢卟槐槐Ｗo(hù)免受致死病毒的攻擊。該結(jié)果與Lawson等的結(jié)果是一致的(Lawson，C.M.等1994《病毒學(xué)雜志》683505)，他們通過(guò)將表達(dá)肽的重組疫苗病毒給藥，引起對(duì)用在該項(xiàng)研究中的相同的肽的劇烈CTL應(yīng)答。目前，對(duì)單獨(dú)這種肽的劇烈CTL應(yīng)答不足以賦予BALB/c小鼠以保護(hù)性免疫。
盡管不是B7-2Ig的免疫增強(qiáng)作用所需要的，明礬制劑仍然導(dǎo)致比PBS制劑更大的增強(qiáng)作用。對(duì)照Ig的明礬溶液給藥不影響應(yīng)答，說(shuō)明單獨(dú)的明礬不增強(qiáng)應(yīng)答。
用活病毒感染是I類(lèi)限制應(yīng)答活化作用的天然和有效的途徑(Zinkernagel，R.M.等1979《免疫學(xué)進(jìn)展》2751)。因此，這里列出的、表明從用活病毒免疫的小鼠和用I類(lèi)與II類(lèi)限制肽的混合乳劑免疫且用B7-2Ig處理的小鼠得到相當(dāng)?shù)目闺膽?yīng)答的數(shù)據(jù)確立了后者免疫方案的有效性。目前，引起對(duì)I類(lèi)限制肽的CTL應(yīng)答是很令人感興趣的。近些年來(lái)關(guān)于人CTL象小鼠CTL一樣能夠識(shí)別與腫瘤有關(guān)的I類(lèi)限制肽的證明提示，針對(duì)這些肽的CTL應(yīng)答可以證實(shí)對(duì)人腫瘤有效(van derBruggen，P.等1991《科學(xué)》2541643；Wolfel，T.等1993《國(guó)際癌癥雜志》55237；Maeurer，M.J.1996《黑色素瘤研究》611；Cormier，J.N.等1997《科學(xué)美國(guó)人癌癥雜志》337；Apostolopoulos，V.等1997《免疫學(xué)雜志》1595211；Rosenberg，S.A.1998《天然醫(yī)藥》4321和Nestle，F(xiàn).O.等1998《天然醫(yī)藥》4328)。這種可能性刺激了人們更大的熱情，設(shè)計(jì)優(yōu)化對(duì)I類(lèi)限制肽疫苗的應(yīng)答的免疫方案。據(jù)報(bào)道，多種不同的策略都已取得了成功，包括向重組病毒和細(xì)菌中插入小基因、肽的寡聚化、脂質(zhì)的修飾、cDNA的免疫、使用毒素和細(xì)胞因子作為佐劑和抗原脈沖刺激樹(shù)狀細(xì)胞(Allsopp，C.E.等1996《歐洲免疫學(xué)雜志》261951；Rotzschke，O.等1997《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》9414642；Alving，C.A.等1995《免疫學(xué)評(píng)論》1451；Ciernik，I.F.等1996《免疫學(xué)雜志》1562369；Porgador，A.等1997《免疫學(xué)雜志》158834；Noguchi，Y.等1995《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)》922219和Takahashi，H.等1992《國(guó)際免疫學(xué)》5849)。這里所報(bào)道的方法的優(yōu)點(diǎn)是，它可一貫地應(yīng)用于任何肽，無(wú)需進(jìn)一步修改，對(duì)I類(lèi)和II類(lèi)限制應(yīng)答都有效。
B7-2Ig與肽免疫的共同給藥升高相對(duì)弱的I類(lèi)限制肽應(yīng)答至相當(dāng)于由活病毒免疫所引起的水平，提示了B7-2蛋白的可溶形式也能夠增強(qiáng)對(duì)其他弱免疫原的應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)顯示，B7-2的可溶性蛋白形式可以在免疫系統(tǒng)應(yīng)答無(wú)效的癌癥或傳染病療法中增強(qiáng)抗原特異性免疫應(yīng)答。
表ITh細(xì)胞因子應(yīng)答的B7-2Ig依賴(lài)性增強(qiáng)作用a細(xì)胞因子在體外重新刺激后的表達(dá)體內(nèi)處理 IFNγ IL-5IL-13(pg/ml±SD) (pg/ml±SD) (pg/ml±SD)肽的免疫 b.db54±44 136±125肽免疫加B7-2Ig 1720±9862479±1104 5365±1795IFA加B7-2Igb.dbb.dbb.dba將每組五只小鼠在兩個(gè)皮下部位用IFA乳劑免疫，每次注射的乳劑含有100μg兩種II類(lèi)限制肽或PBS。在鄰近免疫部位的部位將100μgB7-2IgG2a的0.1％明礬溶液或單獨(dú)的0.1％明礬給藥。九天后，收獲淋巴結(jié)細(xì)胞，在培養(yǎng)基中用5μg/ml各種肽重新刺激三天。從一式三份的小孔所得結(jié)果取平均，得到關(guān)于每只小鼠的數(shù)值。數(shù)據(jù)以組內(nèi)小鼠細(xì)胞因子的平均濃度±SD表示。結(jié)果類(lèi)似于使用IgG2a mAb作為對(duì)照的對(duì)照小鼠所得結(jié)果。所示數(shù)據(jù)是三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)之一。b低于測(cè)定法的檢測(cè)限度。
實(shí)施例2B7-IgG融合蛋白增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)已建立腫瘤的消退評(píng)價(jià)了B7-1或B7-2的細(xì)胞外區(qū)與IgG2a之間的融合蛋白關(guān)于它們?cè)谒姆N不同的鼠腫瘤模型中增強(qiáng)抗腫瘤應(yīng)答的能力，包括弱免疫原性黑色素瘤B16/F10。當(dāng)與B7-1或B7-2 IgG混合時(shí)，用輻射處理腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單次疫苗接種，保護(hù)小鼠免受活腫瘤的攻擊。更顯著地，在用與B7-IgG混合的輻射處理腫瘤細(xì)胞進(jìn)行疫苗接種后，已經(jīng)生長(zhǎng)7天的腫瘤消退了。甚至單獨(dú)的B7-IgG的治療性給藥也類(lèi)似地減少了腫瘤的負(fù)擔(dān)。已經(jīng)排斥已建立腫瘤的動(dòng)物對(duì)重新攻擊是耐受性的，強(qiáng)烈提示了B7-IgG的抗腫瘤作用是由腫瘤特異性免疫機(jī)理介導(dǎo)的。另外，用與B7-1或B7-2 IgG混合的輻射處理腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單次疫苗接種，產(chǎn)生抗與腫瘤有關(guān)的抗原的CD8應(yīng)答。因而，B7-IgG與外源性釋放的和內(nèi)源性抗原結(jié)合表現(xiàn)有力的佐劑活性。這些發(fā)現(xiàn)提示了B7-Ig增強(qiáng)抗腫瘤與抗病毒應(yīng)答的臨床價(jià)值。
實(shí)施例2所用材料和方法鼠B7-1-IgGIgG和B7-2-IgG2a融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒是這樣構(gòu)建的，連接編碼鼠B7-1或B7-2的信號(hào)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的DNA與編碼從鼠IgG2a抗體衍生的鉸鏈區(qū)-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域的DNA?？贵w鉸合區(qū)內(nèi)的半胱氨酸殘基保持保守，以便所產(chǎn)生的mB7-1-IgGIgG2a或mB7-2-IgG2a是二聚體和二價(jià)的。在所生成的融合蛋白中，為了防止被高親和性Fc受體結(jié)合和防止補(bǔ)充活化，突變IgG2a區(qū)(稱(chēng)為B7-IgG2mut)。下列CH2結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基被丙氨酸代替#235位亮氨酸、#318位谷氨酸、#320位賴(lài)氨酸和#322位賴(lài)氨酸。關(guān)于B7-IgG蛋白的產(chǎn)生，在CHO細(xì)胞系中表達(dá)質(zhì)粒，分離蛋白質(zhì)。
P815是從肥大細(xì)胞瘤衍生的腫瘤細(xì)胞系，在向DBA/2小鼠(JacksonLaboratories)真皮內(nèi)(i.d.)注射5×104細(xì)胞后生長(zhǎng)成為固體腫瘤。用在這些實(shí)驗(yàn)中的克隆在i.d.注射后自發(fā)轉(zhuǎn)移，25-35天后引起小鼠死亡。MethA是從Balb/C小鼠肉瘤衍生的腫瘤細(xì)胞系，在i.d.注射5×105細(xì)胞后生長(zhǎng)成為固體腫瘤(來(lái)自Taconic的Balb/C小鼠)。B16/F10是從C57BL/6小鼠(Taconic)黑色素瘤衍生的非免疫原性腫瘤系，在i.d.注射1×105細(xì)胞后生長(zhǎng)成為固體腫瘤，因在25-35天后轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡。膀胱癌MB49也是從C57BL/6小鼠衍生的，i.d.注射1×105細(xì)胞，100％小鼠在5-7天后長(zhǎng)出固體腫瘤。
體外共同刺激測(cè)定法將2×105幼鼠脾細(xì)胞一式三份平板接種在96孔平板上，平板涂有低濃度的抗-CD3 mAb(0-500ng-ml-2C11，Pharmingen)。為了提供共同刺激所必要的信號(hào)，平板同時(shí)涂有抗-CD28 mAb(0-1μg/ml)作為陽(yáng)性對(duì)照，或者涂有B7-1-IgG或B7-2-IgG(0-9μg/m1)。還加入B7-IgG的可溶形式或與次生抗-小鼠IgG2a Ab交聯(lián)的形式。將脾細(xì)胞刺激72小時(shí)。取上清液試樣用于IFN-γ分析，將細(xì)胞用H3-胸苷脈沖處理8小時(shí)。在標(biāo)準(zhǔn)ELISA中進(jìn)行IFN-γ分析，用捕獲Ab R46A4和生物素基化XGM1.2作為檢測(cè)Ab。
疫苗接種方案在預(yù)防性腫瘤疫苗模型中，在第0天，在小鼠被腫瘤細(xì)胞攻擊的同時(shí)進(jìn)行疫苗接種。將小鼠用輻射處理腫瘤細(xì)胞(1×107細(xì)胞)的PBS溶液免疫，其中混合有75-100μg mB7-1-IgG、B7-2-IgG、鼠IgG或者什么也沒(méi)有。對(duì)兩條后肢給以爪墊內(nèi)(i.fp.)注射。在第3或5天重復(fù)一次B7-IgG的注射。在第7天，用限定劑量的活腫瘤細(xì)胞攻擊動(dòng)物，在右脅i.d.注射50μl。監(jiān)測(cè)40-60天內(nèi)的原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)和動(dòng)物的存活率。
在治療性腫瘤疫苗模型中，原發(fā)性腫瘤是通過(guò)i.d.接種限定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞而建立的。在第5-7天(此時(shí)腫瘤可明顯觸知)，用1×107輻射處理腫瘤細(xì)胞i.fp.接種小鼠，其中混合有100μg B7-1-IgG、B7-2-IgG或者什么也沒(méi)有。三天后再次i.fp.注射100μg B7-IgG。這種疫苗接種方案重復(fù)兩或三周。監(jiān)測(cè)第7天至第40-70天內(nèi)的原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和小鼠的存活率。
在治療模型中，將攜帶腫瘤的小鼠B7-IgG用單獨(dú)的融合蛋白處理。i.fp.注射50-100μg單獨(dú)的B7-1-IgG或B7-2-IgG三周，一周兩次。監(jiān)測(cè)40天內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)和存活率。
P1A特異性CTL應(yīng)答的檢測(cè)用混合有或者沒(méi)有混合B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理P815細(xì)胞單次免疫后10-14天，從DBA/2小鼠中收集脾。紅細(xì)胞溶解后，在T25燒瓶?jī)?nèi)將20×106脾細(xì)胞用0.1ng/ml P1A肽和5U/ml IL-2(Pharmingen)重新刺激6天。然后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的5h Cr51-釋放測(cè)定，用A20細(xì)胞作為靶，用10μg/ml P1A進(jìn)行肽脈沖處理或者不進(jìn)行脈沖處理。P1A-肽特異性溶胞百分率以肽-脈沖處理的靶溶胞百分率與未脈沖處理的靶溶胞百分率之間的差異表示。
結(jié)果固定化或交聯(lián)的B7-IgG體外為次優(yōu)刺激的鼠脾細(xì)胞提供共同刺激信號(hào)FACS或Biocore分析測(cè)定了B7-1-IgG和B7-2-IgG融合蛋白與鼠CD28和CTLA-4結(jié)合。為了測(cè)定B7-IgG融合蛋白增強(qiáng)還是抑制T細(xì)胞活化作用，通過(guò)聯(lián)合培養(yǎng)與平板結(jié)合的抗-CD3 mAb和固定在平板上的B7-IgG，體外刺激鼠脾細(xì)胞。與平板結(jié)合的抗-CD28 mAb的共同刺激作用充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照。B7-1-IgG和B7-2-IgG相似地誘導(dǎo)增殖和IFN-γ分泌的劑量依賴(lài)性增加(圖5)。將2×105幼脾細(xì)胞一式三份用50ng/ml抗-CD3單克隆抗體和遞增數(shù)量的固定化抗-CD28抗體或B7-1或B7-2 IgG刺激72小時(shí)。6小時(shí)脈沖后加入3H-胸苷，測(cè)量增殖應(yīng)答。B和C欄分別顯示IFNγ或IL2的數(shù)量，它們?cè)谟?0ng/ml抗-CD3抗體和指定數(shù)量的固定化B7-2-IgG刺激72小時(shí)后釋放。用標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量細(xì)胞因子。在沒(méi)有抗-CD3刺激的存在下，B7-IgG不誘導(dǎo)增殖作用。B7-IgG分子與次生抗-鼠IgG mAb的固定化或交聯(lián)是有效共同刺激所必需的，因?yàn)榭扇苄訠7-IgG蛋白不增強(qiáng)增殖作用或IFN-γ的產(chǎn)生。在其Fc結(jié)合區(qū)突變的B7-IgG蛋白(B7-1-IgG與B7-2-IgG2mut)當(dāng)被固定在平板上時(shí)有效共同刺激脾細(xì)胞。
B7-1-IgG或B7-2-IgG都增強(qiáng)輻射處理腫瘤細(xì)胞疫苗的保護(hù)功效在預(yù)防性腫瘤疫苗模型中評(píng)價(jià)了作為佐劑的B7-IgG融合蛋白。接種5×104活P815腫瘤細(xì)胞，100％幼DBA/2小鼠在5-7天后生成固體腫瘤。將每組10只DBA/2小鼠用1×107輻射處理P815腫瘤細(xì)胞i.fp.免疫一次。細(xì)胞疫苗是單獨(dú)給藥的，或者與100μg的B7-1-IgG、B7-2-IgG或它們的突變蛋白混合給藥。在第5天將B7-IgG再次給藥。作為對(duì)照，在第0和5天將100μg單獨(dú)的B7-1-IgG或B7-2-IgG i.fp.給藥。在第7天用5×104活P815腫瘤細(xì)胞攻擊小鼠。24天后沒(méi)有可觸知的腫瘤，確定對(duì)攻擊具有保護(hù)作用。圖6顯示五次代表性實(shí)驗(yàn)之一的結(jié)果?；钅[瘤攻擊前一周將小鼠用P815腫瘤細(xì)胞免疫不導(dǎo)致對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的保護(hù)作用。不過(guò)，用混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理腫瘤細(xì)胞單次免疫，誘導(dǎo)60-70％保護(hù)作用(圖6，表2)。相反，用單獨(dú)的B7-1-IgG或B7-2-IgG免疫不提供保護(hù)作用(圖6)。14-24天后沒(méi)有固體腫瘤和/或存活至少60天都確認(rèn)了保護(hù)作用。后者說(shuō)明不存在轉(zhuǎn)移性疾病。
為了評(píng)價(jià)IgG結(jié)構(gòu)域在融合蛋白功能中的角色，將小鼠用混合有突變?nèi)诤系鞍譈7-IgGmut的輻射處理P815腫瘤細(xì)胞免疫，該突變的融合蛋白不結(jié)合Fc受體，不活化補(bǔ)體。突變的分子不如野生型有效(圖6，表2)，提示了在B7-IgG分子的Fc結(jié)合中的角色。
還比較了與B7-IgG混合的輻射處理腫瘤細(xì)胞與被B7-1或B7-2轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞的功效。用B7-轉(zhuǎn)染體進(jìn)行疫苗接種，誘導(dǎo)顯著更低的抗腫瘤免疫性，僅保護(hù)了30％的小鼠，而用混合有B7-IgG的輻射處理野生型P815細(xì)胞免疫后保護(hù)了65％(表2)。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，B7-IgG可能是有效生成抗腫瘤保護(hù)作用的佐劑，可以比B7-轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞更有效。
用混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理P815腫瘤細(xì)胞進(jìn)行疫苗接種，治愈小鼠的已建立P815腫瘤為了試驗(yàn)B7-IgG在治療性腫瘤疫苗模型中的佐劑活性，用P815腫瘤細(xì)胞i.d.注射DBA/2小鼠，劑量為在五至七天后生成可觸知的固體腫瘤。在第0天通過(guò)i.d.注射5×104P815細(xì)胞建立固體P815腫瘤。在已經(jīng)形成可觸知的腫瘤之后，在第7天開(kāi)始疫苗接種。圖7顯示如下i.fp.注射小鼠的結(jié)果PBS對(duì)照(A，E)，單獨(dú)的輻射處理P815腫瘤細(xì)胞(B)，與無(wú)關(guān)小鼠IgG2a Ab混合的輻射處理P815腫瘤細(xì)胞(F)，與B7-1-IgG(C)或B7-2-IgG(G)混合的輻射處理P815腫瘤細(xì)胞。在第7、14、21天重復(fù)免疫。三天后分別將PBS、無(wú)關(guān)Ab或B7-IgG再次給藥。監(jiān)測(cè)40天內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)。25-30天后，對(duì)照組動(dòng)物開(kāi)始死于自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤。D和H欄顯示不同治療組的存活時(shí)間。數(shù)據(jù)是四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。腫瘤生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)和疫苗接種后的存活如圖7所示，是四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表。從第一次免疫后約一周開(kāi)始，觀察到混合有B7-IgG的腫瘤細(xì)胞免疫組小鼠腫瘤生長(zhǎng)減少，也就是腫瘤消退。單獨(dú)的輻射處理腫瘤細(xì)胞或混合有無(wú)關(guān)小鼠IgG2a Ab的輻射處理腫瘤細(xì)胞處理組腫瘤生長(zhǎng)不減少?；旌嫌蠦7-IgG的輻射處理P815腫瘤細(xì)胞免疫的三個(gè)周期之后，60-80％的小鼠原發(fā)性腫瘤已經(jīng)消失。原發(fā)性腫瘤的消退與小鼠的長(zhǎng)期存活有相互關(guān)系?；旌嫌蠦7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理P815細(xì)胞免疫增加長(zhǎng)期存活大約80％(圖7D，H)。未治療組或輻射處理腫瘤疫苗對(duì)照組的大部分小鼠一般在25與35天之間死亡，顯然是由肝、脾和淋巴結(jié)內(nèi)形成的自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤所引起的。
在不同腫瘤模型中作為治療性腫瘤疫苗佐劑的B7-IgG為了確定B7-IgG結(jié)果是否與P815腫瘤或DBA/2小鼠株一致，利用兩種不同的小鼠株試驗(yàn)了B7-IgG作為佐劑在三種另外的腫瘤模型中的功效。在所有四種模型中都得到了相似的陽(yáng)性結(jié)果。
將攜帶7日已建立MethA肉瘤的Balb/c小鼠用PBS、單獨(dú)的輻射處理MethA細(xì)胞或混合有B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理MethA細(xì)胞免疫。分別在Balb/c或C57BL/6小鼠中建立固體MethA或B16/F10腫瘤。圖8顯示將每組十只小鼠分別用單獨(dú)的輻射處理腫瘤細(xì)胞(B，E)或混合有25μg(C，D)或100μg(F，G)B7-1-IgG或B7-2-IgG的輻射處理腫瘤細(xì)胞i.fp.免疫。3-4天后再一次給以PBS、B7-1-IgG或B7-2-IgG注射。一組用單獨(dú)的PBS處理(A，關(guān)于B16/F10沒(méi)有顯示)。監(jiān)測(cè)35天腫瘤生長(zhǎng)。一旦腫瘤達(dá)到400mm2，使MethA腫瘤小鼠安樂(lè)死，或者動(dòng)物死于自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤。存活動(dòng)物的百分率如H欄所示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次。用混合有B7-IgG的輻射處理MethA細(xì)胞免疫兩次治愈100％小鼠，而對(duì)照組10-15％小鼠自發(fā)地痊愈(圖8)。在攜帶膀胱癌MB49的C57BL/6小鼠中觀察到相似的結(jié)果。在C57BL/6小鼠中，還研究了高轉(zhuǎn)移性與弱免疫原性黑色素瘤B16/F10的應(yīng)答。用混合有兩種B7-IgG蛋白之一的輻射處理B16腫瘤細(xì)胞免疫三次，相對(duì)對(duì)照而言減少腫瘤生長(zhǎng)，提高長(zhǎng)期存活率(圖8)。對(duì)照組動(dòng)物在35-40天內(nèi)全部死亡，而用B7-IgG疫苗處理過(guò)的小鼠至少有40-80％存活超過(guò)60天(圖8)。這些發(fā)現(xiàn)支持了P815腫瘤模型中的觀察結(jié)果，證明了B7-IgG作為治療性腫瘤疫苗佐劑的有力活性。
單獨(dú)的B7-IgG的治療性給藥誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答如上所述，在沒(méi)有輻射處理腫瘤細(xì)胞的存在下將幼鼠用B7-IgG進(jìn)行預(yù)防性免疫，不保護(hù)小鼠免受腫瘤攻擊。不過(guò)，在所有四種治療性腫瘤模型中，將攜帶腫瘤的小鼠用單獨(dú)的B7-1-IgG或B7-2-IgG處理，減少腫瘤生長(zhǎng)，增加存活率(圖9)。在第0天用活P815(A)、MethA(B)、MB49(C)或C57BL/6(D)腫瘤細(xì)胞接種小鼠。如上所述在第6-8天開(kāi)始免疫。將小鼠用PBS(□)、單獨(dú)的輻射處理腫瘤細(xì)胞(◇)、混合有B7-1-IgG(△)或B7-2-IgG(○)的輻射處理腫瘤細(xì)胞或者單獨(dú)的B7-1-IgG(*)或B7-2-IgG(+)處理。每組7-10只小鼠腫瘤大小的平均值繪圖。一旦腫瘤達(dá)到400mm2大小，使小鼠安樂(lè)死，或者如果它們死于轉(zhuǎn)移性疾病就賦予該值。在所有所試驗(yàn)的模型中，用單獨(dú)的B7-IgG對(duì)攜帶腫瘤的小鼠進(jìn)行治療性處理，延緩腫瘤生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤消退，增加存活率。不過(guò)，B16/F10腫瘤模型數(shù)據(jù)提示，用輻射處理腫瘤細(xì)胞加B7-IgG進(jìn)行疫苗接種的抗腫瘤療效強(qiáng)于單獨(dú)的B7-IgG，至少對(duì)弱免疫原性腫瘤來(lái)說(shuō)如此。
這些可溶性B7-IgG的結(jié)果驚人地給出利用呈遞在細(xì)胞表面上的共同刺激分子所得結(jié)果(固相共同刺激)。在全部三種這些模型中評(píng)價(jià)了用B7-轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行治療性疫苗接種，顯示對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和存活率沒(méi)有作用至具有適度作用。這里利用混合有可溶性B7-Ig的輻射處理腫瘤細(xì)胞疫苗所示作用驚人地強(qiáng)大得多?；旌?00μg B7-IgG與疫苗可提供大約1016B7分子，而在107轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞表面上僅有大約總計(jì)1010-1011B7分子。這樣一種數(shù)量上的差異可以解釋為什么用輻射處理B7-轉(zhuǎn)染體進(jìn)行疫苗接種的效率大大低于活B7-轉(zhuǎn)染體，其中活細(xì)胞能夠增加和增大可利用的B7分子數(shù)量。其他解釋可能涉及B7-IgG分子比表達(dá)在輻射處理腫瘤細(xì)胞表面上的B7分子延長(zhǎng)了存在的時(shí)間。而且，可溶性分子在體內(nèi)可以不同地分布，到達(dá)更適當(dāng)?shù)拿庖叽碳げ课弧?br> B7-IgG介導(dǎo)的腫瘤痊愈是CD8 T細(xì)胞依賴(lài)性的和IFN-γ獨(dú)立性的為了進(jìn)一步描繪適應(yīng)性免疫應(yīng)答參與B7-IgG介導(dǎo)的免疫刺激作用的特征，評(píng)價(jià)了缺乏成熟T與B細(xì)胞的SCID小鼠中的B7-IgG。在SCID小鼠中建立固體腫瘤，然后將它們用單獨(dú)的B7-IgG活輻射處理細(xì)胞疫苗加B7-IgG處理。沒(méi)有一種處理措施對(duì)腫瘤生長(zhǎng)起作用，證明了B7-IgG介導(dǎo)的腫瘤應(yīng)答對(duì)T或B細(xì)胞的依賴(lài)性(圖10)。另在使CD8或CD4T細(xì)胞衰竭之后處理攜帶腫瘤的小鼠。在B7-IgG療法開(kāi)始前一天，注射抗體，使CD8或CD4 T細(xì)胞衰竭。在第28天通過(guò)PBL的FACS分析驗(yàn)證衰竭成功。在CD4衰竭的小鼠中，B7-IgG誘導(dǎo)腫瘤消退和痊愈，與正常小鼠沒(méi)有區(qū)別(圖11)，而CD8衰竭廢除了B7-IgG介導(dǎo)的抗腫瘤活性。腫瘤生長(zhǎng)比CD8衰竭的未治療小鼠緩慢，但是觀察到?jīng)]有腫瘤痊愈(圖11)。
盡管IFN-γ在抗腫瘤免疫監(jiān)視和抗腫瘤應(yīng)答中扮演重要角色，也可確定B7-IgG治愈已建立腫瘤而與IFN-γ無(wú)關(guān)。在IFN-γ失效小鼠中建立固體腫瘤，用B7-IgG或混合有B7-IgG的輻射處理腫瘤細(xì)胞疫苗處理。兩種處理均誘導(dǎo)腫瘤消退和在第28天左右痊愈，相當(dāng)于野生型小鼠，證明了B7-IgG腫瘤療法的IFN-γ獨(dú)立性(圖12)。而且，因其IFN-γ受體突變而對(duì)IFN-γ不是應(yīng)答性的腫瘤用B7-IgG處理后仍然痊愈。
還測(cè)定了B7-IgG在抗腫瘤療法中或者作為疫苗佐劑比阻斷CTLA4抗體更有力。在三種不同的腫瘤模型中，B7-IgG處理治愈腫瘤或者保護(hù)免受腫瘤攻擊，其中抗-CTLA4抗體沒(méi)有作用，盡管它對(duì)CTLA4具有高得多的親和性，前人也報(bào)道了它的阻斷活性。這些數(shù)據(jù)證明，B7-IgG增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)理不僅限于和依賴(lài)于阻斷由CTLA4介導(dǎo)的負(fù)信號(hào)。
表2與輻射處理腫瘤細(xì)胞混合的B7-IgG2a提供保護(hù)性免疫免疫作用保護(hù)百分率 動(dòng)物數(shù)(受攻擊動(dòng)物的被實(shí)驗(yàn)數(shù)(平均+/-SD) 保護(hù)數(shù)/總數(shù))幼鼠 8％(11) 3/42 5輻射處理P815 2％(4) 1/43 5輻射處理P815-B7-1轉(zhuǎn)染體 23％(4) 3/13 2輻射處理P815+B7-1IgG 65％(18)29/45 4輻射處理P815+B7-2IgG 60％(24)23/37 4輻射處理P815+突變的B7-1IgG 28％(4) 5/18 2輻射處理P815+突變的B7-2IgG 20％2/10 1輻射處理P815+抗-CD28 0％ 0/10 1輻射處理P815+抗-CTLA-4 40％4/10 1輻射處理L1210-P1A0％(0) 0/19 2輻射處理L1210-P1A+ 10％(14)2/20 2B7-1-IgGIgG等價(jià)方式本領(lǐng)域技術(shù)人員只需利用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法將認(rèn)識(shí)或者能夠確定很多本文所述發(fā)明的具體實(shí)施方式
的等價(jià)方式。這樣的等價(jià)方法打算為下列權(quán)利要求所涵蓋。
序列表<110>遺傳研究所有限公司(Genetics Institute，Inc)<120>可溶性共同刺激分子增強(qiáng)免疫應(yīng)答的用途<130>GNN-003<140>09/565，316<141>2000-05-05<150>60/132，944<151>1999-05-06<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1491<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(318)..(1181)<220><221>成熟肽<222>(420)<220><223>318到1181bp位置的開(kāi)放讀框<220><223>來(lái)自1474到1479bp位置的交替聚腺苷酸化信號(hào)<400>1ccaaagaaaa agtgatttgt cattgcttta tagactgtaa gaagagaaca tctcagaagt 60ggagtcttac cctgaaatca aaggatttaa agaaaaagtg gaatttttct tcagcaagct 120gtgaaactaa atccacaacc tttggagacc caggaacacc ctccaatctc tgtgtgtttt 180gtaaacatca ctggagggtc ttctacgtga gcaattggat tgtcatcagc cctgcctgtt 240ttgcacctgg gaagtgccct ggtcttactt gggtccaaat tgttggcttt cacttttgac 300cctaagcatc tgaagcc atg ggc cac aca cgg agg cag gga aca tca cca350Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro-30 -25tcc aag tgt cca tac ctg aat ttc ttt cag ctc ttg gtg ctg gct ggt 398Ser Lys Cys Pro Tyr Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly-20 -15 -10ctt tct cac ttc tgt tca ggt gtt atc cac gtg acc aag gaa gtg aaa446Leu Ser His Phe Cys Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys-5 -1 1 5gaa gtg gca acg ctg tcc tgt ggt cac aat gtt tct gtt gaa gag ctg494Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu10 15 20 25gca caa act cgc atc tac tgg caa aag gag aag aaa atg gtg ctg act542Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr30 35 40atg atg tct ggg gac atg aat ata tgg ccc gag tac aag aac cgg acc590Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr45 50 55atc ttt gat atc act aat aac ctc tcc att gtg atc ctg gct ctg cgc638Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg60 65 70cca tct gac gag ggc aca tac gag tgt gtt gtt ctg aag tat gaa aaa686Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys75 80 85gac gct ttc aag cgg gaa cac ctg gct gaa gtg acg tta tca gtc aaa734Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys90 95 100 105gct gac ttc cct aca cct agt ata tct gac ttt gaa att cca act tct782Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser110 115 120aat att aga agg ata att tgc tca acc tct gga ggt ttt cca gag cct830Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro125 130 135cac ctc tcc tgg ttg gaa aat gga gaa gaa tta aat gcc atc aac aca878His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr140 145 150aca gtt tcc caa gat cct gaa act gag ctc tat gct gtt agc agc aaa926Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys155 160 165ctg gat ttc aat atg aca acc aac cac agc ttc atg tgt ctc atc aag974Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys170 175 180 185tat gga cat tta aga gtg aat cag acc ttc aac tgg aat aca acc aag1022Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys190 195 200caa gag cat ttt cct gat aac ctg ctc cca tcc tgg gcc att acc tta1070Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu205 210 215atc tca gta aat gga att ttt gtg ata tgc tgc ctg acc tac tgc ttt1118Ile Ser Val Asn Gly Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe220 225 230gcc cca aga tgc aga gag aga agg agg aat gag aga ttg aga agg gaa1166Ala Pro Arg Cys Arg Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu235 240 245agt gta cgc cct gta taacagtgtc cgcagaagca aggggctgaa aagatctgaa1221Ser Val Arg Pro Val250ggtagcctcc gtcatctctt ctgggataca tggatcgtgg ggatcatgag gcattcttcc 1281cttaacaaat ttaagctgtt ttacccacta cctcaccttc ttaaaaacct ctttcagatt 1341aagctgaaca gttacaagat ggctggcatc cctctccttt ctccccatat gcaatttgct 1401taatgtaacc tcttcttttg ccatgtttcc attctgccat cttgaattgt cttgtcagcc 1461aattcattat ctattaaaca ctaatttgag 1491<210>2<211>288<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><223>-34到-12位的信號(hào)序列可溶性蛋白的氨基末端測(cè)序<220><223>1到208位的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域；與已知序列的類(lèi)似性<220><223>209到235位的跨膜結(jié)構(gòu)域；與已知序列的類(lèi)似性<220><223>236到254位的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；與已知序列的類(lèi)似性<220><223>19-21，55-57，64-66，152-154，173-175，177-179，192-194，198-200位的N連接的糖基化，與已知序列的類(lèi)似性<220><223>1到104位的Ig V-set結(jié)構(gòu)域；與已知序列的類(lèi)似性<220><223>105到202位的Ig C-set結(jié)構(gòu)域；與已知序列的類(lèi)似性<400>2Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr-30 -25 -20Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys-15 -10 -5Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu-1 1 5 10Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile15 20 25 30Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp35 40 45Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr50 55 60Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly65 70 75Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg80 85 90Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr95 100 105 110Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile115 120 125Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu130 135 140Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp145 150 155Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met160 165 170Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg175 180 185 190Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro195 200 205Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly210 215 220Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg225 230 235Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val240 245 250<210>3<211>1120<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(107)..(1093)<400>3cacagggtga aagctttgct tctctgctgc tgtaacaggg actagcacag acacacggat 60gagtggggtc atttccagat attaggtcac agcagaagca gccaaa atg gat ccc 115Met Asp Pro1cag tgc act atg gga ctg agt aac att ctc ttt gtg atg gcc ttc ctg163Gln Cys Thr Met Gly Leu Ser Asn Ile Leu Phe Val Met Ala Phe Leu5 10 15ctc tct ggt gct gct cct ctg aag att caa gct tat ttc aat gag act211Leu Ser Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr20 25 30 35gca gac ctg cca tgc caa ttt gca aac tct caa aac caa agc ctg agt259Ala Asp Leu Pro Cys Gln Phe Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser40 45 50gag cta gta gta ttt tgg cag gac cag gaa aac ttg gtt ctg aat gag307Glu Leu Val Val Phe Trp Gln Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu55 60 65gta tac tta ggc aaa gag aaa ttt gac agt gtt cat tcc aag tat atg355Val Tyr Leu Gly Lys Glu Lys Phe Asp Ser Val His Ser Lys Tyr Met70 75 80ggc cgc aca agt ttt gat tcg gac agt tgg acc ctg aga ctt cac aat403Gly Arg Thr Ser Phe Asp Ser Asp Ser Trp Thr Leu Arg Leu His Asn85 90 95ctt cag atc aag gac aag ggc ttg tat caa tgt atc atc cat cac aaa451Leu Gln Ile Lys Asp Lys Gly Leu Tyr Gln Cys Ile Ile His His Lys100 105 110 115aag ccc aca gga atg att cgc atc cac cag atg aat tct gaa ctg tca499Lys Pro Thr Gly Met Ile Arg Ile His Gln Met Asn Ser Glu Leu Ser120 125 130gtg ctt gct aac ttc agt caa cct gaa ata gta cca att tct aat ata547Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Asn Ile135 140 145aca gaa aat gtg tac ata aat ttg acc tgc tca tct ata cac ggt tac595Thr Glu Asn Val Tyr Ile Asn Leu Thr Cys Ser Ser Ile His Gly Tyr150 155 160cca gaa cct aag aag atg agt gtt ttg cta aga acc aag aat tca act643Pro Glu Pro Lys Lys Met Ser Val Leu Leu Arg Thr Lys Asn Ser Thr165 170 175atc gag tat gat ggt att atg cag aaa tct caa gat aat gtc aca gaa691Ile Glu Tyr Asp Gly Ile Met Gln Lys Ser Gln Asp Asn Val Thr Glu180 185 190 195ctg tac gac gtt tcc atc agc ttg tct gtt tca ttc cct gat gtt acg739Leu Tyr Asp Val Ser Ile Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Asp Val Thr200 205 210agc aat atg acc atc ttc tgt att ctg gaa act gac aag acg cgg ctt787Ser Asn Met Thr Ile Phe Cys Ile Leu Glu Thr Asp Lys Thr Arg Leu215 220 225tta tct tca cct ttc tct ata gag ctt gag gac cct cag cct ccc cca835Leu Ser Ser Pro Phe Ser Ile Glu Leu Glu Asp Pro Gln Pro Pro Pro230 235 240gac cac att cct tgg att aca gct gta ctt cca aca gtt att ata tgt883Asp His Ile Pro Trp Ile Thr Ala Val Leu Pro Thr Val Ile Ile Cys245 250 255gtg atg gtt ttc tgt cta att cta tgg aaa tgg aag aag aag aag cgg931Val Met Val Phe Cys Leu Ile Leu Trp Lys Trp Lys Lys Lys 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Gln Arg Val Phe Lys Ser Ser Lys Thr Ser305 310 315320Ser Cys Asp Lys Ser Asp Thr Cys Phe325<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽<400>5Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val1 5<210>6<211>23<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽<400>6Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu Arg Met Val Leu Ser Ala1 5 10 15Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys20<210>7<211>24<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述肽<400>7Phe Trp Arg Gly Glu Asn Gly Arg Lys Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg1 5 10 15Met Cys Asn Ile Leu Lys Gly Lys20
權(quán)利要求
1.預(yù)防性增強(qiáng)受治療者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括將包含共同刺激分子細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性組合物給藥，以便增強(qiáng)受治療者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
2.治療性增強(qiáng)受治療者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，包括將包含共同刺激分子細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性組合物給藥，以便增強(qiáng)受治療者對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中該共同刺激分子選自由B7-1和B7-2組成的組。
4.增強(qiáng)受治療者對(duì)I類(lèi)限制抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括將包含I類(lèi)限制抗原或其片段的第一種藥物和包含B7分子細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性組合物給藥，以便一旦對(duì)受治療者給藥，即增強(qiáng)對(duì)I類(lèi)限制抗原的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
5.權(quán)利要求4的方法，進(jìn)一步包括將II類(lèi)限制抗原對(duì)受治療者給藥。
6.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將佐劑對(duì)受治療者給藥。
7.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該B7分子是B7-1分子。
8.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該B7分子是B7-2分子。
9.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該共同刺激分子是單特異性的。
10.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該共同刺激分子是二聚體和二價(jià)的。
11.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該可溶性共同刺激分子是單特異性的和二聚體和二價(jià)的。
12.權(quán)利要求11的方法，其中B7分子細(xì)胞外部分是與包含免疫球蛋白分子一部分的第二種蛋白質(zhì)或多肽融合的。
13.權(quán)利要求12的方法，其中該免疫球蛋白分子的該部分包含半胱氨酸殘基。
14.權(quán)利要求12的方法，其中該免疫球蛋白分子的該部分包含人免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。
15.權(quán)利要求12的方法，其中該免疫球蛋白分子的該部分包含人免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH1、CH2和CH3區(qū)。
16.權(quán)利要求12的方法，其中該免疫球蛋白分子已經(jīng)經(jīng)過(guò)修飾，減少了補(bǔ)體固定和/或Fc受體結(jié)合。
17.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該抗原是腫瘤細(xì)胞抗原。
18.權(quán)利要求2的方法，其中該受治療者患有選自下組類(lèi)型的癌癥結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肥大細(xì)胞瘤、肉瘤和膀胱癌。
19.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該抗原選自由細(xì)菌抗原、病毒抗原和寄生物抗原組成的組。
20.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該免疫應(yīng)答是細(xì)胞免疫應(yīng)答。
21.權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)的方法，其中該免疫應(yīng)答是體液免疫應(yīng)答。
全文摘要
提供了增強(qiáng)免疫應(yīng)答的方法,其中將共同刺激分子、例如B7分子的可溶形式給藥,以增加對(duì)抗原、例如腫瘤細(xì)胞和感染性試劑的免疫應(yīng)答。該方法可用于受治療者的預(yù)防性和治療性免疫作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1377279SQ00810038
公開(kāi)日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2000年5月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月6日
發(fā)明者K·斯圖爾姆赫菲, S·F·沃爾夫, M·奧托勒 申請(qǐng)人:遺傳研究所有限公司