提高蛋白質(zhì)可溶性的肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明系關(guān)于一種由SEQ?ID?NO:1所示之氨基酸序列組成之肽片段。本發(fā)明亦關(guān)于一種使用由SEQ?ID?NO:1所示之氨基酸序列組成之肽以增加目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量的方法，包含(a)融合該肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)以形成一重組蛋白；及(b)藉由一表達(dá)宿主生產(chǎn)該重組蛋白。
【專利說(shuō)明】提高蛋白質(zhì)可溶性的肽及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人工肽及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002]大部份具有潛在臨床或工業(yè)價(jià)值的蛋白質(zhì)之供給往往受限于其低自然可得性。隨著現(xiàn)代基因體學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的進(jìn)步，使用重組技術(shù)產(chǎn)出的蛋白質(zhì)似乎可保證無(wú)限供應(yīng)重組蛋白。然而，異源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)仍然是蛋白生產(chǎn)的一個(gè)嚴(yán)重瓶頸。在大腸桿菌中克隆(clone)基因的過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)不可溶凝集的形成，其在光學(xué)顯微鏡下清晰可見(jiàn)。一些與宿主細(xì)胞、生長(zhǎng)條件和該特定蛋白質(zhì)性質(zhì)有關(guān)的參數(shù)都有可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的可溶性。因此，能夠增強(qiáng)蛋白質(zhì)表達(dá)且同時(shí)能簡(jiǎn)化純化過(guò)程的新技術(shù)對(duì)于需要大規(guī)模產(chǎn)量的蛋白質(zhì)非常重要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]利用親和性標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白融合可增加蛋白質(zhì)表達(dá)量并提升蛋白質(zhì)純化效率，可克服低表達(dá)障礙。
[0004]本發(fā)明設(shè)計(jì)一肽片段以增加一目標(biāo)融合蛋白之可溶性。該肽之氨基酸序列實(shí)例包括但不限于SEQ ID NO:1。
[0005]由臺(tái)灣三棘當(dāng)(Tachypleus tridentatus)血衆(zhòng)中分離所得之當(dāng)細(xì)菌辨識(shí)凝集素(bacteria recognizing lectin, BRL)為一種脂多糖結(jié)合蛋白質(zhì)。細(xì)菌辨識(shí)凝集素之氨基酸序列實(shí)例包括但不限于SEQ ID N0:2。
[0006]人類嗜酸性白血球核糖核酸酶(human eosinophil ribonuclease)屬于核糖核酸酶A超家族，由嗜酸性白血球在發(fā)炎期間大量分泌。靈長(zhǎng)類動(dòng)物嗜酸性白血球核糖核酸酶序列系取自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)并與人類的嗜酸性白血球核糖核酸酶比對(duì)(圖4)。人類嗜酸性白血球核糖核酸酶與靈長(zhǎng)類動(dòng)物嗜酸性白血球核糖核酸酶有高度相似(序列相同度高于86% )。人類嗜酸性白血球核糖核酸酶系由133個(gè)氨基酸組成，其等電點(diǎn)(isoelectricpoint)為10.8。人類嗜酸性白血球核糖核酸酶之氨基酸序列實(shí)例包括但不限于 SEQ ID NO:9。
[0007]本發(fā)明已在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中創(chuàng)造一種新穎重組蛋白:重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素(rBRL)，其包含氨基端39個(gè)氨基酸之肽片段及羥基端128個(gè)氨基酸之細(xì)菌辨識(shí)凝集素，例如SEQ ID NO: 3。在SEQ ID NO: 3中第I個(gè)氨基酸(M)及第41到第42個(gè)氨基酸(EF)是從pET23a載體獲得之殘基且可于使用不同載體時(shí)被替換，甚至于本發(fā)明之一實(shí)施方案中可不存在。此外，在SEQ ID NO: 3末端的6個(gè)殘基(HHHHHH)可作用為純化標(biāo)簽且可以任何具相似功能的其它序列將其替換，甚至于本發(fā)明之一實(shí)施方案中可不存在。根據(jù)以上所述，應(yīng)注意到本發(fā)明也提供一種由氨基酸序列SEQ ID NO:4組成之重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素。
[0008]本發(fā)明也已在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中創(chuàng)造出一種新穎重組蛋白:重組嗜酸性白血球核糖核酸酶(reRNase)，其包含氨基端39個(gè)氨基酸之肽片段及羥基端133個(gè)氨基酸之人類嗜酸性白血球核糖核酸酶，例如SEQ ID NO: 10。在SEQ ID NO: 10中第I個(gè)氨基酸(M)及第41到第42個(gè)氨基酸(EF)是從pET23a載體中獲得之殘基且可于使用不同載體時(shí)被替換，甚至于本發(fā)明之一實(shí)施方案中可不存在。此外，在SEQ ID NO: 10末端6個(gè)殘基(HHHHHH)可作用為純化標(biāo)簽且可以任何具相似功能的其它序列將其替換，甚至于本發(fā)明之一實(shí)施方案中可不存在。根據(jù)以上所述，應(yīng)注意到本發(fā)明也提供一種由氨基酸序列SEQ ID NO: 11所組成之重組嗜酸性白血球核糖核酸酶。
[0009]本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解到，任何以上氨基酸序列具相似功能的突變體都包含在本發(fā)明之范疇中。
[0010]添加人工肽SEQ ID NO:1可成功增加細(xì)菌辨識(shí)凝集素或嗜酸性白血球核糖核酸酶的表達(dá)并簡(jiǎn)化純化步驟。
[0011]除非另外特別加以定義，于此敘述中所用的名詞將具有本領(lǐng)域技術(shù)人員可了解之普通且常見(jiàn)之含意。
[0012]因此，本發(fā)明提供一種由SEQ ID NO:1所示之氨基酸序列組成之肽片段。本發(fā)明亦提供一種使用由SEQ ID NO:1所示之氨基酸序列組成之肽以增加目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量的方法，包含(a)融合該肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)以形成一重組蛋白 '及(b)藉由一表達(dá)宿主生產(chǎn)該重組蛋白。較佳地，該目標(biāo)蛋白質(zhì)為糖類結(jié)合蛋白；更佳地，該目標(biāo)蛋白質(zhì)為脊椎動(dòng)物血漿凝集素或脊椎動(dòng)物核糖核酸酶；再更佳地，該目標(biāo)蛋白質(zhì)為細(xì)菌辨識(shí)凝集素或靈長(zhǎng)類動(dòng)物的嗜酸性白血球核糖核酸酶；再更佳地,該目標(biāo)蛋白質(zhì)為人類嗜酸性白血球核糖核酸酶。在一實(shí)施例中，該表達(dá)宿主為細(xì)菌、酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳類動(dòng)物細(xì)胞；更佳地，該細(xì)菌系大腸桿菌。該方法不僅簡(jiǎn)化目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化步驟，更在融合該肽至目標(biāo)蛋白質(zhì)后保留目標(biāo)蛋白質(zhì)的生物活性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1顯示重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素(rBRL)純化及特性判定。
[0014]以0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于16 °C培養(yǎng)16小時(shí)后，離心收集含有重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素的細(xì)菌溶解物上清液，并置于鎳離子固定化親和性層析管柱加以純化。將每一樣品之等分試樣以15% (w/v)之十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。
[0015]M道:分子量標(biāo)記物#道:未經(jīng)異丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)之大腸桿菌細(xì)菌溶解物道:經(jīng)異丙基-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)之大腸桿菌細(xì)菌溶解物；Ρ道:細(xì)菌均質(zhì)化后不可溶之沉淀物；S道:細(xì)菌均質(zhì)化后之上清液；F道:純化后流出之上清液；W1道:含20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、200mM氯化鈉、5mM咪唑清洗管柱之流出夜；W2道:含20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、50mM咪唑清洗管柱之流出液；E道:含20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、300mM咪唑洗提的純化蛋白質(zhì)；(:道:濃縮后的純化蛋白質(zhì)。
[0016]圖2顯示重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素(N7)及重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素(C7)的少量表達(dá)。
[0017]將0.1mM異丙基-β _D_硫代半乳糖苷(IPTG)加入培養(yǎng)物并于16°C培養(yǎng)16小時(shí)以誘導(dǎo)(A)重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素(N7)及(B)重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素(C7)的表達(dá)。以15%(w/v)之SDS-PAGE將每一樣品之等分試樣分離并以考馬思亮藍(lán)(Coomassie blue)染色。
[0018]M道:分子量標(biāo)記物#道:未經(jīng)異丙基_β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)之大腸桿菌細(xì)菌溶解物；1道:經(jīng)異丙基_β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)之大腸桿菌細(xì)菌溶解物；Ρ道:細(xì)菌均質(zhì)化后不可溶之沉淀物^道:細(xì)菌均質(zhì)化后之上清液。
[0019]圖3顯示重組人類嗜酸性白血球核糖核酸酶(reRNase)的純化及特性判定。
[0020]以0.1mM異丙基-D-硫代半乳糖苷于16°C培養(yǎng)16小時(shí)后，經(jīng)由離心收集含有重組人類嗜酸性白血球核糖核酸酶的細(xì)胞溶解物上清液并置于肝素(Heparin)結(jié)合層析管柱純化。將每一樣品之等分試樣以15% (w/v)之十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加以分析。
[0021]圖3A中M道:分子量標(biāo)記物；N道:未經(jīng)異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)之大腸桿菌細(xì)菌溶解物；1道:經(jīng)異丙基-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)之大腸桿菌細(xì)菌溶解物；Ρ道:細(xì)菌均質(zhì)化后不可溶之沉淀物；S道:細(xì)菌均質(zhì)化后之上清液；F道:純化后流出之上清液；W道:含1mM磷酸鈉緩沖液、ImM乙二胺四乙酸(EDTA)清洗管柱之流出夜；E1~E4道:含1mM磷酸鈉緩沖液、ImM EDTA、0_2M氯化鈉洗提純化蛋白質(zhì)。
[0022]圖3B顯示RNase3少量表達(dá)結(jié)果。在沒(méi)有人工肽的情況,重組人類嗜酸性白血球核糖核酸酶經(jīng)0.1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷于16°C誘導(dǎo)16小時(shí)后主要存在于不可溶之沉淀物。
[0023]圖4顯示來(lái)自不同靈長(zhǎng)類六種成熟嗜酸性白血球核糖核酸酶序列的一級(jí)序列比對(duì)，分別來(lái)自智人(Homo spaiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、大猩猩(Gorillagorilla)、長(zhǎng)尾稱猴(Macaca fascicularis)、豬尾稱猴(Macaca nemestrina)及紅毛猩猩(Pongo pygmaeus)。
[0024]靈長(zhǎng)類動(dòng)物嗜酸性白血球核糖核酸酶序列系取自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。使用ClustalX2進(jìn)行序列比對(duì)。完全保留氨基酸以星號(hào)(*)表示，高度相似氨基酸以冒號(hào)(:)表示，低度相似氨基酸則以點(diǎn)(.)表示。eRNase_HUMAN意指人類嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQID NO:9) ;eRNase_PANTR意指黑猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO: 14) ；eRNase_G0RG0意指大猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO: 15) ;eRNase_MACFA意指長(zhǎng)尾獼猴嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO: 16) ;eRNase_MACNE意指豬尾獼猴嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID NO: 17) ;eRNase_P0NPY則意指紅毛猩猩嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ IDNO:18)。

【具體實(shí)施方式】
[0025]本發(fā)明可能以不同的形式實(shí)施，并不僅限于下列文中所提及的實(shí)例。下列實(shí)施例僅作為本發(fā)明不同面向及特點(diǎn)中的代表。
[0026]實(shí)施例1:
[0027]材料與方法
[0028]試劑
[0029]使用大腸桿菌ToplOF’(Invitrogen)來(lái)建立載體并操作DNA,使用大腸桿菌表達(dá)型Rosetta (DE3) (Stratagene)、購(gòu)于Novagen之pET23a載體表達(dá)蛋白質(zhì)。所有其余緩沖液及試劑均為最高之商業(yè)純度。
[0030]蛋白質(zhì)表達(dá)及純化
[0031]用引物5’Nde1-ANP(SEQ ID NO:5)及 3’EcoR1-ANP(SEQ ID NO:6)以聚合酶鏈鎖反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增編碼SEQ ID NO:1之DNA片段。編碼重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素(SEQ IDNO: 2)之DNA片段系用來(lái)自三棘鱟RNA所反轉(zhuǎn)錄之cDNA以聚合酶鏈鎖反應(yīng)擴(kuò)增并使用引物5’EcoR1-BRL (SEQ ID NO: 7)及 3’Not1-BRL_6His (SEQ ID NO: 8) ? 將兩種純化過(guò)之聚合酶鏈鎖反應(yīng)產(chǎn)物分別以Nde I /EcoRI及EcoRI/Not I限制酶切，并接上用相同限制酶處理過(guò)的pET23a載體。
[0032]確定該重組質(zhì)粒序列后，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ToplOF’并以含100μ g/ml胺芐青霉素(Ampicillin)的瓊脂平板篩選。將篩選盤上所挑起的單一菌落置于含有相同濃度抗生素的5毫升LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)液(I %胰化蛋白、0.5%酵母菌提取物及0.5%氯化鈉)在37°C使其生長(zhǎng)一夜以備提取質(zhì)粒。再將提取出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)型Rosetta(DE3)，并以含100 μ g/ml胺芐青霉素的瓊脂平板篩選。將單一菌落挑起并置于I公升之LB培養(yǎng)液中在37°C使其生長(zhǎng)直至600nm波長(zhǎng)處的吸光值(0D_)達(dá)到0.4至0.6。加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷至最終濃度0.1mM并于16°C培養(yǎng)16小時(shí)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在4°C以4000x g離心10分鐘收集細(xì)胞，并以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一次。接著，使細(xì)胞沉淀物懸浮于50mL添加有蛋白酶抑制劑(ImM苯甲基磺酰氟(PMSF))的50mL平衡緩沖液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、5mM咪唑、pH值為7.4)并于每平方英寸15000磅之壓力下通過(guò)細(xì)胞均質(zhì)機(jī)(cell homogenizer) 3次使其破碎。在4°C以16000xg離心30分鐘使細(xì)菌溶解物分成上清液及沉淀物。用Ni Sepharose?6Fast Flow (GEhealthcare)層析管柱將上清液純化。先用平衡緩沖液將管柱預(yù)先平衡并于加載樣本,結(jié)束時(shí)以50mL平衡緩沖液(Wl)及50mL清洗緩沖液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、50mM咪唑、pH值為7.4) (W2)清洗。用洗提緩沖液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、300mM咪唑、pH值為7.4)將管柱上之目標(biāo)蛋白質(zhì)洗脫及回收。最后將洗脫之重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素濃縮并將緩沖液換成Tris緩沖液(20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、200mM氯化鈉、pH值為7.4)。
[0033]結(jié)果
[0034] 重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素的表達(dá)與純化
[0035]重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素系由氨基端的人工肽及羥基端的三棘鱟所衍生之鱟細(xì)菌辨識(shí)凝集素所組成。編碼人工肽及細(xì)菌辨識(shí)凝集素之DNA片段個(gè)別連接至pET23a載體且該重組質(zhì)粒系被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)以表達(dá)蛋白質(zhì)。自I公升之培養(yǎng)液中，可使用鎳離子固定化親和性層析管柱獲得約6mg純化之重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素，其回收率為80.6%(圖1)。已達(dá)到產(chǎn)量比嗜甲醇酵母菌所生產(chǎn)之BRL-6His高5倍之重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素，表示融合于細(xì)菌辨識(shí)凝集素氨基端之肽片段成功促進(jìn)重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素生產(chǎn)并分離。為了進(jìn)一步探究該肽在表達(dá)細(xì)菌辨識(shí)凝集素中的重要性，由該肽序列中最前面7個(gè)氨基酸組成較短肽及由該肽中最后面7個(gè)氨基酸組成較短肽被分別融合在細(xì)菌辨識(shí)凝集素的氨基端及羥基端(分別為rBRL (N7)及rBRL (C7))。表達(dá)狀態(tài)顯示與該2個(gè)肽融合之細(xì)菌辨識(shí)凝集素均被表達(dá)于包涵體(inclus1n body)部分內(nèi)，顯示全長(zhǎng)之該肽片段在表達(dá)重組細(xì)菌辨識(shí)凝集素中扮演重要角色(圖2A及圖2B，P道)。
[0036]實(shí)施例2:
[0037]材料與方法
[0038]試劑
[0039]使用大腸桿菌ToplOF’(Invitrogen)建立載體并操作DNA,使用大腸桿菌表達(dá)型Rosetta (DE3) (Stratagene)、購(gòu)于Novagen之pET23a載體表達(dá)蛋白質(zhì)。所有其余緩沖液及試劑均為最高之商業(yè)純度。
[0040]蛋白質(zhì)表達(dá)及純化
[0041]用引物5’Nde1-ANP(SEQ ID NO:5)及 3’EcoR1-ANP(SEQ ID NO:6)以聚合酶鏈鎖反應(yīng)(PCR)將編碼SEQ ID NO:1之DNA片段擴(kuò)增。編碼人類嗜酸性白血球核糖核酸酶(SEQ ID N0:9)之DNA片段系用來(lái)自氣喘病患RNA所反轉(zhuǎn)錄之cDNA擴(kuò)增。使用PCR引物5’EcoR1-RNase (SEQ ID NO: 12)及 3’BamH1-RNase_6His (SEQ ID NO: 13)擴(kuò)增人類嗜酸性白血球核糖核酸酶。將編碼SEQ ID NO:1及人類嗜酸性白血球核糖核酸酶之聚合酶鏈鎖反應(yīng)產(chǎn)物分別用Nde I /EcoRI及EcoRI/BamHI限制酶切，并接上用相同限制酶處理過(guò)的pET23a。
[0042]以測(cè)序法確定該重組質(zhì)粒，接著將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ToplOF’并以含100μ g/ml胺芐青霉素(Ampicillin)的瓊脂平板篩選。將篩選盤上所挑起的單一菌落置于含有相同濃度抗生素的5毫升LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)液(I %胰化蛋白、0.5 %酵母菌提取物及
0.5%氯化鈉)中在37°C使其生長(zhǎng)一夜以備提取質(zhì)粒。再將提取出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)型Rosetta(DE3)并以含100 μ g/ml胺芐青霉素的瓊脂平板篩選。將單一菌落挑起并置于I公升之LB培養(yǎng)液中在37°C使其生長(zhǎng)直到600nm波長(zhǎng)處的吸光值(0D600)達(dá)到0.4至0.6。加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷使其最終濃度為0.1mM并于16°C培養(yǎng)16小時(shí)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在4 °C以4000xg離心10分鐘以收集細(xì)胞，并以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一次。接著，使細(xì)胞沉淀物懸浮于添加有蛋白酶抑制劑(ImM苯甲基磺酰氟(PMSF))的緩沖液A (1mM磷酸鈉緩沖液、ImM EDTA, pH值為7.0)并于每平方英寸15000磅之壓力下通過(guò)細(xì)胞均質(zhì)機(jī)5次以將其破碎。均質(zhì)后，將該細(xì)菌溶解物在4°C以16000xg離心30分鐘移除細(xì)胞碎片。將上清液中的蛋白以每分鐘2mL的流速裝載入FPLC系統(tǒng)(GE Health)中5mLHiTrap Heparin HP管柱。以緩沖液A清洗直到在280nm波長(zhǎng)處的吸光值(0D280)達(dá)到基線。接著將蛋白質(zhì)以線性NaCl濃度梯度(O - 2M NaCl)洗提。將每一樣品以15% (w/v)之十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)加以分析。
[0043]結(jié)果
[0044]重組嗜酸性白血球核糖核酸酶的表達(dá)與純化
[0045]重組嗜酸性白血球核糖核酸酶系由氨基端人工肽及羥基端人類嗜酸性白血球核糖核酸酶所組成。編碼人工肽及人類嗜酸性白血球核糖核酸酶之DNA片段個(gè)別連接至pET23a載體且該重組質(zhì)粒系被轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)中表達(dá)蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示預(yù)期分子量為20.5kDa的重組嗜酸性白血球核糖核酸酶成功于大腸桿菌BL21Rosetta(DE3)表達(dá)，且大部分目標(biāo)蛋白質(zhì)系存在于上清液分層中(圖3A，S道)。接著將上清液分層中可溶性重組嗜酸性白血球核糖核酸酶以FPLC系統(tǒng)的HiTrap Heparin HP管柱純化。圖3A(E1道及E2道)顯示重組嗜酸性白血球核糖核酸酶可以透過(guò)NaCl梯度成功洗脫。另一方面，未融合肽片段的人類嗜酸性白血球核糖核酸酶的表達(dá)(圖3B)主要存在于包涵體(沉淀部分)內(nèi)，如同前案中所述。
[0046]本領(lǐng)域技術(shù)人員能很快體會(huì)到本發(fā)明可很容易達(dá)成目標(biāo)，并獲得所提到之結(jié)果及優(yōu)點(diǎn)，以及那些存在于其中的東西。本發(fā)明中之肽、重組蛋白、其制造程序與方法及其用途乃較佳實(shí)施例的代表，其為示范性且不僅局限于本發(fā)明領(lǐng)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到其中可修改之處及其它用途。這些修改都蘊(yùn)含在本發(fā)明的精神中，并在申請(qǐng)專利范圍中界定。
[0047]本發(fā)明的內(nèi)容敘述與實(shí)施例均揭示詳細(xì)，得使任何熟習(xí)此技藝者能夠制造及使用本發(fā)明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進(jìn)步之處，仍應(yīng)視為不脫離本發(fā)明之精神及范圍。
[0048]說(shuō)明書(shū)中提及之所有專利及出版品，都以和發(fā)明有關(guān)領(lǐng)域之一般技藝為準(zhǔn)。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個(gè)個(gè)別出版品都被具體且個(gè)別地指出納入?yún)⒖肌?br> [0049] 在此所適當(dāng)?shù)嘏e例說(shuō)明之發(fā)明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或并非特定為本文中所揭示的限制情況下實(shí)施。所使用的名詞及表達(dá)是作為說(shuō)明書(shū)之描述而非限制，同時(shí)并無(wú)意圖使用這類排除任何等同于所示及說(shuō)明之特點(diǎn)或其部份之名詞及表達(dá)，但需認(rèn)清的是，在本發(fā)明的專利申請(qǐng)范圍內(nèi)有可能出現(xiàn)各種不同的改變。因此，應(yīng)了解到雖然已根據(jù)較佳實(shí)施例及任意的特點(diǎn)來(lái)具體揭示本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員仍會(huì)修改和改變其中所揭示的內(nèi)容，諸如此類的修改和變化仍在本發(fā)明之申請(qǐng)專利范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的肽片段。
2.一種使用如權(quán)利要求1所述的肽以增加目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量的方法，包含(a)融合所述肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)以形成重組蛋白 '及(b)通過(guò)表達(dá)宿主生產(chǎn)所述重組蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)為糖類結(jié)合蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)為脊椎動(dòng)物血漿凝集素或脊椎動(dòng)物核糖核酸酶。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)為細(xì)菌辨識(shí)凝集素或靈長(zhǎng)類動(dòng)物嗜酸性白血球核糖核酸酶。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)為人類嗜酸性白血球核糖核酸酶。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述表達(dá)宿主為細(xì)菌、酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞或哺乳類動(dòng)物細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)菌為大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步簡(jiǎn)化所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化步驟。
10.如權(quán)利要求2項(xiàng)所述的方法，其在融合所述肽至所述目標(biāo)蛋白質(zhì)后保留所述目標(biāo)蛋白質(zhì)的活性。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK104163856SQ201410204226
【公開(kāi)日】2014年11月26日 申請(qǐng)日期:2014年5月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月15日
【發(fā)明者】張大慈 申請(qǐng)人:張大慈