專利名稱：可溶性ctla4突變體分子及其應(yīng)用的制作方法
在本申請中引用了各種出版物。這些出版物的公開內(nèi)容全部通過引用結(jié)合到本申請中，以便更全面地描述本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)。
在無共同刺激時的T細胞激活導(dǎo)致失敗的或無反應(yīng)性T細胞應(yīng)答(Schwartz，R.H.(1992)Cell711065-1068)。一種關(guān)鍵的共同刺激信號通過T細胞表面受體CD28與抗原呈遞細胞上B7相關(guān)分子(例如也分別稱為B7-1和B7-2，或CD80和CD86)之間的相互作用來提供(P.Linsley和J.Ledbetter(1993)Annu.Rev.Immunol.11191-212)。
現(xiàn)在稱為CD80(B7-1)的分子最初被描述為人B細胞相關(guān)激活抗原(Yokochi，T.等(1981)J.Immunol.128823-827；Freeman，G.J.等(1989)J.Immunol.1432714-2722)，隨后被鑒定為相關(guān)T細胞分子CD28和CTLA4的反受體(Linsley，P.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA875031-5035；Linsley，P.S.等(1991a)J.Exp.Med.173721-730；Linsley，P.S.等(1991b)J.Exp.Med.174561-570)。
最近，在抗原呈遞細胞上鑒定出CTLA4的另一種反受體(Azuma，N.等，(1993)Nature36676-79；Freeman(1993a)Science262909-911；Freeman，G.J.等，(1993b)J.Exp.Med.1782185-2192；Hathcock，K.L.S.等(1994)J.Exp.Med.180631-640；Lenschow，D.J.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011054-11058；Ravi-Wolf，Z.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011182-11 186；Wu，Y.等，(1993)J.Exp.Med.1781789-1793)?，F(xiàn)在稱為CD86(Caux，C.等，(1994)J.Exp.Med.1801841-1848)、但也稱為B7-0(Azuma等，(1993)，參見上文)或B7-2(Freeman等，(1993a)，參見上文)的這種分子在其胞外區(qū)中與CD80享有約25％的序列同一性(Azuma等，(1993)，參見上文；Freeman等，(1993a)，參見上文，(1993b)，參見上文)。CD86轉(zhuǎn)染的細胞觸發(fā)CD28介導(dǎo)的T細胞應(yīng)答(Azuma等，(1993)，參見上文；Freeman等，(1993a)，(1993b)，參見上文)。
CD80和CD86表達的比較一直是幾項研究的主題(Azuma等，(1993)，參見上文；Hathcock等，(1994)，參見上文；Larsen，C.P.等(1994)J.Immunol.1525208-5219；Stack，R.M.等，(1994)J.Immunol.1525723-5733)。目前的資料表明，CD80和CD86表達的調(diào)節(jié)不同，提示在免疫應(yīng)答期間CD86的表達往往先于CD80的表達。
通過將CD28和CTLA4的可變(v)樣胞外結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白(Ig)的恒定區(qū)融合，產(chǎn)生CD28Ig和CTLA4Ig，構(gòu)建了可溶形式的CD28和CTLA4。CTLA4Ig比CD28Ig更強地結(jié)合CD80陽性細胞和CD86陽性細胞(Linsley，P.等(1994)Immunity1793-80)。許多T細胞依賴性免疫應(yīng)答在體外和體內(nèi)都被CTLA4Ig阻斷(Linsley等，(1991b)，參見上文；Linsley，P.S.等，1992a)Science257792-795；Linsley等，P.S.等，(1992b)J.Exp.Med.1761595-1604；Lenschow，D.J.等，(1992)，Science257789-792；Tan，P.等，(1992)，J.Exp.Med.177165-173；Turka，L.A.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8911102-11105)。
Peach等(J.Exp.Med.(1994)1802049-2058)在CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域中鑒定出對于與CD80強結(jié)合重要的多個區(qū)。具體地說，在互補性決定區(qū)3(CDR3)樣區(qū)中的六肽基序(MYPPPY)被鑒定為在所有的CD28和CTLA4家族成員中完全保守。通過CTLA4中的MYPPPY基序和CD28Ig中的選定殘基的丙氨酸掃描誘變，降低或消除了與CD80的結(jié)合。
也構(gòu)建了CTLA4和CD28同源區(qū)互換的嵌合分子。通過將CTLA4的CDR3樣區(qū)移植到CD28Ig上，所述CDR3樣區(qū)也包括一個羧基末端被延伸以包括某些非保守氨基酸殘基的部分，構(gòu)建了分子HS4、HS4-A和HS4-B。這些同源突變體顯示出對CD80的結(jié)合親和力高于CD28Ig對CD80的的結(jié)合親和力。
在另一組嵌合同源突變體中，將在CD28中不保守并且預(yù)測在空間上與CDR3樣區(qū)相鄰的CTLA4的CDR1樣區(qū)，移植到HS4和HS4-A中。這些嵌合同源突變體分子(命名為HS7和HS8)表現(xiàn)出對CD80的結(jié)合親和力甚至高于CD28Ig。
通過將CTLA4的CDR2樣區(qū)移植到HS7和HS8中，也制備了嵌合同源突變體分子，但這種組合沒有進一步改進對CD80的結(jié)合親和力。因此，確定CTLA4和CD28的MYPPPY基序?qū)τ谂cCD80的結(jié)合是重要的，但CTLA4的CDR1樣區(qū)和CDR3樣區(qū)中的某些非保守氨基酸殘基也對CTLA4與CD80結(jié)合親和力的增強產(chǎn)生影響。
表明CTLA4Ig有效阻斷CD80相關(guān)的T細胞共同刺激，但不如阻斷CD86相關(guān)應(yīng)答時有效。構(gòu)建了可溶性CTLA4突變體分子、尤其是對CD86的親和力高于野生型CTLA4的那些分子，因為它們可能能夠比CTLA4Ig更好地阻斷抗原特異性活化細胞的引發(fā)(priming)。
仍需要改進的CTLA4分子，以提供比先前已知的可溶形式CTLA4更好的用于免疫抑制和癌癥治療的藥用組合物。
CTLA4突變體分子的一個實例是本文所述的L104EA29YIg(圖7)。CTLA4突變體分子的另一個實例是本文所述的L104EIg(圖8)。L104EA29YIg和L104EIg結(jié)合CD80和CD86的親和力高于CTLA4Ig。
圖2A和2B說明了得自FACS測定的數(shù)據(jù)，顯示了L104EA29YIg、L104EIg和CTLA4Ig與人CD80或CD86轉(zhuǎn)染的CHO細胞的結(jié)合，如下文實施例2中所述。
圖3A和3B描繪了CD80陽性和CD86陽性CHO細胞增殖的抑制，如下文實施例2中所述。
圖4A和4B顯示了L104EA29YIg在抑制經(jīng)初次和二次同種刺激的(allostimulated)T細胞的增殖方面比CTLA4Ig更為有效，如下文實施例2中所述。
圖5A-C說明L104EA29YIg在抑制經(jīng)同種刺激的人T細胞產(chǎn)生細胞因子IL-2(圖5A)、IL-4(圖5B)和γ-干擾素(圖5C)方面比CTLA4Ig更為有效，如下文實施例2中所述。
圖6證明L104EA29YIg在抑制經(jīng)植物凝集素(PHA)刺激的猴T細胞增殖方面比CTLA4Ig更為有效，如下文實施例2中所述。
圖7描繪了CTLA4突變體分子(L104EA29YIg)的核苷酸序列和氨基酸序列，L104EA29YIg包含一個信號肽；一個CTLA4的突變型胞外結(jié)構(gòu)域，始于位置+1的甲硫氨酸且終止于位置+124的天冬氨酸，或始于位置-1的丙氨酸且終止于位置+124的天冬氨酸；和一個Ig區(qū)，如下文實施例1中所述。
圖8描繪了CTLA4突變體分子(L104EIg)的核苷酸序列和氨基酸序列，L104EIg包含一個信號肽；一個CTLA4的突變型胞外結(jié)構(gòu)域，始于位置+1的甲硫氨酸且終止于位置+124的天冬氨酸，或始于位置-1的丙氨酸且終止于位置+124的天冬氨酸；和一個Ig區(qū)，如下文實施例1中所述。
圖9描繪了CTLA4Ig的核苷酸序列和氨基酸序列，CTLA4Ig具有一個信號肽；一個CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的野生型氨基酸序列，所述胞外結(jié)構(gòu)域始于位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸，或始于位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸；和一個Ig區(qū)。


圖10A-C是CTLA4Ig(1道)、L104EIg(2道)和L104EA29YIg(3A道)的SDS凝膠(圖10A)；以及CTLA4Ig(圖10B)和L104EA29YIg(圖10C)的大小排阻層析分析。
圖11A和11B說明了通過NMR光譜法測定的從所述溶液結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的CTLA4胞外Ig V樣折疊的帶狀結(jié)構(gòu)圖。圖11B顯示了S25-R33區(qū)和MYPPPY區(qū)的擴展視野，指示了親和力增強型突變L104和A29的位置和側(cè)鏈取向。
圖12描繪了具有L104EA29YIg插入片段的載體piLN-LEA29Y的示意圖。
發(fā)明詳述定義本申請中所用的以下詞或短語具有所限定的含義。
本文所用的“野生型CTLA4”具有天然存在的全長CTLA4(美國專利第5,434,131號、第5,844,095號、第5,851,795號)或其結(jié)合CD80和/或CD86和/或干擾CD80和/或CD86結(jié)合其配體的胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在具體實施方案中，野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域始于位置+1的甲硫氨酸且終止于位置+124的天冬氨酸，或者野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域始于位置-1的丙氨酸且終止于位置+124的天冬氨酸。野生型CTLA4是一種細胞表面蛋白，具有一個N末端胞外結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個C末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域與靶抗原例如CD80和CD86結(jié)合。在細胞內(nèi)，天然存在的野生型CTLA4蛋白被翻譯為未成熟多肽，它在N末端包括一個信號肽。所述未成熟多肽經(jīng)歷翻譯后加工，所述加工包括切割并除去所述信號肽，產(chǎn)生具有新產(chǎn)生的與未成熟形式的N末端不同的N末端的CTLA4切割產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到，可能發(fā)生額外的翻譯后加工，從所述CTLA4切割產(chǎn)物的新產(chǎn)生的N末端除去一個或多個氨基酸。成熟形式的CTLA4分子包括CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域或其與CD80和/或CD86結(jié)合的任何部分。
“CTLA4Ig”是一種可溶性融合蛋白，包含與Ig尾連接的一個野生型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合CD80和/或CD86的任何部分。一個具體實施方案包括始于位置+1的甲硫氨酸且終止于位置+124的天冬氨酸的野生型CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域；或始于位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸的野生型CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域；于位置+125的一個接點氨基酸殘基谷氨酰胺；和包括位置+126的谷氨酸至位置+357的賴氨酸的免疫球蛋白部分(圖9)。
本文所用的“融合蛋白”定義為用本領(lǐng)域熟知的、如美國專利第5,434,131號或第5,637,481號中描述的方法連接在一起的一個或多個氨基酸序列。從而，所連接的氨基酸序列形成一種融合蛋白。
本文所用的“CTLA4突變體分子”是可以是在CTLA4中(最好是在CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域中)具有一個或多個突變、使得它與野生型CTLA4分子相似但不再相同的全長CTLA4的分子或其部分(衍生物或片段)。CTLA4突變體分子或者結(jié)合CD80，或者結(jié)合CD86，或者結(jié)合CD80和CD86兩者。突變型CTLA4分子可以在其中包括或者包括與其連接的具有生物活性或化學活性的非CTLA4分子。所述突變體分子可以是可溶性的(即循環(huán)的)或與表面結(jié)合。CTLA4突變體分子可以包括CTLA4的完整胞外結(jié)構(gòu)域或其部分，例如片段或衍生物。CTLA4突變體分子可以合成制備或重組制備。
本文所用的術(shù)語“突變”是野生型多肽的核苷酸序列或氨基酸序列的改變。在這種情況下，它是野生型CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域中的改變。所述改變可以是氨基酸的改變，包括取代、缺失、添加或截短。突變體分子可以具有一個或多個突變。核苷酸序列的突變可能導(dǎo)致或不導(dǎo)致氨基酸序列的突變，這是本領(lǐng)域眾所周知的。在該方面，某些核苷酸密碼子編碼相同的氨基酸。實例包括核苷酸密碼子CGU、CGG、CGC和CGA編碼氨基酸精氨酸(R)；或密碼子GAU和GAC編碼氨基酸天冬氨酸(D)。因此，一種蛋白質(zhì)可以由一種核酸分子或由其具體核苷酸序列不同、但仍編碼具有相同序列的蛋白質(zhì)分子的多種核酸分子編碼。氨基酸編碼序列如下氨基酸符號單字母密碼子符號丙氨酸 Ala A GCU，GCC，GCA，GCG半胱氨酸 Cys C UGU，UGC天冬氨酸 Asp D GAU，GAC谷氨酸 Glu E GAA，GAG苯丙氨酸 Phe F UUU，UUC甘氨酸 Gly G GGU，GGC，GGA，GGG組氨酸 His H CAU，CAC異亮氨酸 Ile I AUU，AUC，AUA賴氨酸 Lys K AAA，AAG亮氨酸 Leu L UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG甲硫氨酸 Met M AUG天冬酰胺 Asn N AAU，AAC脯氨酸 Pro P CCU，CCC，CCA，CCG谷氨酰胺 Gln Q CAA，CAG精氨酸 Arg R CGU，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG絲氨酸 Ser S UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，AGC蘇氨酸 Thr T ACU，ACC，ACA，ACG纈氨酸 Val V GUU，GUC，GUA，GUG色氨酸 Trp W UGG酪氨酸 Tyr Y UAU，UAC本文所用的“CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域”是CTLA4中識別并結(jié)合CD80和/或CD86的部分。例如，CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域包括位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸(圖9)?；蛘?，CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域包括位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸(圖9)。所述胞外結(jié)構(gòu)域包括結(jié)合CD80和/或CD86的CTLA4的片段或衍生物。
本文所用的“非CTLA4蛋白序列”或“非CTLA4分子”定義為不結(jié)合CD80和/或CD86且不干擾CTLA4與其靶結(jié)合的任何分子。一個實例包括但不限于免疫球蛋白(Ig)的恒定區(qū)或其部分。最好是，所述Ig恒定區(qū)是人或猴Ig恒定區(qū)，例如人C(γ)1，包括鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)?？梢詫⑺鯥g恒定區(qū)突變，以減弱其效應(yīng)子功能(美國專利第5,637,481號和第6,132,992號)。
本文所用的“CTLA4突變體分子的片段”是CTLA4突變體分子的一部分，最好是CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域或其識別并結(jié)合其靶(例如CD80和/或CD86)的部分。
本文所用的“CTLA4突變體分子的衍生物”是與CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域享有至少70％序列相似性并且功能相似、即識別并結(jié)合CD80和/或CD86的分子。
本文所用的“CTLA4分子的一部分”包括結(jié)合CD80和/或CD86的CTLA4分子的片段和衍生物。
為了使本文描述的本發(fā)明可以被更全面地理解，進行以下描述。本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供識別并結(jié)合CD80和/或CD86的可溶性CTLA4突變體分子。在某些實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體與CD80和/或CD86的親和力高于CTLA4Ig。
CTLA4突變體分子的實例包括L104EA29YIg(圖7)。L104EA29YIg的氨基酸序列可以始于氨基酸位置-1的丙氨酸且終止于氨基酸位置+357的賴氨酸?；蛘?，L104EA29YIg的氨基酸序列可以始于氨基酸位置+1的甲硫氨酸且終止于氨基酸位置+357的賴氨酸。L104EA29YIg的CTLA4部分包括氨基酸位置+1的甲硫氨酸至氨基酸位置+124的天冬氨酸。L104EA29YIg包括位置+125的一個接點氨基酸殘基谷氨酰胺和一個免疫球蛋白部分，所述免疫球蛋白部分包括位置+126的谷氨酸至位置+357的賴氨酸(圖7)。L104EA29YIg與CD80的結(jié)合親和力比野生型CTLA4Ig(下文稱為CTLA4Ig)的親和力高約2倍，而與CD86的結(jié)合親和力高約4倍。這種更強的結(jié)合導(dǎo)致L104EA29YIg在阻斷免疫應(yīng)答方面比CTLA4Ig更為有效。
CTLA4突變體分子至少包括CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域或其結(jié)合CD80和/或CD86的部分。CTLA4突變體分子的胞外部分可以包含始于位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列(圖7或8)。或者，所述CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域包含始于位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列(圖7或8)。
在一個實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體分子是包含CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域在始于+25的絲氨酸且終止于+33的精氨酸的氨基酸序列區(qū)(S25-R33)中具有一個或多個突變。例如，野生型CTLA4中位置+29的丙氨酸可以被酪氨酸(密碼子UAU，UAC)取代?；蛘?，丙氨酸可以被亮氨酸(密碼子UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG)、苯丙氨酸(密碼子UUU，UUC)、色氨酸(密碼子UGG)或蘇氨酸(密碼子ACU，ACC，ACA，ACG)取代。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的，RNA序列的尿嘧啶(U)核苷酸對應(yīng)于DNA序列的胸腺嘧啶(T)核苷酸。
在另一實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體分子是包含CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域在始于+97的甲硫氨酸且終止于+107的甘氨酸的氨基酸序列區(qū)(M97-G107)中或其附近具有一個或多個突變。例如，野生型CTLA4中位置+104的亮氨酸可以被谷氨酸(密碼子GAA，GAG)取代。具有這一取代的CTLA4突變體分子在本文中被稱為L104EIg(圖8)。
在再一實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體分子是包含CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域在S25-R33區(qū)和M97-G107區(qū)中具有一個或多個突變。例如，在一個實施方案中，CTLA4突變體分子在位置+29包含酪氨酸而不是丙氨酸；在位置+104包含谷氨酸而不是亮氨酸。具有這些取代的CTLA4突變體分子在本文中被稱為L104EA29YIg(圖7)。編碼L104EA29YIg的核酸分子包含在pD16L104EA29YIg中，并于2000年6月19日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)，10801University Blvd.，Manasas，VA 20110-2209(ATCC No.PTA-2104)。pD16L104EA29YIg載體是pcDNA3載體(INVITROGEN)的一種衍生物。
本發(fā)明還提供可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含圖7或8中所示的CTLA4突變體的胞外結(jié)構(gòu)域或其部分和一個改變所述CTLA4突變體分子的溶解性、親和性和/或效價的部分。
按照本發(fā)明的實施，所述部分可以是免疫球蛋白的恒定區(qū)或其部分。對于體內(nèi)應(yīng)用，最好是所述免疫球蛋白的恒定區(qū)在所述受治療者體內(nèi)不引發(fā)有害的免疫應(yīng)答。例如，在臨床方案中，可能最好是所述突變體分子包括人或猴免疫球蛋白的恒定區(qū)。合適的免疫球蛋白區(qū)的一個實例是人C(γ)1，它包含鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。其它同種型是可行的。此外，其它免疫球蛋白的恒定區(qū)也是可以接受的(最好是其它弱免疫原性或非免疫原性免疫球蛋白的恒定區(qū))。
其它部分包括多肽標志。合適標志的實例包括但不限于p97分子、env gp120分子、E7分子和ova分子(Dash，B.等(1994)J.Gen.Virol.751389-97；Ikeda，T.等(1994)Gene138193-6；Falk，K.等(1993)Cell.Immunol.150447-52；Fujisaka，K.等(1994)Virology204789-93)。用作標志的其它分子是可行的(Gerard，C.等(1994)Neuroscience62721-739；Byrn，R.等J.Virol.(1989)634370-4375；Smith，D.等(1987)Science2381704-1707；Lasky，L.，(1996)Science233209-212)。
本發(fā)明還提供與野生型CTLA4相比更優(yōu)先與CD80和/或CD86抗原反應(yīng)的可溶性突變型CTLA4Ig融合蛋白。一個實例是圖7所示的L104EA29YIg。
在另一實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體分子包括一個接點氨基酸殘基，該殘基位于所述CTLA4部分和免疫球蛋白部分之間。所述接點氨基酸可以是任何氨基酸，包括谷氨酰胺。所述接點氨基酸可以通過本領(lǐng)域已知的分子方法或化學合成方法引入。
在另一實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體分子包括免疫球蛋白的部分(例如鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))，其中所述免疫球蛋白部分的鉸鏈區(qū)中任何或所有的半胱氨酸殘基被絲氨酸取代，例如位置+130、+136或+139的半胱氨酸(圖7或8)。所述突變體分子也可以包括位置+148的脯氨酸被絲氨酸取代，如圖7或8中所示。
所述可溶性CTLA4突變體分子可以包括一個與所述突變體分子CTLA4部分的胞外結(jié)構(gòu)域N末端連接的信號肽序列。所述信號肽可以是允許所述突變體分子分泌的任何序列，包括得自制癌蛋白M(Malik等(1989)Molec.Cell.Biol.92847-2853)或CD5(Jones，N.H.等，(1986)Nature323346-349)的信號肽、或得自任何胞外蛋白的信號肽。
所述突變體分子可以包括在CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域N末端連接的制癌蛋白M信號肽、和與CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域C末端連接的人免疫球蛋白分子(例如鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))。這種分子包括制癌蛋白M的信號肽，包括具有位置-26的甲硫氨酸至位置-1的丙氨酸的氨基酸序列；CTLA4部分，包括具有位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列；位置+125的一個接點氨基酸殘基谷氨酰胺；和免疫球蛋白部分，包括具有位置+126的谷氨酸至位置+357的賴氨酸的氨基酸序列。
本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子可以通過分子方法或化學合成法獲得。所述分子方法可以包括下述步驟將表達并編碼所述可溶性CTLA4突變體分子的核酸分子導(dǎo)入合適宿主細胞中；在允許所述宿主細胞表達所述突變體分子的條件下培養(yǎng)如此導(dǎo)入的宿主細胞；并且分離所述表達的突變體分子。所述突變體分子的信號肽部分使得所述蛋白分子可以在細胞表面表達，并且被所述宿主細胞分泌。已翻譯的突變體分子可以經(jīng)歷翻譯后修飾，包括切割所述信號肽，產(chǎn)生具有所述CTLA4和所述免疫球蛋白部分的成熟蛋白。所述切割可以在位置+1的丙氨酸之后進行，產(chǎn)生在位置+1具有甲硫氨酸作為第一個氨基酸的成熟突變體分子(圖7或8)。或者，所述切割可以在位置-2的甲硫氨酸之后進行，產(chǎn)生在位置-1具有丙氨酸作為第一個氨基酸的成熟突變體分子。
一個優(yōu)選實施方案是具有與整個或部分人免疫球蛋白分子(例如鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))連接的人CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性CTLA4突變體分子。這種優(yōu)選分子包括所述可溶性分子的CTLA4部分，包括具有位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列；位置+125的一個接點氨基酸殘基谷氨酰胺；和免疫球蛋白部分，包括位置+126的谷氨酸至位置+357的賴氨酸。將具有CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的部分突變，使得位置+29的丙氨酸被酪氨酸取代，且位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。可以將所述突變體分子的免疫球蛋白部分突變，使得位置+130、+136和+139的半胱氨酸被絲氨酸取代，且位置+148的脯氨酸被絲氨酸取代。這種突變體分子在本文中被命名為L104EA29YIg(圖7)。
L104EA29YIg的另一個實施方案是具有下述氨基酸序列的突變體分子具有位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸、位置+125的一個接點氨基酸殘基谷氨酰胺、和在位置+126包含谷氨酸(例如+126至位置+357的賴氨酸)的免疫球蛋白部分。將具有CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的部分突變，使得位置+29的丙氨酸被酪氨酸取代，且位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。將所述突變體分子的免疫球蛋白部分突變，使得位置+130、+136和+139的半胱氨酸被絲氨酸取代，且位置+148的脯氨酸被絲氨酸取代。這種突變體分子在本文中被命名為L104EA29YIg(圖7)。在信號序列被切割后，L104EA29YIg或者可以始于位置+1的甲硫氨酸，或者可以始于位置-1的丙氨酸。
本發(fā)明的另一種突變體分子是具有與人免疫球蛋白分子(例如鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))連接的人CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性CTLA4突變體分子。該分子包括一個編碼CTLA4始于位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列部分、位置+125的一個接點氨基酸殘基谷氨酰胺、和包括具有位置+126的谷氨酸至位置+357的賴氨酸的氨基酸序列的免疫球蛋白部分。將具有CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的部分突變，使得位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。將所述突變體分子的鉸鏈區(qū)部分突變，使得位置+130、+136和+139的半胱氨酸被絲氨酸取代，且位置+148的脯氨酸被絲氨酸取代。這種突變體分子在本文中被命名為L104EIg(圖8)。
或者，L104EIg的一個實施方案是具有與人免疫球蛋白分子(例如鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū))連接的人CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性CTLA4突變體分子。這種優(yōu)選分子包括一個包括始于位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列的CTLA4部分、位置+125的一個接點氨基酸殘基谷氨酰胺、和包含位置+126的谷氨酸至位置+357的賴氨酸的免疫球蛋白部分。將具有CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的部分突變，使得位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。將所述突變體分子的鉸鏈區(qū)部分突變，使得位置+130、+136和+139的半胱氨酸被絲氨酸取代，且位置+148的脯氨酸被絲氨酸取代。這種突變體分子在本文中被命名為L104EIg(圖8)。
此外，本發(fā)明提供一種可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子具有(a)一個阻斷T細胞增殖的膜糖蛋白(例如CD28、CD86、CD80、CD40和gp39)的第一氨基酸序列，該氨基酸序列與第二氨基酸融合；(b)所述第二氨基酸序列，該氨基酸序列為阻斷T細胞增殖的突變型CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的片段，例如包含位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸分子(圖7或圖8)；和(c)一個第三氨基酸序列，該氨基酸序列用作鑒定標志或增強所述分子的溶解性。例如，所述第三氨基酸序列可以基本上由非免疫原性免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)的氨基酸殘基組成。合適免疫球蛋白分子的實例包括但不限于人或猴免疫球蛋白，例如C(γ)1。其它同種型也是可行的。
本發(fā)明還提供核酸分子，所述核酸分子包含編碼對應(yīng)于本發(fā)明可溶性CTLA4突變體分子的氨基酸序列的核苷酸序列。在一個實施方案中，所述核酸分子是DNA(例如cDNA)或其雜交體?；蛘?，所述核酸分子是RNA或其雜交體。
另外，本發(fā)明提供包含本發(fā)明核苷酸序列的載體。也提供宿主載體系統(tǒng)。所述宿主載體系統(tǒng)包括在合適宿主細胞中的本發(fā)明載體。合適宿主細胞的實例包括但不限于原核細胞和真核細胞。
本發(fā)明包括用于治療免疫系統(tǒng)疾病的藥用組合物，所述藥用組合物包含藥用有效量的可溶性CTLA4突變體分子。在某些實施方案中，所述免疫系統(tǒng)疾病由CD28和/或CTLA4陽性細胞與CD80和/或CD86陽性細胞的相互作用所介導(dǎo)。所述可溶性CTLA4突變體分子最好是在CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域中具有一個或多個突變的CTLA4分子。所述藥用組合物可以包含可溶性CTLA4突變蛋白分子和/或核酸分子和/或編碼所述分子的載體。在優(yōu)選實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體分子具有或者圖7或者圖8中所示的CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列(分別為L104EA29Y或L104E)。甚至更優(yōu)選所述可溶性CTLA4突變體分子是本文公開的L104EA29YIg。所述組合物可以還包含其它治療藥，包括但不限于藥物毒素、酶、抗體或綴合物。
所述藥用組合物也最好包括合適的載體和輔料，包括與本發(fā)明的分子(例如可溶性CTLA4突變體分子，例如L104EA29Y或L104E)混合時仍保留所述分子活性、且不與所述受治療者免疫系統(tǒng)反應(yīng)的任何物質(zhì)。合適載體和輔料的實例包括但不限于人血清白蛋白；離子交換劑；氧化鋁；卵磷脂；緩沖物質(zhì)，例如磷酸鹽；甘氨酸；山梨酸；山梨酸鉀；鹽或電解質(zhì)，例如硫酸魚精蛋白。其它實例包括任何標準藥用載體，例如磷酸緩沖鹽溶液；水；乳液，例如水包油乳液；和各種類型的潤濕劑。其它載體也可以包括無菌溶液；片劑，包括包衣片劑和膠囊劑。通常，這類載體包含賦形劑，例如淀粉、乳、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石粉、植物油脂、樹膠、二醇類或其它已知的賦形劑。這類載體也可以包括香料和顏色添加劑或其它組分。通過眾所周知的常規(guī)方法配制包含這類載體的組合物。這類組合物也可以用各種脂質(zhì)組合物(例如脂質(zhì)體)以及在各種聚合組合物(例如聚合物微球)中配制。
本發(fā)明的藥用組合物可以采用常規(guī)給藥模式給予所述受治療者，所述給藥模式包括但不限于靜脈內(nèi)(i.V.)給藥、腹膜內(nèi)(i.p.)給藥、肌內(nèi)(i.m.)給藥、皮下給藥、口服給藥、作為栓劑給藥或作為局部接觸劑給藥、或者植入緩釋裝置例如微滲透泵。
本發(fā)明的藥用組合物可以為各種各樣的劑型，包括但不限于液體溶液劑或混懸劑、片劑、丸劑、散劑、栓劑、聚合微囊或微囊泡(microvesicles)、脂質(zhì)體和注射液或輸液。優(yōu)選的形式取決于給藥模式和治療應(yīng)用。
本發(fā)明組合物的最有效的給藥模式和給藥方案取決于疾病的嚴重程度和病程、所述患者的健康狀況和對治療的反應(yīng)以及治療醫(yī)師的判斷。因此，所述組合物的劑量應(yīng)該針對各個患者來確定(titrate)。
可以給予受治療者所述可溶性CTLA4突變體分子，其給藥量和給藥時間(例如時間長度和/或多次)應(yīng)足以在所述受治療者體內(nèi)阻斷內(nèi)源B7(例如CD80和/或CD86)分子結(jié)合其相應(yīng)的配體。阻斷內(nèi)源B7/配體結(jié)合，從而抑制B7陽性細胞(例如CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞)與CD28陽性細胞和/或CTLA4陽性細胞的相互作用。治療藥的劑量取決于許多因素，包括但不限于受影響的組織類型、所治療的自身免疫病的類型、所述疾病的嚴重程度、受治療者的健康狀況和受治療者對采用所述藥物治療的反應(yīng)。因此，所述藥物的劑量可以根據(jù)受治療者和給藥模式而變化。所述可溶性CTLA4突變體分子的給藥量可以為0.1-20.0mg/kg患者體重/天，最好是0.5-10.0mg/kg/天?？梢栽诟鞣N時間內(nèi)給予本發(fā)明的藥用組合物。在一個實施方案中，可以給予本發(fā)明的藥用組合物達1小時或1小時以上。另外，根據(jù)疾病的嚴重程度以及本領(lǐng)域了解的其它因素，可以重復(fù)所述給藥。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主載體系統(tǒng)，以便在所述宿主中產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)，并且回收如此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
另外，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)功能性CTLA4陽性和CD28陽性T細胞與CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞的相互作用的方法。所述方法包括使所述CD80陽性和/或CD86陽性細胞與本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子接觸，以形成突變型CTLA4/CD80和/或突變型CTLA4/CD86復(fù)合體，所述復(fù)合體干擾內(nèi)源CTLA4抗原與CD80和/或CD86的反應(yīng)，和/或所述復(fù)合體干擾內(nèi)源CD28抗原與CD80和/或CD86的反應(yīng)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體分子是含有突變型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分的融合蛋白。在另一實施方案中，所述可溶性CTLA4突變體分子包含一個第一氨基酸序列，它包括得自具有位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列的CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域，包括至少一個突變；和一個第二氨基酸序列，它包括人免疫球蛋白γ1分子的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)(圖7或8)。
按照本發(fā)明的實施，使所述CD80陽性細胞或CD86陽性細胞與本發(fā)明可溶性CTLA4突變體分子的片段或衍生物接觸?；蛘?，所述可溶性CTLA4突變體分子是CD28Ig/CTLA4Ig融合蛋白，所述融合蛋白具有與一個第二氨基酸序列融合的一個第一氨基酸序列以及一個第三氨基酸序列，所述第一氨基酸序列對應(yīng)于CD28受體胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，所述第二氨基酸序列對應(yīng)于CTLA4突變體受體的胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，而所述第三氨基酸序列對應(yīng)于人免疫球蛋白C-γ-1的鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。
預(yù)期所述可溶性CTLA4突變體分子在體內(nèi)表現(xiàn)出抑制特性。在由于T細胞和APC細胞之間接觸而發(fā)生T細胞/APC細胞相互作用例如T細胞/B細胞相互作用的條件下，所導(dǎo)入的CTLA4突變體分子結(jié)合以與CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞(例如B細胞)反應(yīng)，可能干擾(即抑制)所述T細胞/APC細胞相互作用，導(dǎo)致調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。
本發(fā)明提供負調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法。用可溶性CTLA4突變體分子負調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，可以例如抑制或阻斷已經(jīng)在進行之中的免疫應(yīng)答，或者可能包括防止誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。本發(fā)明的可溶性CTLA4分子可以通過抑制T細胞應(yīng)答或通過在T細胞中誘導(dǎo)特異性耐受或通過這兩種途徑，抑制活化T細胞的功能，例如T淋巴細胞增殖和細胞因子分泌。
本發(fā)明還提供治療免疫系統(tǒng)疾病和耐受誘導(dǎo)的方法。在具體實施方案中，所述免疫系統(tǒng)疾病由于CD28陽性細胞和/或CTLA4陽性細胞與CD80/CD86陽性細胞相互作用而介導(dǎo)。在另一實施方案中，T細胞相互作用被抑制。免疫系統(tǒng)疾病包括但不限于自身免疫病、免疫增生病和移植相關(guān)疾病。這些方法包括將本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子給予受治療者，以調(diào)節(jié)T細胞與所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞的相互作用?；蛘?，可以給予具有與CTLA4突變體分子連接的膜糖蛋白的CTLA4突變雜種。移植相關(guān)疾病的實例包括移植物抗宿主病(GVHD)(例如可能因骨髓移植而產(chǎn)生，或?qū)е履褪苷T導(dǎo))、與移植排斥、慢性排斥和組織或細胞同種或異種移植物(包括實體器官、皮膚、胰島、肌肉、肝細胞、神經(jīng)元)相關(guān)的免疫疾病。免疫增生病的實例包括但不限于牛皮癬；T細胞淋巴瘤；急性T細胞淋巴母細胞性白血??；睪丸血管中心T細胞淋巴瘤；良性淋巴細胞性脈管炎；和自身免疫病，例如狼瘡(例如紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎)、橋本甲狀腺炎、原發(fā)性粘液水腫、格雷夫斯病、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、艾迪生病、糖尿病(例如胰島素依賴性糖尿病、I型糖尿病)、good pasture綜合征、重癥肌無力、天皰瘡、局限性回腸炎、交感性眼炎、自身免疫性眼色素層炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性出血性貧血、特發(fā)性血小板減少、原發(fā)性膽汁性肝硬變、慢性活動性肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎、斯耶格倫綜合征、風濕病(例如類風濕性關(guān)節(jié)炎)、多肌炎、硬皮病和混合型結(jié)締組織病。
本發(fā)明還提供抑制受治療者的實體器官和/或組織移植排斥的方法，所述受治療者是移植組織的受體。通常，在組織移植物中，由于T細胞將移植物識別為外來的，然后免疫應(yīng)答破壞所述移植物，而啟動移植排斥。本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子通過抑制T淋巴細胞增殖和/或細胞因子分泌，可能導(dǎo)致組織破壞減小，而抗原特異性T細胞無應(yīng)答性的誘導(dǎo)，可能導(dǎo)致長期接受移植物，而無需普遍性的免疫抑制。此外。本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子可以與其它藥物一起給予，所述其它藥物包括但不限于皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢菌素、雷帕霉素、麥考酚酸mofetil、硫唑嘌呤、tacrolismus、basiliximab和/或其它生物制劑。
本發(fā)明也提供抑制受治療者體內(nèi)移植物抗宿主病的方法。所述方法包括將本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子單獨地或與同IL-2、IL-4或γ-干擾素反應(yīng)的其它額外配體一起給予所述受治療者。例如，可以將本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子給予骨髓移植受體，以抑制供體T細胞的同種反應(yīng)性?；蛘?，可以在移植之前，使骨髓移植物內(nèi)的供體T細胞離體對受體的同種抗原耐受。
可溶性CTLA4突變體分子對T細胞應(yīng)答的抑制也可以用于治療自身免疫病。許多自身免疫病因?qū)ψ陨砜乖哂蟹磻?yīng)性的T細胞的不當活化、并且促使涉及所述疾病病理學的細胞因子和自身抗體產(chǎn)生而引起。將可溶性CTLA4突變體分子給予患有自身免疫病或易感自身免疫病的受治療者體內(nèi)，可以防止自身反應(yīng)性T細胞的活化，并且可以減輕或消除病癥。這種方法也可以包括將本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子單獨或與同IL-2、IL-4或γ-干擾素具有反應(yīng)性的其它額外配體一起給予所述受治療者。
本發(fā)明還包括所述可溶性CTLA4突變體分子與其它免疫抑制藥例如環(huán)孢菌素(參見Mathiesen，“Prolonged Survival and Vascularizationof Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous Systemof Cyclosporm A-Treated Rats(在環(huán)孢菌素治療的大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中異種移植的人成膠質(zhì)細胞瘤細胞的存活延長和血管形成)”(1989)Cancer Lett.，44151-156)、潑尼松、硫唑嘌呤和氨甲蝶呤(R.Handschumacher“第53章Drugs Used for Immunosuppression”第1264-1276頁)的應(yīng)用。其它免疫抑制藥也是可行的。例如，對于類風濕性關(guān)節(jié)炎的治療，可以將可溶性CTLA4突變體分子與包括但不限于皮質(zhì)類固醇、非類固醇消炎藥/Cox-2抑制劑、氨甲蝶呤、羥氯喹、sulphasalazopryine、金鹽、etanercept、infliximab、anakinra、硫唑嘌呤和/或其它生物制劑例如抗TNF的藥物一起給予。對于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療，可以將可溶性CTLA4突變體分子與包括但不限于皮質(zhì)類固醇、cytoxan、硫唑嘌呤、羥氯喹、麥考酚酸mofetil和/或其它生物制劑的藥物一起給予。此外，對于多發(fā)性硬化的治療，可以將可溶性CTLA4突變體分子與包括但不限于皮質(zhì)類固醇、干擾素β-1a、干擾素β-1b、glatiramer acetate、鹽酸米托蒽醌和/或其它生物制劑的藥物一起給予。
所述可溶性CTLA4突變體分子(最好是L104EA29YIg)也可以與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一種或多種以下藥物聯(lián)合使用可溶性gp39(也稱為CD40配體(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD28、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、與gp39反應(yīng)的抗體、與CD40反應(yīng)的抗體、與B7反應(yīng)的抗體、與CD28反應(yīng)的抗體、與LFA-1反應(yīng)的抗體、與LFA-2反應(yīng)的抗體、與IL-2反應(yīng)的抗體、與IL-12反應(yīng)的抗體、與IFN-γ反應(yīng)的抗體、與CD2反應(yīng)的抗體、與CD48反應(yīng)的抗體、與任何ICAM(例如ICAM-2)反應(yīng)的抗體、與CTLA4反應(yīng)的抗體、與Thy-1反應(yīng)的抗體、與CD56反應(yīng)的抗體、與CD3反應(yīng)的抗體、與CD29反應(yīng)的抗體、與TCR反應(yīng)的抗體、與VLA-4反應(yīng)的抗體、與VCAM-1反應(yīng)的抗體、與LECAM-1反應(yīng)的抗體、與ELAM-1反應(yīng)的抗體、與CD44反應(yīng)的抗體。在某些實施方案中，優(yōu)選單克隆抗體。在其它實施方案中，優(yōu)選抗體片段。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的，所述組合可以包括本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子與一種其它的免疫抑制藥、所述可溶性CTLA4突變體分子與兩種其它免疫抑制藥、所述可溶性CTLA4突變體分子與三種其它免疫抑制藥等。所述最佳組合和劑量的確定可以采用本領(lǐng)域眾所周知的方法來確定和優(yōu)化。
某些具體組合包括以下組合L104EA29YIg和CD80mAb；L104EA29YIg和CD86mAb；L104EA29YIg、CD80mAb和CD86mAb；L104EA29YIg和gp39mAb；L104EA29YIg和CD40mAb；L104EA29YIg和CD28mAb；L104EA29YIg、CD80mAb和CD86mAb以及gp39mAb；L104EA29YIg、CD80mAb和CD86mAb以及CD40mAb；以及L104EA29YIg、抗LFA1mAb和抗gp39mAb。gp39mAb的一個具體實例是MR1。其它組合是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到和理解的。
本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子例如L104EA29Y可以作為唯一的有效成分或者與免疫調(diào)節(jié)方案中的其它藥物或其它消炎藥一起給予，例如以治療或預(yù)防同種或異種移植物急性或慢性排斥或炎性疾病或自身免疫病，或誘導(dǎo)耐受。例如，它可以與以下藥物聯(lián)合使用鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢菌素A或FK506；免疫抑制性大環(huán)內(nèi)酯，例如雷帕霉素或其衍生物，例如40-O-(2-羥基)乙基-雷帕霉素；淋巴細胞歸巢劑，例如FTY720或其類似物；皮質(zhì)類固醇；環(huán)磷酰胺；硫唑嘌呤；氨甲蝶呤；來氟米特或其類似物；咪唑立賓；麥考酚酸；麥考酚酸mofetil；15-deoxyspergualine或其類似物；免疫抑制性單克隆抗體，例如針對白細胞受體(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD 11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB)或其配體的單克隆抗體；或其它免疫調(diào)節(jié)化合物，例如CTLA4/CD28-Ig或其它粘附分子抑制劑，例如mAb或低分子量抑制劑，包括LFA-1拮抗劑、選擇蛋白拮抗劑和VLA-4拮抗劑。所述化合物在上述適應(yīng)癥例如耐受誘導(dǎo)中與干擾CD40及其配體的化合物(例如抗CD40的抗體和抗CD40-L的抗體)聯(lián)合尤其有用。
當本發(fā)明的可溶性CTLA4突變體分子與其它免疫抑制療法/免疫調(diào)節(jié)療法或抗炎療法(例如上文具體描述的)結(jié)合給予時，所述共同給予的免疫抑制藥、免疫調(diào)節(jié)藥或抗炎化合物的劑量自然將根據(jù)所用的輔助藥物的類型(例如它是類固醇還是環(huán)孢菌素)、所用的具體藥物、所治療的病癥等而變化。
按照上述描述，在再一方面，本發(fā)明提供如上限定的方法，所述方法包括共同給予(例如同時給予或順序給予)治療有效量的游離形式或藥學上可接受的鹽形式的本發(fā)明可溶性CTLA4突變體分子L104EA29YIg、以及第二種藥物，所述第二種藥物是免疫抑制藥、免疫調(diào)節(jié)藥或消炎藥，例如如上所述的藥物。還提供例如用于任何上述方法中的治療組合，例如試劑盒，所述試劑盒包含與至少一種藥用組合物同時或順序使用的游離形式或藥學上可接受的鹽形式的L104EA29YIg，所述藥用組合物包含一種免疫抑制藥、免疫調(diào)節(jié)藥或消炎藥。所述試劑盒可以包含給藥說明。生產(chǎn)本發(fā)明分子的方法可以在原核細胞中表達CTLA4突變體分子。原核生物最通常以各種細菌菌株為代表。細菌可以是革蘭氏陽性菌或者是革蘭氏陰性菌。通常，優(yōu)選革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌(E.coli)。也可以使用其它微生物菌株。
可以將編碼CTLA4突變體分子的序列插入為在原核細胞例如大腸桿菌中表達外源序列而設(shè)計的載體中。這些載體可以包括常用的原核控制序列，原核控制序列在本文中定義為包括轉(zhuǎn)錄起始的啟動子、任選帶有操縱子、和核糖體結(jié)合部位序列，包括諸如以下的常用啟動子β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統(tǒng)(Chang等，(1977)Nature1981056)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel等，(1980)NucleicAcids Res.84057)和λ衍生PL啟動子和N-基因核糖體結(jié)合部位(Shimatake等，(1981)Nature292128)。
這類表達載體也將包括復(fù)制起點和選擇標記，例如賦予對抗生素抗性的β-內(nèi)酰胺酶或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，使得所述載體可以在細菌中復(fù)制，攜帶所述質(zhì)粒的細胞可以根據(jù)在抗生素(例如氨芐青霉素或卡那霉素)存在下生長來進行選擇。
可以通過各種各樣的標準方法，包括但不限于CaCl2-休克(shock)(Cohen，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA692110，和Sambrook等(編著)，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第2版，Cold SpringHarbor Press，(1989))和電穿孔，將表達質(zhì)粒導(dǎo)入原核細胞中。
按照本發(fā)明的實施，真核細胞也是合適的宿主細胞。真核細胞的實例包括任何動物細胞(無論是原代細胞還是無限增殖化細胞)、酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosacharomyces pombe)和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris))和植物細胞。骨髓瘤細胞、COS細胞和CHO細胞是可以用作宿主的動物細胞的實例。具體的CHO細胞包括但不限于DG44(Chasin等，1986Som.Cell.Molec.Genet.12555-556；Kolkekar 1997Biochemistry3610901-10909)、CHO-K1(ATCC No.CCL-61)、CHO-K1 Tet-On細胞系(Clontech)、名為ECACC 85050302的CHO(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)、CHO克隆13(GEIMG，Genova，IT)、CHO克隆B(GEIMG，Genova，IT)、名為ECACC 93061607的CHO-K1/SF(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)和名為ECACC 92052129的RR-CHOK1(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)。示例性的植物細胞包括煙草(全植株、細胞培養(yǎng)物或愈傷組織)、玉米、大豆和水稻細胞。玉米、大豆和水稻種子也是可接受的。
也可以將編碼CTLA4突變體分子的核酸序列插入到為在真核宿主中表達外源序列而設(shè)計的載體中。所述載體的調(diào)節(jié)元件可以根據(jù)具體的真核宿主而變化。
在表達載體中使用的常用真核控制序列包括與哺乳動物細胞匹配的啟動子和控制序列，例如CMV啟動子(CDM8載體)和禽肉瘤病毒(ASV)(πLN載體)。其它常用的啟動子包括得自猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期啟動子(Fiers等，(1973)Nature273113)或其它病毒啟動子，例如得自多瘤病毒、腺病毒2和牛乳頭瘤病毒的那些啟動子。也可以使用誘導(dǎo)型啟動子，例如hMTII(Karin等，(1982)Nature299797-802)。
用于在真核生物中表達CTLA4突變體分子的載體也可以攜帶稱為增強子區(qū)的序列。這些在優(yōu)化基因表達方面是重要的，并且存在于所述啟動區(qū)的上游或下游。
用于真核宿主細胞的表達載體的實例包括但不限于用于哺乳動物宿主細胞的載體(例如BPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2(Maniatis)；pIRES(Clontech)；pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFV1(Life Technologies)；pVPakc載體、pCMV載體、pSG5載體(Stratagene))、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如pFB載體(Stratagene))、pCDNA-3(Invitrogen)或其修飾形式、腺病毒載體；腺伴隨病毒載體、桿狀病毒載體、酵母載體(例如pESC載體(Stratagene))。
可以將編碼CTLA4突變體分子的核酸序列整合到真核宿主細胞的基因組中，并且當宿主基因組復(fù)制時進行復(fù)制?；蛘撸瑪y帶CTLA4突變體分子的載體可以含有復(fù)制起點，以允許在染色體外復(fù)制。
為了在釀酒酵母中表達所述核酸序列，可以使用得自內(nèi)源酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點-2μ環(huán)(Broach，(1983)Meth.Enz.101307)?；蛘撸梢允褂玫米越湍富蚪M中能夠啟動自主復(fù)制的序列(參見例如Stinchcomb等，(1979)Nature28239)；Tschemper等，(1980)Gene10157；和Clarke等，(1983)Meth.Enz.101300)。
供酵母載體用的轉(zhuǎn)錄控制序列包括用于合成糖酵解酶的啟動子(Hess等，(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7149；Holland等，(1978)Biochemistry174900)。本領(lǐng)域已知的其它啟動子包括在CDM8載體中提供的CMV啟動子(Toyama和Okayama，(1990)FEBS268217-221)；3-磷酸甘油酸激酶的啟動子(Hitzeman等，(1980)J.Biol.Chem.2552073)和其它糖酵解酶的啟動子。
其它啟動子是誘導(dǎo)型的，因為它們可以受環(huán)境刺激或所述細胞的生長培養(yǎng)基的調(diào)節(jié)。這些誘導(dǎo)型啟動子包括得自熱激蛋白、醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮分解代謝相關(guān)的酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的基因的啟動子。
可以將調(diào)節(jié)序列置于所述編碼序列的3’端。這些序列可以用來穩(wěn)定信使RNA。這類終止子存在于幾種酵母衍生基因和哺乳動物基因中所述編碼序列之后的3’非翻譯區(qū)中。
供植物和植物細胞用的示例性載體包括但不限于農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒、花椰菜花葉病毒(CaMV)和番茄金花葉病毒(TGMV)。
Axel已經(jīng)描述了哺乳動物細胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般性方面(于1983年8月16日授予的美國專利第4,399,216號)。哺乳動物細胞可以用包括但不限于以下的方法來轉(zhuǎn)化在磷酸鈣存在下轉(zhuǎn)染、微注射、電穿孔或通過用病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。
將外源DNA序列導(dǎo)入植物和酵母基因組中的方法包括(1)機械方法，例如將DNA微注射到單個細胞或原生質(zhì)體中，將細胞與玻璃珠在DNA存在下渦旋混合，或?qū)蠨NA的鎢球或金球射入到細胞或原生質(zhì)體中；(2)通過經(jīng)聚乙二醇處理或經(jīng)過高壓電脈沖(電穿孔)使細胞膜對大分子通透而導(dǎo)入DNA；或(3)應(yīng)用與細胞膜融合的脂質(zhì)體(含有cDNA)。
CTLA4突變體分子的表達可以通過本領(lǐng)域已知的方法檢測。例如，可以通過將SDS-PAGE凝膠考馬斯染色，并且用結(jié)合CTLA4的抗體進行免疫印跡，可以檢測所述突變體分子。蛋白質(zhì)的回收可以采用標準蛋白純化法例如親和層析或離子交換層析來進行，以得到基本純的產(chǎn)物(R.Scopes，“Protein Purification，Principles and Practice”，第3版，Springer-Verlag(1994))。
本發(fā)明還提供如上所述產(chǎn)生的可溶性CTLA4突變體分子?；贑TLA4Ig密碼子的誘變在一個實施方案中，用定點誘變和一種新的篩選方法來鑒定CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域中改進對CD86結(jié)合親和力的幾種突變。在該實施方案中，在以下部位進行突變CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域中從絲氨酸25至精氨酸33的區(qū)中的殘基、C’鏈(丙氨酸49和蘇氨酸51)、F鏈(賴氨酸93、谷氨酸95和亮氨酸96)、以及在甲硫氨酸97至酪氨酸102的區(qū)、酪氨酸103至甘氨酸107的區(qū)和G鏈中的位置谷氨酰胺111、酪氨酸113和異亮氨酸115。這些位點的選擇基于對嵌合CD28/CTLA4融合蛋白的研究(Peach等，J.Exp.Med.，1994，1802049-2058)和一種預(yù)測哪些氨基酸殘基側(cè)鏈將是溶劑暴露的模型和在CD28和CTLA4之間的某些位置缺乏氨基酸殘基同一性或同源性。此外，在空間上緊鄰所鑒定的殘基(5-20埃單位)的任何殘基被認為是本發(fā)明的部分。
為了合成和篩選對CD80和/或CD86的親和性改變的可溶性CTLA4突變體分子，采用一種兩步策略。所述實驗要求首先產(chǎn)生一個在CTLA4胞外部分的特定密碼子突變的文庫，然后通過BIAcore分析篩選這些突變，以鑒定對CD80或CD86的反應(yīng)性改變的突變體。Biacore測定系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway，N.J.)使用一種表面等離波子共振檢測系統(tǒng)，基本上包括將或者CD80Ig或者CD86Ig共價結(jié)合于包有葡聚糖的位于檢測器中的傳感器芯片上。然后將所述受試分子注射到含有所述傳感器芯片的室中，可以根據(jù)與傳感器芯片的包有葡聚糖一側(cè)物理結(jié)合的分子量的改變，評價所結(jié)合的互補蛋白的量；分子量的改變可以用所述檢測系統(tǒng)測量。本發(fā)明的優(yōu)點因為CTLA4與CD80和CD86的結(jié)合的特征為締合(“on”)速率快和解離(“off”)速率快，并且因為CTLA4Ig-CD86復(fù)合體的解離比CTLA4Ig-CD80復(fù)合體的解離快約5-8倍，所以這就是減慢CTLA4Ig與CD80和/或CD86解離的速率可能產(chǎn)生更為有效的免疫抑制特性的分子的原因。因此，預(yù)期與野生型CTLA4和非突變型CTLA4Ig相比對CD80陽性細胞或CD86陽性細胞的親和力較高的可溶性CTLA4突變體分子，以高于野生型CTLA4或非突變型CTLA4Ig的效力阻斷抗原特異性活化細胞的引發(fā)。
此外，CTLA4Ig的生產(chǎn)成本非常高。具有更有效的免疫抑制特性的高親和力突變型CTLA4Ig分子可以以比非突變型CTLA4Ig低得多的劑量用于臨床，而達到相似的免疫抑制水平。因此，可溶性CTLA4突變體分子例如L104EA29YIg可能是非常成本有效的。
提供以下實施例以說明本發(fā)明，并且有助于技術(shù)人員實施和使用本發(fā)明。所述實施例不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
對于鄰近CTLA4Ig的S25-R33的誘變，首先通過PCR引物指導(dǎo)的誘變，將沉默NheI限制位點引入該環(huán)的5’。PCR產(chǎn)物用NheI/XbaI消化，并亞克隆到經(jīng)相似切割的CTLA4Ig或L104EIg表達載體中。用該方法構(gòu)建雙位點CTLA4突變體分子L104EA29YIg(圖7)。具體地說，用編碼單位點CTLA4突變體分子L104EIg的核酸分子作為模板，構(gòu)建雙位點CTLA4突變體分子L104EA29YIg。具有L104EA29YIg的piLN載體示于圖12。
目前的體外和體內(nèi)研究表明，CTLA4Ig本身不能完全阻斷抗原特異性活化T細胞的引發(fā)。采用CTLA4Ig和CD80或CD86特異性單克隆抗體測量T細胞增殖的抑制的體外研究表明，抗CD80單克隆抗體不增強CTLA4Ig的抑制。然而，抗CD86單克隆抗體卻增強所述抑制，表明CTLA4Ig在阻斷CD86相互作用方面并不同樣有效。這些數(shù)據(jù)支持Linsley等的早期發(fā)現(xiàn)(Immunity，(1994)，1793-801)，所述發(fā)現(xiàn)表明CD80介導(dǎo)的細胞應(yīng)答的抑制比CD86介導(dǎo)的應(yīng)答需要低約100倍的CTLA4Ig濃度。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，推斷出對CD86的親和力高于野生型CTLA4的可溶性CTLA4突變體分子應(yīng)該能夠比CTLA4Ig更好地阻斷抗原特異性活化細胞的引發(fā)。
為此，采用一種新的篩選方法篩選以上實施例1中所述的可溶性CTLA4突變體分子，以鑒定CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域中CD80和CD86結(jié)合親和力改進的幾種突變。這一篩選策略提供了一種有效的方法，直接鑒定解離速率明顯較慢的突變體，而無需蛋白純化或定量，因為“解離”速率的測定是與濃度無關(guān)(O’Shannessy等，(1993)Anal.Biochem.，212457-468)。
用各種小量制備純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染COS細胞，并將其繁殖數(shù)天。向包被可溶性CD80Ig或CD86Ig的BIAcore生物傳感芯片(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)供應(yīng)三天的條件培養(yǎng)基。通過表面等離波子共振(O’Shannessy，D.J.等，(1993)Anal，Biochem.212457-468)測量突變蛋白的特異性締合和解離。所有實驗均在BIAcoreTM或BIAcoreTM2000生物傳感器上于25℃下進行。用標準N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺偶聯(lián)(Johnsson，B.等(1991)Anal.Biochem.198268-277；Khilko，S.N.等(1993)J.Biol.Chem2685425-15434)，將配體在研究級NCM5傳感器芯片(Pharmacia)上固定化。篩選方法在24孔組織培養(yǎng)板中生長的COS細胞用編碼突變型CTLA4Ig的DNA瞬時轉(zhuǎn)染。3天后，收集合有分泌型可溶性突變型CTLA4Ig的培養(yǎng)基。
讓COS細胞條件培養(yǎng)基流過用CD86Ig或CD80Ig衍生化的BIAcore生物傳感芯片(如Greene等，1996J.Biol.Chem.27126762-26771中所述)，根據(jù)“解離”速率比野生型CTLA4Ig中觀測的解離速率慢，鑒定出突變體分子。將對應(yīng)于所選培養(yǎng)基樣品的cDNA測序，制備DNA以進行更大規(guī)模的COS細胞瞬時轉(zhuǎn)染，在對培養(yǎng)基進行A蛋白純化后，從中制備突變型CTLA4Ig蛋白。
如J.Greene等1996J.Biol.Chem.27126762-26771中和本文所述，進行BIAcore分析條件和平衡結(jié)合數(shù)據(jù)分析。BIAcore數(shù)據(jù)分析在分析之前，將Senosorgram基線標準化為零應(yīng)答單位(RU)。使樣品通過模擬衍生化的流動細胞，以測定由于溶液之間體積折射率(bulk refractive index)的差異而產(chǎn)生的背景應(yīng)答單位(RU)值。根據(jù)Req對C的曲線計算平衡解離常數(shù)(Kd)，其中Req是穩(wěn)態(tài)反應(yīng)減去模擬衍生化芯片上的應(yīng)答，而C是被分析物的摩爾濃度。用商業(yè)非線性曲線擬合軟件(Prism，GraphPAD Software)分析結(jié)合曲線。
首先將實驗數(shù)據(jù)與單一配體與單一受體結(jié)合的模型(單位點模型，即簡單朗繆爾系統(tǒng)，A+BAB)擬合，根據(jù)等式R＝Rmax·C/(Kd+C)計算平衡締合常數(shù)(Kd＝[A]·[B]\[AB])。隨后，將數(shù)據(jù)與最簡單的配體結(jié)合的雙位點模型(即根據(jù)等式R＝Rmax1·C\(Kd1+C)+Rmax2·C\(Kd2+C)描述與具有兩個非相互作用非依賴性結(jié)合部位的受體)擬合。
這兩種模型的適合度通過與實驗數(shù)據(jù)比較進行肉眼分析，以及通過平方和的F檢驗進行統(tǒng)計學分析。選擇較簡單的單位點模型作為最佳擬合，除非雙位點模型擬合顯著更好(p＜0.1)。
締合和解離分析用BIA evaluation 2.1軟件(Pharmanai)來進行。以兩種方式計算締合速率常數(shù)Kon，假定既有同源單位點相互作用也有平行的雙位點相互作用。對于單位點相互作用，kon值按照等式Rt＝Req(1-exp-ks(t-t0)來計算，其中Rt是給定時間t的應(yīng)答；Req是穩(wěn)態(tài)應(yīng)答；t0是注射開始時的時間；而ks＝dR/dt＝kon·Ckoff，其中C為根據(jù)單體結(jié)合部位計算的被分析物的濃度。對于雙位點相互作用，kon值按照等式Rt＝Req1(1-exp-ks1(t-t0)+Req2(1-expks2(t-t0)來計算。對于每種模型，kon值根據(jù)ks對C的曲線圖的計算斜率(至約70％最大締合)來確定。
解離數(shù)據(jù)按照單位點(AB＝A+B)或雙位點(AiBj＝Ai+Bj)模型進行分析，速率常數(shù)(koff)根據(jù)最佳擬合曲線來計算。使用所述結(jié)合部位模型，除非所述殘基大于機器背景(2-10 RU，按照機器)，在這種情況下使用雙結(jié)合部位模型。利用關(guān)系t1/2＝0.693/koff，計算受體占據(jù)的半衰期。流式細胞術(shù)鼠mAB L307.4(抗CD80)購自Becton Dickinson(San Jose，Califomia)，而IT2.2(抗B7-0[也稱為CD86])購自Pharmingen(San Diego，Califormia)。對于免疫染色，通過在含有10mM EDTA的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中孵育，從培養(yǎng)管中取出CD80陽性和/或CD86陽性CHO細胞。首先將CHO細胞(1-10×105)與mAb或免疫球蛋白融合蛋白在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中孵育，然后洗滌，并與異硫氰酸熒光素綴合的山羊抗小鼠或抗人免疫球蛋白第二步試劑(Tago，Burlingame，California)一起孵育。給予細胞最后一次洗滌，并在FACScan(Becton Dickinson)上分析。SDS-PAGE和大小排阻層析在Tris/甘氨酸4-20％丙烯酰胺凝膠(Novex，San Diego，CA)上進行SDS-PAGE。分析型凝膠用考馬斯藍染色，通過數(shù)字掃描獲得濕凝膠的圖象。通過大小排阻層析，用在含有0.02％NaN3的磷酸緩沖鹽溶液中以1.0ml/min的流速平衡的TSK-GEL G300 SWXL柱(7.8×300mm，Tosohaas，Montgomeryville，PA)分析CTLA4Ig(25μg)和L104EA29YIg(25μg)。CTLA4XC120S和L104EA29YXC120S如先前已描述的方法(Linsley等，(1995)J.Biol.Chem.27015417-15424)制備單鏈CTLA4XC120S。簡而言之，制癌蛋白M CTLA4(OMCTLA4)表達質(zhì)粒用作模板，選擇正向引物GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG以匹配所述載體中的序列；而反向引物GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC對應(yīng)于CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域中的最后7個氨基酸(即氨基酸118-124)，并且含有一個限制性酶位點和一個終止密碼子(TGA)。反向引物限定了一個C120S(位置120上半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸)突變。具體地說，以上所示反向引物的核苷酸序列GCA(核苷酸34-36)被以下核苷酸序列之一取代AGA、GGA、TGA、CGA、ACT或GCT。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的，核苷酸序列GCA是半胱氨酸的密碼子TGC的反向互補序列。同樣，核苷酸序列AGA、GGA、TGA、CGA、ACT或GCT是絲氨酸密碼子的反向互補序列。聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物用HindIII/XbaI消化，定向亞克隆到表達載體πLN(Bristol-Myers Squibb Company，Princeton，NJ)中。以同樣方式制備L104EA29YXC120S。每種構(gòu)建體通過DNA測序來確證。高親和力突變體的鑒定和生物化學表征選擇24個氨基酸進行誘變，通過表面等離波子共振(SPR；如上所述，參見上文)分析所得的～2300種突變型蛋白的CD86Ig結(jié)合。每個位點誘變的主要效應(yīng)概述于表II中。S25-R33中某些氨基酸的隨機誘變顯然不改變配體結(jié)合。E31和R33以及殘基M97-Y102的誘變顯然導(dǎo)致配體結(jié)合降低。殘基S25、A29以及T30、K93、L96、Y103、L104和G105的誘變產(chǎn)生“締合”速率慢和/或“解離”速率慢的蛋白質(zhì)。這些結(jié)果證實了先前的發(fā)現(xiàn)，即S25-R33區(qū)中的殘基和M97-Y102中或其附近的殘基影響配體結(jié)合(Peach等，(1994)J.Exp.Med，1802049-2058)。
位點S25、T30、K93、L96、Y103和G105的誘變導(dǎo)致鑒定出與CD86Ig“解離”速率較慢的某些突變蛋白。然而，在這些情況下，所述慢的“解離”速率被慢的“締合”速率所平衡，導(dǎo)致突變蛋白對CD86Ig的總體親和力看起來與野生型CTLA4Ig的相似。另外，K93的誘變導(dǎo)致顯著聚集，這可能是由于所觀測到的動力學改變所引起的。
L104的隨機誘變后接COS細胞轉(zhuǎn)染和通過在固定化CD86Ig上培養(yǎng)基樣品的SPR進行篩選，得到6種含有突變蛋白的培養(yǎng)基樣品，所述突變蛋白的“解離”速率比野生型CTLA4Ig慢約2倍。當對這些突變體的相應(yīng)cDNA測序時，發(fā)現(xiàn)每種cDNA編碼一個亮氨酸變?yōu)楣劝彼岬耐蛔?L104E)。顯然，亮氨酸104被取代為天冬氨酸(L104D)不影響CD86Ig的結(jié)合。
然后如上所述在表II中所列的每個位點重復(fù)誘變，這時采用L104E代替野生型CTLA4Ig作為PCR模板。再次利用固定化CD86Ig的SPR分析，鑒定出6種得自丙氨酸29誘變的培養(yǎng)基樣品，所述蛋白質(zhì)的“解離”速率比野生型CTLA4Ig慢約4倍。最慢的兩種是酪氨酸取代(L104EA29Y)，兩種是亮氨酸(L104EA29L)、一種是色氨酸(L104EA29W)，一種是蘇氨酸(L104EA29T)。顯然，當在野生型CTLA4Ig中將丙氨酸29單獨隨機突變時，沒有鑒定出解離”速率慢的突變體。
經(jīng)純化的L104E和L104EA29YIg的相對分子量和聚集狀態(tài)通過SDS-PAGE和大小排阻層析來評價。L104EA29YIg(～1μg；3道)和L104EIg(～1μg；2道)電泳遷移率在還原條件(～50kDa；+βME；加上2-巰基乙醇)和非還原條件(～100kDa；-βME)下在表觀上與CTLA4Ig(～1μg；1道)相同(圖10A)。大小排阻層析表明，L104EA29YIg(圖10C)的遷移率在表觀上與二聚CTLA4Ig相同(圖10B)。主峰代表蛋白二聚體，而圖10B中較快洗脫的次要峰代表較高分子量的聚集體。約5.0％的CTLA4Ig以較高分子量的聚集體存在，但沒有L104EA29YIg或L104EIg聚集的證據(jù)。因此，用L104EIg和L104EA29YIg觀測到與CD86Ig的較強結(jié)合可能不能歸因于誘變誘導(dǎo)的聚集。平衡和動態(tài)結(jié)合分析采用表面等離波子共振(SPR)，在A蛋白純化的CTLA4Ig、L104EIg和L104EA29YIg上進行平衡和動態(tài)結(jié)合分析。結(jié)果示于表I中。根據(jù)在濃度(5,0-200nM)范圍內(nèi)產(chǎn)生的結(jié)合曲線，計算所觀測的平衡解離常數(shù)(Kd；表I)。L104EA29YIg與CD86Ig的結(jié)合比L104EIg或CTLA4Ig強。L104EA29YIg(3.21nM)的Kd比L104EIg(6.06nM)或CTLA4Ig(13.9nM)低，表明L104EA29YIg與CD86Ig的結(jié)合親和力更高。L104EA29YIg(3.66nM)的Kd比L104EIg(4.47nM)或CTLA4Ig(6.51nM)低，表明L104EA29YIg與CD80Ig的結(jié)合親和力更高。
動態(tài)結(jié)合分析表明，CTLA4Ig、L104EIg和L104EA29YIg與CD80結(jié)合的相對締合”速率相似，對CD86Ig的“締合”速率也相似(表I)。然而，這些分子的“解離”速率不同(表I)。與CTLA4Ig相比，L104EA29YIg與CD80Ig的“解離”速率慢約2倍，與CD86Ig的“解離”速率慢約4倍。L104E的“解離”速率介于L104EA29YIg和CTLA4Ig之間。因為這些突變的引入不顯著影響“締合”速率，所以用L104EA29YIg觀測到的對CD80Ig和CD86Ig親和力的增強同樣主要是由于“解離”速率降低引起的。
為了確定L104EA29YIg對CD86Ig和CD80Ig的親和力增強是否是影響每個單體締合為二聚體的方式的突變所致、或者是否在每個單體中引入了親和力增強的結(jié)構(gòu)改變，如上述所述和Linsley等，(1995)J.Biol.Chem.，27015417-15424中所述的方法，在將半胱氨酸120誘變?yōu)榻z氨酸后，制備CTLA4和L104EA29YIg胞外結(jié)構(gòu)域的單鏈構(gòu)建體。在通過SPR分析配體結(jié)合特性之前，通過凝膠滲透層析(Linsley等，(1995)，參見上文)，表明純化蛋白CTLA4XC120S和L104EA29YXC120S是單體的。結(jié)果表明，兩種單體蛋白對CD86Ig的結(jié)合親和性比所觀測到的其相應(yīng)二聚體低約35-80倍(表I)。這支持了先前發(fā)表的確立高親和力配體結(jié)合需要CTLA4二聚化的資料(Greene等，(1996)J.Biol.Chem.，27126762-26771)。
L104EA29YXC120S與CD80Ig和CD86Ig兩者結(jié)合的親和性均比CTLA4XC120S高約2倍。所述增強的親和性是由于與所述兩種配體的解離速率慢約3倍所致。因此，L104EA29Y較強的配體結(jié)合很可能是由于已經(jīng)引入到每個單體鏈中的親和力增強性結(jié)構(gòu)改變所致，而非因分子二聚化的改變所致。親和力增強突變的位置和結(jié)構(gòu)分析最近通過NMR光譜法測定了CTLA4胞外IgV樣結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)(Metzler等，(1997)Nature Struct.Biol.4527-531)。這允許精確確定三維折疊中亮氨酸104和丙氨酸29的位置(圖11A-B)。亮氨酸104位于高度保守的MYPPPY氨基酸序列附近。丙氨酸29位于在空間上與MYPPPY區(qū)相鄰的S25-S33區(qū)C末端附近。雖然在這兩個區(qū)的堿基上的殘基之間有顯著的相互作用，但表觀上在L104和A29之間沒有直接的相互作用，雖然它們都構(gòu)成所述蛋白中相鄰疏水核心的部分。通過建模評價這兩種親和力增強突變體的結(jié)構(gòu)重要性。A29Y突變可以容易地容納在S25-R33區(qū)和MYPPPY區(qū)之間的裂縫中，可以用來穩(wěn)定MYPPPY區(qū)的構(gòu)象。在野生型CTLA4中，L104與MYPPPY區(qū)附近的L96和V94形成廣泛的疏水作用。因為兩個原因，谷氨酸突變采用與L104相似的構(gòu)象是非常不可能的。首先，在不顯著擾亂S25-R33區(qū)的情況下，在所述結(jié)構(gòu)中沒有足夠的空間容納較長的谷氨酸的側(cè)鏈。其次，疏水區(qū)中掩蓋谷氨酸側(cè)鏈的負電荷的電荷成本將會很大。而建模研究預(yù)測谷氨酸側(cè)鏈翻轉(zhuǎn)到表面上，在此其電荷可以通過溶劑化而穩(wěn)定。這種構(gòu)象的改變可以容易由G105提供，而相對于所述區(qū)中其它殘基的扭曲最小。高親和力突變體與表達CD80或CD86的CHO細胞的結(jié)合CTLA4Ig和突變體分子與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CD80+和CD86+CHO細胞結(jié)合的FACS分析(圖2)如本文所述方法進行。讓CD80陽性和CD86陽性CHO細胞與濃度增加的CTLA4Ig、L104EA29YIg或L104EIg一起孵育，然后洗滌。結(jié)合的免疫球蛋白融合蛋白用異硫氰酸熒光素綴合的山羊抗人免疫球蛋白檢測。
如圖2所示，將CD80陽性或CD86陽性CHO細胞(1.5×105)與所示濃度的CTLA4Ig(實心方形)、L104EA29YIg(圓形)或L104EIg(三角形)一起于23℃孵育2小時，洗滌，然后與異硫氰酸熒光素綴合的山羊抗人免疫球蛋白抗體一起孵育。在FACScan上分析(單一檢測(singledetermination))總共5,000個活細胞上的結(jié)合，用PC-LYSYS，根據(jù)數(shù)據(jù)直方圖確定平均熒光強度(MFI)。數(shù)據(jù)根據(jù)在僅與第二步試劑一起孵育的細胞上測量的背景熒光(MFI＝7)進行校正。對照L6mAb(80μg/ml)得出MFI＜30。這些結(jié)果代表四個獨立的實驗。
L104EA29YIg、L104EIg和CTLA4Ig與人CD80轉(zhuǎn)染的CHO細胞的結(jié)合大約相同(圖2A)。L104EA29YIg和L104EIg與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人CD86的CHO細胞的結(jié)合比CTLA4Ig更強(圖2B)。功能測定通過免疫磁性負選擇(Linsley等，(1992)J.Exp.Med.1761595-1604)，分離人CD4陽性T細胞。分離的CD4陽性T細胞在濃度逐漸增加的抑制劑存在下用乙酸肉豆蔻酸佛波醇(PMA)加CD80陽性或CD86陽性CHO細胞刺激。CD4陽性T細胞(8-10×104/孔)在1nM PMA加上或無輻射的CHO細胞刺激物存在下培養(yǎng)。通過在72小時培養(yǎng)的最后7小時期間加入1μCi/孔的[3H]胸苷，測量增殖應(yīng)答。進行L104EA29YIg和CTLA4Ig對PMA加CD80陽性CHO或CD86陽性CHO刺激的T細胞的抑制。結(jié)果示于圖3。L104EA29YIg比CTLA4Ig更強地抑制CD80陽性PMA處理的CHO細胞的增殖(圖3A)。在抑制CD86陽性PMA處理的CHO細胞增殖方面，L104EA29YIg也比CTLA4Ig更有效(圖3B)。因此，L104EA29YIg是更為有效的CD80和CD86介導(dǎo)的T細胞共同刺激的抑制劑。
圖4顯示了L104EA29YIg和CTLA4Ig對上述制備的經(jīng)同種刺激并且用表達CD80和CD86的人B類淋巴母細胞細胞系(LCL)(稱為PM)進一步同種刺激的人T細胞(T細胞3.0×104/孔，PM8.0×103/孔)的抑制。初次同種刺激進行6天，然后所述細胞用3H-胸苷脈沖處理7小時，然后測定放射性標記的摻入。
二次同種刺激如下進行。在淋巴細胞分離介質(zhì)(LSM)(ICN，Aurora，OH)上收獲7天初次同種刺激的T細胞，并休息24小時。然后，通過按上述相同的比率加入PM，使T細胞在逐漸增加量的CTLA4Ig或L104EA29YIg存在下再次刺激(二次刺激)。刺激進行3天，然后如上所述，所述細胞用放射性標記進行脈沖處理并收獲。L104EA29YIg對初次同種刺激的T細胞的影響示于圖4A。L104EA29YIg對二次同種刺激的T細胞的影響示于圖4B。L104EA29YIg比CTLA4Ig更好地抑制初次和二次T細胞增殖應(yīng)答。
為了測量細胞因子產(chǎn)生(圖5)，建立復(fù)份的二次同種刺激平板。3天后，用ELISA試劑盒(Biosource，Camarillo，CA)，用生產(chǎn)商建議的條件分析培養(yǎng)基。發(fā)現(xiàn)L104EA29YIg比CTLA4Ig更有效地阻斷在二次同種刺激后T細胞的IL-2、IL-4和γ-干擾素細胞因子的產(chǎn)生(圖5A-C)。
L104EA29YIg和CTLA4Ig對猴混合淋巴細胞應(yīng)答(MLR)的影響示于圖6。得自兩只猴子的外周血單核細胞(PBMC；3.5×104細胞/孔，得自每只猴子)在淋巴細胞分離介質(zhì)(LSM)上純化，將其與2μg/ml植物凝集素(PHA)混合。對所述細胞刺激3天，然后用放射性標記脈沖處理16小時，然后收獲。L104EA29YIg比CTLA4Ig更好地抑制猴T細胞增殖。表I在下表中給出平衡和表觀動力學常數(shù)(數(shù)值為得自三個不同實驗的平均值±標準差)固定化蛋白 被分析物 kon(×105) kon(×10-3)KdM-1S-1S-1nMCD80Ig CTLA4Ig 3.44±0.292.21±0.18 6.51±1.08CD80Ig L104EIg 3.02±0.051.35±0.08 4.47±0.36CD80Ig L104EA29YIg 2.96±0.201.08±0.05 3.66±0.41CD80Ig CTLA4XC120S12.0±1.0 230±10 195±25CD80Ig L104EA29YXC120S8.3±0.26 71±585.0±2.5CD86Ig CTLA4Ig 5.95±0.578.16±0.52 13.9±2.27CD86Ig L104EIg 7.03±0.224.26±0.11 6.06±0.05CD86Ig L104EA29YIg 6.42±0.402.06±0.03 3.21±0.23CD86Ig CTLA4XC120S16.5±0.5 840±55 511±17CD86Ig L104EA29YX120S11.4±1.6 300±10 267±29表II如上文所述，通過SPR測定在所列位點上CTLA4Ig的誘變對CD86Ig結(jié)合的效應(yīng)。主要效應(yīng)用“+”符號表示。誘變位點 誘變的效應(yīng)無表觀效應(yīng)“締合”速率慢/ 配體結(jié)合“解離”速率慢 減弱S25 +P26+G27+K28+A29 +T30 +E31 +R33 +K93 +L96 +M97 +Y98 +P99 +P100 +P101 +Y102 +Y103+L104+G105+I106+G107+Q111+Y113+I115+
正如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的，本發(fā)明可以具體表現(xiàn)為以上具體公開的形式以外的形式，而不違背本發(fā)明的精神或基本特征。因而，以上所述的本發(fā)明的具體實施方案應(yīng)被認為是說明性的，而非限制性的。本發(fā)明的范圍如所附權(quán)利要求書中所述，而不限于以上說明中所包括的實施例。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合CD80和/或CD86的CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，使得在所述胞外結(jié)構(gòu)域中，(a)位置+29的丙氨酸被選自酪氨酸、亮氨酸、色氨酸和蘇氨酸的一種氨基酸取代，并且(b)位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
2.權(quán)利要求1的CTLA4突變體分子，所述突變體分子還包含改變所述可溶性CTLA4突變體分子的溶解性、親和性或效價的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的CTLA4突變體分子，其中所述氨基酸序列包含人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
4.權(quán)利要求2的CTLA4突變體分子，所述突變體分子還包含允許所述可溶性CTLA4突變體分子分泌的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的CTLA4突變體分子，其中所述氨基酸序列包含制癌蛋白M的信號肽。
6.權(quán)利要求1的CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含如圖7中所示位置+1的甲硫氨酸和位置+124的天冬氨酸。
7.權(quán)利要求1的CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含如圖7中所示位置-1的丙氨酸和位置+124的天冬氨酸。
8.權(quán)利要求3的CTLA4突變體分子，其中將所述人免疫球蛋白的恒定區(qū)突變，以包括如圖7中所示用絲氨酸取代的位置+130的半胱氨酸、用絲氨酸取代的位置+136的半胱氨酸、用絲氨酸取代的位置+139的半胱氨酸和用絲氨酸取代的位置+148的脯氨酸。
9.一種以比CTLA4更高的親和力與CD80和/或CD86結(jié)合的可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，其中在所述胞外結(jié)構(gòu)域中，如圖7中所示，位置+29的丙氨酸被酪氨酸取代，且位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
10.權(quán)利要求9的CTLA4突變體分子，所述突變體分子還包含改變所述可溶性CTLA4突變體分子的溶解性、親和性或效價的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求10的CTLA4突變體分子，其中所述氨基酸序列包含人免疫球蛋白的恒定區(qū)。
12.權(quán)利要求10的CTLA4突變體分子，所述突變體分子還包含允許所述可溶性CTLA4突變體分子分泌的氨基酸序列。
13.權(quán)利要求12的CTLA4突變體分子，其中所述氨基酸序列包含制癌蛋白M的信號肽。
14.權(quán)利要求9的CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含如圖7中所示位置+1的甲硫氨酸和位置+124的天冬氨酸。
15.權(quán)利要求9的CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含如圖7中所示位置-1的丙氨酸和位置+124的天冬氨酸。
16.權(quán)利要求11的CTLA4突變體分子，其中將所述人免疫球蛋白的恒定區(qū)突變，以包括如圖7中所示用絲氨酸取代的位置+130的半胱氨酸、用絲氨酸取代的位置+136的半胱氨酸、用絲氨酸取代的位置+139的半胱氨酸和用絲氨酸取代的位置+148的脯氨酸。
17.一種以比CTLA4更高的親和力與CD80和/或CD86結(jié)合的可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，其中在所述胞外結(jié)構(gòu)域中，如圖8中所示，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
18.一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼對應(yīng)于權(quán)利要求1的可溶性CTLA4突變體分子的氨基酸序列的核苷酸序列。
19.一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼對應(yīng)于權(quán)利要求9的可溶性CTLA4突變體分子的氨基酸序列的核苷酸序列。
20.權(quán)利要求18的核酸分子，所述核酸分子具有始于圖7或8所示的核苷酸位置+1的腺嘌呤且終止于+1071的腺嘌呤的核苷酸序列。
21.權(quán)利要求19的核酸分子，所述核酸分子具有始于圖7或8中所示核苷酸位置+1的腺嘌呤且終止于+1071的腺嘌呤的核苷酸序列。
22.權(quán)利要求18的核酸分子，所述核酸分子具有始于圖7或8中所示的-3的鳥嘌呤且終止于+1071的腺嘌呤的核苷酸序列。
23.權(quán)利要求19的核酸分子，所述核酸分子具有始于圖7或8中所示的-3的鳥嘌呤且終止于+1071的腺嘌呤的核苷酸序列。
24.一種載體，所述載體包含權(quán)利要求18-23中任一項的核苷酸序列。
25.一種載體，所述載體編碼L104EA29YIg，名為pD16L104EA29YIg且以ATCC No.PTA-2104保藏于ATCC。
26.一種在合適宿主細胞中包含權(quán)利要求24或25的載體的宿主載體系統(tǒng)。
27.權(quán)利要求26的宿主載體系統(tǒng)，其中所述合適的宿主細胞是細菌細胞或真核細胞。
28.一種宿主細胞，所述宿主細胞具有權(quán)利要求24或25的載體。
29.權(quán)利要求28的宿主細胞，所述宿主細胞是真核細胞。
30.權(quán)利要求29的宿主細胞，其中所述真核細胞是COS細胞。
31.權(quán)利要求29的宿主細胞，其中所述真核細胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
32.權(quán)利要求31的宿主細胞，其中所述CHO細胞選自DG44、CHO-K1、CHO-K1 Tet-On細胞系、名為ECACC 85050302的CHO、CHO克隆13、CHO克隆B、CHO-K1/SF和RR-CHOK1。
33.一種生產(chǎn)可溶性CTLA4突變蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求26的宿主載體系統(tǒng)，以在所述宿主細胞中產(chǎn)生所述CTLA4突變蛋白，并且回收如此產(chǎn)生的所述蛋白。
34.一種生產(chǎn)L104EA29YIg的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求28的宿主細胞，以在所述宿主細胞中產(chǎn)生L104EA29YIg，并且回收如此產(chǎn)生的所述蛋白。
35.一種按照權(quán)利要求33的方法生產(chǎn)的可溶性CTLA4突變蛋白。
36.一種按照權(quán)利要求34的方法生產(chǎn)的L104EA29YIg。
37.一種調(diào)節(jié)T細胞與CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞相互作用的方法，所述方法包括使所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞與權(quán)利要求1的可溶性CTLA4突變體分子接觸，以便形成CTAL4突變體分子/CD80復(fù)合體或CTAL4突變體分子/CD86復(fù)合體，所述復(fù)合體干擾所述T細胞與所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞之間的相互作用。
38.一種調(diào)節(jié)T細胞與CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞相互作用的方法，所述方法包括使所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞與權(quán)利要求9的可溶性CTLA4突變體分子接觸，以便形成CTAL4突變體分子/CD80復(fù)合體或CTAL4突變體分子/CD86復(fù)合體，所述復(fù)合體干擾所述T細胞與所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞之間的相互作用。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述可溶性CTLA4突變體分子包含CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，其中在所述胞外結(jié)構(gòu)域中，如圖8所示，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
40.權(quán)利要求37的方法，其中使所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞與所述可溶性CTLA4突變體分子的片段或衍生物接觸。
41.權(quán)利要求38的方法，其中使所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞與所述可溶性CTLA4突變體分子的片段或衍生物接觸。
42.權(quán)利要求37的方法，其中所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞是抗原呈遞細胞。
43.權(quán)利要求38的方法，其中所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞是抗原呈遞細胞。
44.權(quán)利要求37的方法，其中所述CTLA4陽性T細胞與所述CD80陽性細胞和CD86陽性細胞的相互作用被抑制。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述CTLA4陽性T細胞與所述CD80陽性細胞和CD86陽性細胞的相互作用被抑制。
46.一種治療由于T細胞與CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞相互作用而介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包括給予受治療者權(quán)利要求1的可溶性CTLA4突變體分子，以調(diào)節(jié)T細胞與所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞的相互作用。
47.一種治療由于T細胞與CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞相互作用而介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)疾病的方法，所述方法包括給予受治療者權(quán)利要求9的可溶性CTLA4突變體分子，以調(diào)節(jié)T細胞與所述CD80陽性細胞和/或CD86陽性細胞的相互作用。
48.權(quán)利要求46的方法，其中所述可溶性CTLA4突變體分子包含CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，其中在所述胞外結(jié)構(gòu)域中，如圖8所示，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
49.權(quán)利要求46的方法，其中所述T細胞相互作用被抑制。
50.權(quán)利要求47的方法，其中所述T細胞相互作用被抑制。
51.一種抑制受治療者的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括給予所述受治療者權(quán)利要求1的可溶性CTLA4突變體分子和一種與IL-4反應(yīng)的配體。
52.一種抑制受治療者的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括給予所述受治療者權(quán)利要求9的可溶性CTLA4突變體分子和一種與IL-4反應(yīng)的配體。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述可溶性CTLA4突變體包含CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域，其中在所述胞外結(jié)構(gòu)域中，如圖8所示，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
54.一種可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子由名為ATCC No.PTA-2104的核酸分子編碼。
55.一種編碼L104EA29YIg且具有ATCC No.PTA-2104的DNA序列。
56.一種可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子包含圖7的氨基酸序列。
57.一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利要求56的可溶性CTLA4突變體分子。
58.一種可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子以高于野生型CTLA4的親和力結(jié)合CD86。
59.一種可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子與CD80和/或CD86結(jié)合的解離速率比野生型CTLA4慢。
60.一種可溶性CTLA4突變體分子，所述突變體分子與CD80和/或CD86結(jié)合的締合速率和解離速率比野生型CTLA4慢。
61.一種由名為ATCC No.PTA-2104的核酸分子編碼的可溶性CTLA4突變體分子的部分，其中所述部分包含所述突變型CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域。
62.權(quán)利要求61的可溶性CTLA4突變體分子的部分，所述部分還包含一個Ig尾。
63.一種編碼可溶性CTLA4突變體分子且具有ATCC No.PTA-2104的核酸分子的部分，其中所述部分編碼所述突變型CTLA4分子的胞外結(jié)構(gòu)域。
64.權(quán)利要求63的核酸分子的部分，所述部分還包含編碼Ig尾的核酸分子。
65.一種用于治療免疫系統(tǒng)疾病的藥用組合物，所述藥用組合物包含一種藥學上可接受的載體和權(quán)利要求1的可溶性CTLA4突變體分子。
66.一種用于治療免疫系統(tǒng)疾病的藥用組合物，所述藥用組合物包含一種藥學上可接受的載體和權(quán)利要求9的可溶性CTLA4突變體分子。
全文摘要
本發(fā)明提供與CD80和/或CD86抗原結(jié)合的親和力高于野生型CTLA4或非突變型CTLA4Ig的可溶性CTLA4突變體分子。所述可溶性CTLA4分子具有一個包含CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域的第一氨基酸序列，其中S25－R33區(qū)和M97－G107區(qū)內(nèi)的某些氨基酸殘基被突變。本發(fā)明的突變體分子也可以包括增強所述突變體分子溶解性的第二氨基酸序列。
文檔編號C12N15/09GK1441810SQ01810145
公開日2003年9月10日 申請日期2001年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月26日
發(fā)明者R·J·皮奇, J·R·奈穆拉, P·S·林斯利, J·巴約拉斯 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司