專利名稱：生物傳感器標記基團的制作方法
生物傳感器標記基團
本發(fā)明涉及一類化合物，該類化合物特別被設計用作分析物如蛋 白質、肽、核酸和相關分子的共振拉曼光鐠法標記物，尤其是表面增
強的共振拉曼光謙(SERRS)標記物。在本發(fā)明的優(yōu)選的方面，這些化合 物除了其拉曼光譜性能以外，還具有適合于作為電化學傳感標記物的 第二用途的氧化還原性能。
當光從分子中散射時，大多數(shù)光子被彈性地散射。大部分散射的 光子具有與入射光子相同的能量(并且因此具有相同的頻率和波長)。 然而，小部分的光(每10'個光子中約1個)以與入射光子的頻率不同 的頻率散射。當散射的光子損失能量給所述分子時，它具有比入射光 子長的波長(稱為斯托克斯散射)。相反，當它獲得能量時，它具有更 短的波長(稱為反斯托克斯散射)；參見圖la。
導致這一非彈性散射的過程以于1928年首先描述這一過程的C. V. Raman先生命名，被稱為拉曼效應。這一過程與分子的振動、旋轉 或電子能量的變化有關，從光子轉移到分子上的能量通常以熱的形式 散失。入射光子和拉曼散射的光子之間的能量差等于散射分子的振動 態(tài)或者電子躍遷的能量，導致與入射激光存在量子化的能量差的散射 的光子。散射光的強度對能量或波長差的圖被稱為拉曼光i普，并且該 技術被稱為拉曼光譜法(RS)。
表面增強的拉曼光語法(SERS)是RS分析技術的改良。如果分子物 理地接近某些金屬表面，由于在分子和金屬的表面電子(等離子體振子) 之間的額外的能量轉移，可以極大地增加拉曼信號的強度。為了進行 SERS，將分析物分子吸附在原子糙化的金屬表面上，并檢測增強的拉 曼散射。
來自在金屬表面的數(shù)埃內的化合物或離子的拉曼散射可以是溶液 內的拉曼散射的1 03 - 1 06倍。對于近可見的波長來說，SERS在銀上最
強，但在金和銅上也可以容易地觀察到。最近的研究表明，各種過渡
金屬也可以給出有用的SERS增強。SERS效應基本上是在所述分子和 金屬表面附近的電磁場之間的共振能轉移。激發(fā)激光的電場矢量誘導 金屬表面內的偶極子，并且恢復力導致在這一激發(fā)的共振頻率下的振 蕩的電磁場。在瑞利極限內，這一共振主要由決定所謂的'等離子體 波長，的、在金屬表面的自由電子('等離子體振子，)的密度以及金屬 的介電常數(shù)及其環(huán)境決定。吸附在表面上或者表面近處的分子經(jīng)歷特 別大的電磁場，在該電磁場內，與表面垂直的振動模式被最強烈地增 強。這是表面等離子體振子共振(SPR)效應，它使得在等離子體振子和 靠近表面的分子之間可以發(fā)生穿過空間的能量轉移。表面等離子體振 子共振的強度取決于許多因素，包括入射光的波長和金屬表面的形態(tài)， 因為能量轉移的效率依賴于激光波長和金屬的等離子體波長之間的良 好匹配。
為了更進一步增加所述增強作用，可以使用生色團部分，以提供 有助于能量轉移的附加的分子共振，即一種被稱為表面增強的共振拉 曼光鐠法(SERRS)的技術。共振拉曼峰的強度與散射截面cc的平方成正 比。散射截面又與躍遷偶極矩的平方相關，因此通常遵循吸收光譜。 如果入射光子具有接近于在它們的吸收光語內的吸收峰的能量，則當 出現(xiàn)散射事件時，分子更可能處于激發(fā)態(tài)，從而增加反斯托克斯信號 的相對強度。表面和共振增強效應的結合意味著SERRS可以提供巨大 的信號增強，典型地比常規(guī)的拉曼光譜法強109-IO"倍。
除了拉曼散射的共振增強以外，最近描述了共振去增強 (resonance de—enhancement)，其中通過共振肯巨量轉移才幾理，拉曼4言 號的強度降低。在特定的條件下，能量上接近感興趣的能量的激發(fā)能 態(tài)可產(chǎn)生拉曼散射的降低。在這種情況下，拉曼強度與截面之和的平 方成正比，并且如果它們是相反符號的，則可發(fā)生相消干擾，導致觀 察到的共振去增強。這提供了在拉曼生物傳感體系中使用的替代量度 -通過使用促進這一去增強效應的激光頻率/吸收曲線，可以從拉曼光 譜中選擇性除去來自特定標記物的信號。本文中使用的術語"共振拉
曼光譜法"包括共振去增強。
Park等人(Journal of Orga訓etallic Chemistry 584 (1999) 140-146)公開了作為Pd-催化的烯丙型取代反應的手性配體的手性 l，-取代噁唑啉基二茂鐵的合成。在這一文獻的流程1中所示的合成涉 及1， l，-二溴二茂鐵、l-(l，-溴代二茂鐵)羧酸和1-溴-1，-(氯羰基)二 茂鐵的使用。
S ti nkel等人(Zei tschrif t fuer Naturforschung, B: Chemical Sciences (1993)， 48(5)， 583 - 590)公開了在環(huán)戊二烯基環(huán)上具有 一個附加官能團的一些三(羰基).(iV-環(huán)戊二烯基)合錳硫醚 (cymantrenethioether)的合成。所公開的化合物包括各種氯取代的三
(羰基).("5-環(huán)戊二烯基)合錳單-和雙-硫醚(以下稱為氯取代的三(羰
基).(V-環(huán)戊二烯基)合錳基硫醚)、[C5Cl4P(Ph)2]Mn(CO)3]和N，N，-雙 [(三羰基)(三氯(甲硫基)(thrimethylthio)環(huán)戊二烯基)合錳]-脲。
(l-氯-2-甲?；蚁┗?二茂鐵可得自Sigma-Aldrich。
現(xiàn)已了解，使用茂金屬基團作為其生色團的一系列分子可以用作 用于共振拉曼光譜法，尤其是生物傳感應用的標記物。為了與分析物 (優(yōu)選生物分子如肽、蛋白質、核酸或碳水化合物，生物分子的類似物， 或者生物分子的特異性結合配偶體) 一起使用，通過結合一個或更多個 卣素取代基(這導致拉曼散射峰的位移不同于由這樣的化合物通常產(chǎn) 生的那些位移)，來優(yōu)化所述分子的拉曼光譜性能。
茂金屬基團的存在提供了氧化還原中心，所述氧化還原中心使得 這些標記物還可用于電化學分析。
所述標記物可以被設計以與常規(guī)的肽結合化學相容，和/或可以被 取代以提供用于固定在傳感器表面上的表面結合官能度(由此在電極 上提供電化學活性的單層或提供拉曼散射的表面增強)，或者在自由溶 液內使用。
根據(jù)本發(fā)明，提供了在所附權利要求書中定義的標記物。 根據(jù)本發(fā)明，提供了共振拉曼光譜法標記物，它包括共價連接到
屬，這樣當所述標記物經(jīng)歷共振拉曼光鐠分析法時，所述卣素導致產(chǎn) 生特征性的拉曼峰。
本發(fā)明的標記物可以排除下述化合物(1-氯-2-曱?；蚁┗? 二茂鐵、l，l，-二溴二茂鐵、l-(l，-溴代二茂鐵)-羧酸、1-溴-1，-(氯羰 基)二茂鐵、[C5C14P (Ph) 2] Mn (CO) J和氯取代的三(羰基).(V-環(huán)戊二烯 基)合錳基硫醚。
所述反應性基團應當由除卣素以外的基團來提供。優(yōu)選地，所述 反應性基團不是卣素。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了共價連接到分析物上的共振拉曼光譜法標 記物，該標記物包含共價連接到茂金屬上的卣素，使得當所述標記物 經(jīng)歷共振拉曼光譜分析法時，所述卣素導致產(chǎn)生特征性的拉曼峰。
共價連接到分析物上的本發(fā)明的標記物可以排除下述化合物 N， N，-雙[(三羰基)(三氯(曱硫基)(thrimethylthio)環(huán)戊二烯基)合 錳]-脲。
茂金屬是含有過渡金屬離子的一類有機金屬絡合物，其中二茂鐵 于1951年首先被發(fā)現(xiàn)
目前，使用術語茂金屬來描述具有夾在兩個n 5-環(huán)戊二烯基(Cp) 配體之間的金屬離子(M)的絡合物
<formula>formula see original document page 9</formula>
金屬離子與Cp結合模型的端視圖
自從發(fā)現(xiàn)二茂鐵以來，已經(jīng)制備出許多種茂金屬，并且該術語已
二茂鐵
。臺
經(jīng)發(fā)展以包括很多種有機金屬結構，包括具有取代的Cp環(huán)的那些，實 例顯示了所有不同的可能的Cp結合模式， 一些彎曲的夾心結構，和甚 至半夾心或者單Cp絡合物。根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何或所有這些結構。
在本文中使用的術語"茂金屬"包括包含絡合到過渡金屬離子上 的環(huán)戊二烯基環(huán)的任何化合物。以下顯示了根據(jù)本發(fā)明可以使用的茂
金屬結構的優(yōu)選實例
M:過渡金屬離子E:雜原子 L:配體
因為一些茂金屬可以在一個或者兩個環(huán)內包括雜原子，因此本文 中使用的術語"環(huán)戊二烯基"包括其中環(huán)碳之一被雜原子如氮、硫、 硅或氧替代的環(huán)戊二烯基環(huán)。
大多數(shù)過渡金屬離子可以有多種氧化態(tài)，所以茂金屬能起氧化還 原中心的作用，并且因此在電化學研究中作為標記物是公知的。對于 大多數(shù)的d-區(qū)和鑭系元素來說，茂金屬化合物是可商購的，所以對于 選擇具有合適的氧化還原和光譜性能的化合物來說可以有很多種選
擇。優(yōu)選的茂金屬是其中過渡金屬離子是鈧、鈦、釩、鉻、錳、鐵、 鈷、鎳、銅或鋅過渡金屬離子的茂金屬。更優(yōu)選地，過渡金屬離子是 鈧、鈦、釩、鉻、鐵、鈷、鎳、銅或鋅過渡金屬離子。
多個卣素可以被共價連接到茂金屬上。每個卣素可以共價連接到 茂金屬的過渡金屬離子上，或者共價連接到茂金屬的環(huán)戊二烯基環(huán)上。 對于共振拉曼光譜法來說，在拉曼激發(fā)激光的光譜范圍內(典型地
這是紫外/可見/近紅外區(qū)域)，所述標記物應當具有至少一個強的吸收 峰。由于茂金屬含有過渡金屬離子，它們在光語的這一區(qū)域內典型地
顯示出由d軌道電子躍遷引起的強的吸收峰。它們是強烈著色的分子， 并且因此被預期是提供共振拉曼光鐠法所需要的生色團官能度的良好 候選基團。
對光譜標記物的一個關鍵要求是提供遭受最小背景干擾的光傳信 號。由于在拉曼光譜內的峰主要是由來自特定化學基團的振動模式引 起的，因此拉曼活性標記物應當理想地含有通常不存在于待分析樣品 內的化學基團。蛋白質樣品在這一區(qū)域內確實顯示出一些弱的峰(主 要是由半胱氨酸、二硫化物鍵和芳環(huán)引起的)，但這些峰比在光譜的 其余部分中的那些峰弱得多。對于典型的蛋白質來說，大多數(shù)拉曼散 射出現(xiàn)在800 - 1700cm—i區(qū)域內，在2000 - 3000cm—1區(qū)域內具有第二窗 o 。
圖lb中顯示了胰島素的拉曼光譜。胰島素具有相對高比例的二硫 化物鍵(在51個氨基酸分子內有三個二硫化物)。與光譜的其余部分相 比，500 -800cnT1的光譜區(qū)域是"平靜的"。因此這將是在其中從拉 曼活性的標記物獲得信號的優(yōu)異的窗口。
碳- 鹵素鍵在生物樣品內是極其稀少的，并且已知碳-鹵素鍵在 低于900cnfi的區(qū)域內導致強的拉曼發(fā)射峰。圖2中顯示了 2-鹵代乙 醇的拉曼光譜。由于存在鹵素原子導致的峰的強度從周期表往下按序 增力口。
圖2中所示的拉曼光鐠被歸一化到最高峰。在未取代的乙醇中， 這是由于在約2930cii^處的C-H鍵振動所致。確實，在2000 - 3000cm一1 區(qū)域內存在一系列的特征峰，這些峰是由于在所有化合物之間共享的 共同的C-H鍵組所致。由于由取代的分子內C-卣素鍵引起的峰的增加 的強度，這組峰看起來強度降低。在氟取代的分子內，C-卣素峰出現(xiàn)
在860cm—i處，具有與C-H峰大致相等的強度。在氯取代的分子中，這 一峰偏移到665cm—、且強度大約是C-H峰的1. 5倍。在溴取代的分子 中，峰在590cii^處并且具有2. 8倍大的強度，和在碘取代的分子中， 峰在520cnT處并且具有3倍大的強度。除了所述最強的峰以外，在卣 代乙醇光譜中，在低于800c(if1的區(qū)域內存在額外的峰，這些峰是由 C-閨素鍵的替代振動模式導致的。
圖3顯示了拉曼位移和C-卣素主峰相對于C-H主峰的強度。顯 然，主峰的位置和強度遵守周期表內卣素的順序。碘和溴在最低的拉 曼位移處給出最強的峰。然而，C-I峰位置非常接近在胰島素光譜內 在516cm—'處觀察到的二硫化物S - S峰，因此可能比C-Br峰(它占據(jù) 與胰島素光譜內的谷相同的區(qū)域)更容易受到來自蛋白質組分的背景 干擾。因此，對于標記蛋白質和肽來說，溴取代的基團是優(yōu)選的，盡 管任何閨素都將給出可接受的結果。
為了使共振效應最大化，在導致生色團吸收特征的電子和在其振 動導致拉曼散射光子的能量位移的化學鍵內涉及的那些電子之間應當 存在強的相互作用。這樣的安排將確保在來自激發(fā)態(tài)生色團的電子躍 遷和來自拉曼活性振動模式的能量躍遷之間存在強的耦合。如果一個 或更多個鹵素原子直接取代在Cp環(huán)上，或者僅通過少量的居間原子 (優(yōu)選單個原子，更優(yōu)選單個碳、硅或氮原子)或通過具有離域電子體 系的基團連接到Cp環(huán)上，則存在形成分子軌道的可能性，在所述分子 軌道內過渡金屬電子也被包含在連接到囟素原子的化學鍵內。
例如，完全溴取代的二茂鈷
的最高已占分子軌道和最低未占分子軌道顯示，它們在分子的大 多數(shù)原子上離域(參見圖4a)。電子分別被在鈷離子、所有IO個碳原
子和IO個溴原子中的4或6個溴原子之間共享。HOMO和LUMO在C-Br鍵上均顯示出反鍵特征。如果入射激光激發(fā)這些電子進入更高的能 態(tài)，則C-Br鍵的振動特征也將被改變，從而提供用于共振拉曼信號 的有效的能量偶聯(lián)機理。
對于三溴甲基二茂鈷來說，觀察到了類似的效果(圖4b)。即使溴 原子與Cp環(huán)被碳原子隔開，分子軌道顯示電子在整個分子上離域，并 且因此在生色團和分子的拉曼活性區(qū)域之間存在有效的耦合。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，多個閨素共價連接到茂金屬上，使 得當所述標記物(優(yōu)選SERRS標記物)經(jīng)歷共振拉曼光譜分析法(優(yōu)選 SERRS)時，產(chǎn)生特征性的拉曼峰信號。所述多個卣素可以包括不同的 卣素。這樣的實施方案可以被用于多種不同分析物的同時的共振拉曼 光傳檢測，每種不同的分析物用不同的本發(fā)明標記物標記。應該理解， 通過合適地選擇茂金屬內的過渡金屬和卣素取代方案，使得每一標記 物產(chǎn)生可區(qū)別于其它標記物的特征拉曼峰信號的特征拉曼峰信號，可 以調節(jié)標記物的共振拉曼光i普特征。鑒于可以制造的不同標記物的龐 大數(shù)量，原則上這樣的實施方案可以被用于檢測非常大數(shù)量的不同分 析物(可能超過49種分析物)。
本發(fā)明的標記物可以被用于通過共振拉曼光謙法檢測樣品內 一種 目標化合物或者多種目標化合物的存在或量。目標化合物可以是分析 物(即，在目標化合物用本發(fā)明的標記物直接標記的情況)，或者分析 物可以被用于指示樣品內目標化合物的存在或量(例如，通過特異性鍵 合到目標化合物上，或者通過是目標化合物類似物，該目標化合物類 似物因目標化合物的存在而被從目標化合物結合物種中置換出來)。
合適的目標化合物的實例包括生物分子(例如蛋白質、核酸、碳 水化合物、蛋白多糖、類脂或激素)，藥物或其它治療劑及它們的代謝 物，濫用的藥物(例如苯丙胺、鴉片制劑、苯并二氮蕈類、巴比妥類藥 物、大麻素、可卡因、LSD及它們的代謝物)，炸藥(例如硝基甘油和 硝基甲苯，包括TNT、 RDX、 PETN和HMX)，和環(huán)境污染物(例如除草劑、 殺蟲劑)。
樣品是希望測試目標化合物的存在或量的任何樣品。存在希望測 試目標化合物的存在或量的許多情況。實例包括臨床應用(例如檢測在 生物樣品如血液或尿液樣品內抗原的存在)，檢測濫用的藥物的存在 (例如在違法樣品或生物樣品如體液或呼吸樣品內)，檢測炸藥，或者 檢測環(huán)境污染物(例如在液體、空氣、土壤或植物樣品內)。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，分析物是生物分子，生物分子的特 異性結合配偶體，或可以被生物分子的特異性結合配偶體特異性地鍵 合的生物分子的類似物。特異性結合配偶體可以是特異性地識別生物 分子的抗體。或者，特異性結合配偶體可以是設計用于特異性地雜交 到目標核酸上(典型地在苛刻的雜交條件下)的核酸探針。小分子底物 類似物也可能適合于按照本發(fā)明標記，使得能進行電化學監(jiān)測，所述 小分子底物包括代謝物、類脂、磷脂和非肽激素。
此處使用的術語"特征拉曼峰，，是指由囟素的存在引起的拉曼峰，
時二目標化合:)的樣品經(jīng)歷共振拉曼光譜分析法時所產(chǎn)、i的其它拉 曼峰以及背景。
連接到茂金屬上的反應性基團優(yōu)選包括可與分析物直接反應的基 團。在分析物是肽或蛋白質的情況下，優(yōu)選反應性基團包括羧酸基。 在分析物是核酸的情況下，優(yōu)選反應性基團包括胺基。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，標記物與常規(guī)的肽結合化學相容。 常規(guī)的肽合成化學典型地涉及按序添加氨基酸基團到增長的鏈中。該
鏈攜帶數(shù)個保護基，以掩蓋任何反應性官能團，僅在N-端留下一個反 應性胺。通過使這一胺與單一羧酸基(帶有掩蓋它可能含有的任何額外 的反應性羧酸鹽基的類似保護基)反應來生成肽鍵，從而添加后續(xù)的氨 基酸。在所述偶聯(lián)過程中，典型地通過使該單一羧酸與偶聯(lián)劑，例如 N-[(lH-苯并三唑-l-基)(二甲基氨基)亞曱基]-N-曱基曱銨六氟磷酸 鹽N-氧化物(HBTU) 、 N，N，-雙環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 7-氮雜苯并三唑 -l-基-N-氧-三(吡咯烷基)鱗六氟磷酸鹽(PyA0P)或類似分子綴合，來 活化所述單一羧酸。因此，用于標記肽或蛋白質的本發(fā)明的SERRS標
記物要求單一的反應性羧酸基，以使得可以使用常規(guī)的肽合成化學(并 且事實上用在常規(guī)的自動化肽合成儀中)將它連接到肽上。另外，它必 須不含有任何將干擾這一 綴合反應的潛在活性的位點。含有單 一反應 性羧酸基團的茂金屬化合物可以容易地合成，因此與常規(guī)的肽合成技 術相容。
根據(jù)本發(fā)明，還提供了共振拉曼光語法標記物，所述標記物包含
共價連接到閨素上的茂金屬。優(yōu)選地，卣素直接取代在茂金屬的Cp 環(huán)上，或者僅通過一個原子連接到Cp環(huán)上。根據(jù)本發(fā)明，進一步提供
了共價連接到卣素上的茂金屬作為共振拉曼光語法標記物的用途。當 所述標記物經(jīng)歷共振拉曼光譜分析法時，所述卣素應當導致產(chǎn)生特征 拉曼峰?？梢杂杀景l(fā)明的標記物提供共價連接到卣素上的茂金屬。
茂金屬基團的存在提供了氧化還原中心，所述氧化還原中心使得 本發(fā)明的標記物還可以用于電化學分析。電化學標記物需要容易接受 和給出電子，以便可以通過電化學技術如循環(huán)伏安法、電流分析法和 線性掃描伏安法檢測。在各種不同的氧化態(tài)下，茂金屬中的過渡金屬 離子通常能夠維持穩(wěn)定的茂金屬結構，因此可容易地通過電化學方法 檢測。過渡金屬離子和鍵合到其上的配體的性質的精確選擇將影響該 基團整體的氧化還原電勢，因此通過仔細選擇這些組分，微調氧化還 原電勢是可能的。
本發(fā)明的標記物可以被用作電化學標記物，來標記酶反應的底物 (優(yōu)選肽底物)，使得可以電化學監(jiān)測該反應。在這樣的實施方案中， 可以用本發(fā)明的標記物(即用共價連接到鹵素上的茂金屬)，(共價或非 共價地)涂布用于電化學監(jiān)測所述反應的電極，以在電極上提供保護 層，所述保護層將防止或減少酶在電極表面上的變性。
在其它實施方案中，本發(fā)明的標記物可以在電化學傳感分析中用 作電化學介體，以將電子從電極轉移到希望電化學監(jiān)測的反應的組分 (例如酶或底物)上。所述標記物在溶液內可以是游離的?；蛘?，所述
價
電極上。在標記物被固定到電極上的情況下，這將在電極上提供電化 學活性的層。如果反應組分包含肽或蛋白質，則所述電化學活性的層 可以提供一種保護層，該保護層防止或減少蛋白質在電極表面上的變性。
根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案，可以使用電極來改變本發(fā)明的標記
物的氧化還原態(tài)，并由此影響所述標記物在共振拉曼光i脊法中的可視 性。這提供了對所述標記物的可視性的電子控制。這尤其可用于其中
通過改變標記物的可視性，可以簡化樣品的拉曼光語。
在許多情況下，希望將標記物固定在電極(典型地金屬電極)的表
面上或者提供拉曼表面增強的表面(SERRS表面)上。SERRS表面優(yōu)選是
金屬，典型地為金、銀或銅。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種共振拉曼光譜法標記物，它包含共價連
接到用于將標記物共價連接到分析物上的反應性基團、SERRS表面結
合基團和鹵素上的茂金屬，其中所述卣素與茂金屬的連接使得當該標
記物經(jīng)歷共振拉曼光語分析法時，所述面素導致產(chǎn)生特征拉曼峰。 根據(jù)本發(fā)明，還提供了 SERRS標記物，它包含共價連接到囟素和
SERRS表面結合基團上的茂金屬。根據(jù)本發(fā)明，進一步提供了共價連
所述SERRS標記物可以由包含SERRS表面結合基團的本發(fā)明標記物提 供。
SERRS表面結合基團對SERRS表面的結合常數(shù)優(yōu)選是樣品內目標 化合物的天然存在濃度的至少一半。
有數(shù)種已知提供金屬結合特性的官能團，其中大多數(shù)官能團通過 孤電子對(常常來自氮或氧原子)或者共價鍵(典型地來自疏醇或硫醇 鹽基團)與金屬形成化學鍵。硫醚基團(例如-SMe基團或-SPh基團)或 -PPh2基團不被認為是SERRS表面結合基團。在茂金屬內的Cp環(huán)可以 用合適的基團取代，以提供金屬結合官能度。當標記物用于標記肽或 蛋白質分析物時，應當選擇這一基團，使得它與用于標記分析物的肽 結合化學相容(即，它不應當含有游離羧酸根或電子密度非常大的基
本發(fā)明的標記物可以被用在使用共振拉曼光譜法的已知檢測方法 中，以檢測樣品內的一種目標化合物或者多種目標化合物的存在或量。
優(yōu)選的方法是SERRS置換分析，尤其SERRS置換免疫分析。
按照優(yōu)選的SERRS置換分析，將樣品暴露于一種絡合物下，該絡 合物包含被固定的目標化合物結合物種(它能夠特異性地結合目標化 合物)和共價連接到分析物及SERRS表面結合基團上的本發(fā)明的標記 物。所迷標記物的分析物是目標化合物的類似物，使得所述目標化合 物結合物種特異性地結合到所述標記物的分析物部分上。如果目標化 合物存在于樣品內，則這將從目標化合物結合物種中置換所述標記物。 將任何被置換的標記物暴露于SERRS表面，并使其通過SERRS表面結 合基團結合到所述表面上。然后可以通過SERRS檢測被置換的標記物。 優(yōu)選地，SERRS置換分析是SERRS置換免疫分析，其中目標化合 物結合物種是特異性地識別目標化合物的抗體(或抗體片段或衍生 物)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的標記物的環(huán)戊二烯基環(huán)具有下述結構<formula>formula see original document page 17</formula>
其中 ^ 一
R,是分析物或者用于共價連接到分析物上的反應性基團； R2、 R3、 114和Rs獨立地為X或YRxRyR" Y是C、 Si或N;
Rx、 Ry和Rz獨立地為X或H;和 X是鹵素；
任選，R2-Rs之一是金屬結合基團；
任選地，環(huán)碳之一被雜原子(優(yōu)選氮、硫、硅或氧)替代;
條件是R2 - R5中的至少一個包含X。
此處僅顯示了環(huán)戊二烯基環(huán)的結構。標記物的其余部分可以包含 以上所示的任何茂金屬結構。
或者，優(yōu)選地，本發(fā)明的標記物包含具有下述結構的第一環(huán)戊二
烯基環(huán) 一
其中R，、R，2、 R，3、 R，4和R，s獨立地為X或YRxRyRz;
Y是C、 Si或Nj
Rx、 Ry和RJ蟲立地為X或H;和
X是鹵素；
任選地，環(huán)碳之一被雜原子(優(yōu)選氮、硫、硅或氧)替代; 條件是R，i - R，5中的至少一個包含X; 和具有下述結構的第二環(huán)戊二烯基環(huán) 一
其中R，、是分析物或者用于共價連接到分析物上的反應性基團， 并且任選地，R，^-R"5之一包含金屬結合基團。
優(yōu)選的金屬結合基團的一個實例是苯并三唑基。 本發(fā)明的優(yōu)選方面是
1) 使用茂金屬基團作為共振拉曼光譜法的生色團。
2) 結合一個或更多個卣素取代基，以產(chǎn)生與由蛋白質和肽或者由 核酸或碳水化合物或其它生物分子產(chǎn)生的那些拉曼散射峰不同的拉曼 散射峰。
3) 通過合適地選擇茂金屬基團內的過渡金屬和取代方案，調節(jié)共 振拉曼光語的特征。4) 所述標記物作為用于電化學分析的氧化還原活性基團的第二用途。
5) 所述標記物的官能化，以使得可以使用常規(guī)的肽結合化學連接 到肽上。
6) 所述標記物的官能化，以提供用于表面固定的金屬結合和隨之 發(fā)生的用于拉曼散射的表面增強和/或在電極表面上形成單層。
在本發(fā)明的其它方面中，本發(fā)明的標記物可以包含共價連接到除 了卣素以外的基團上的茂金屬，當所述標記物經(jīng)歷共振拉曼光譜分析 法時，所述除了卣素以外的基團將導致產(chǎn)生特征拉曼峰(即不同于分析 物或目標化合物所產(chǎn)生的拉曼峰的峰)。
在以下實施例中參考附圖描述了本發(fā)明的實施方案，其中 圖la示意性地顯示了斯托克斯和反斯托克斯散射的光子的能量 變化；
圖lb顯示了胰島素的拉曼光譜(C. Ortiz等人(2004)， Anal. Biochem. 332; 245-252);
圖2顯示了乙醇和2-鹵代乙醇的拉曼光譜；
圖3顯示了拉曼位移和(:-卣素主峰相對于C-H主峰的強度；
圖4a顯示了 1，2，3，4，5，r，2，，3，，4，，5'-十溴二茂鈷(10-BrCc)的
最高已占(上方)和最低未占(下方)分子軌道；
圖4b顯示了三溴甲基二茂鈷的最高已占(上方)和最低未占(下方)
分子軌道；
圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案的標記物；
圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案的標記物(染料
A) 的化學結構；
圖7顯示了染料A的UV/可見吸收光譜； 圖8顯示了染料A的SERRS光譜；
圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案的標記物(染料
B) 的化學結構；
圖IO顯示了染料B的SERRS光譜；


圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案的肽綴合物的
化學結構；和
圖12顯示了圖11所示的肽綴合物的SERRS光譜。 實施例1
圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案的標記物，該標記物 還具有氧化還原性能，該氧化還原性能適合于作為用于電化學傳感的 標記物的第二用途。溴取代的二茂鈷，其中一個Cp環(huán)被取代以攜帶用 于肽綴合的游離的羧酸根，并且另一個Cp環(huán)被硫代曱基取代，以提供 金屬結合。與Cp結合的鈷離子提供了生色團和氧化還原中心特征，并 且與環(huán)結合的溴在不應當遭受來自肽或蛋白質(標記物可連接于其上) 的顯著千擾的光譜區(qū)域內提供拉曼散射峰。
實施例2
染料A
圖6顯示了被稱為染料A的本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案的化學結 構。圖7顯示了染料A的UV/可見吸收光語。在光鐠中從 400到550nm 可以觀察到一個寬峰。從這一點上將可以明白，這一化合物(及其衍生 物)適合于與各種可見波長的激光一起使用。在355、 430、 457、 473、 501、 514、 523、 532、 556和561nm的波長處可以獲得合適的可商購 的激光。圖8顯示了染料A的SERRS光譜。在<1100波數(shù)處存在染料A 的溴引起的特征拉曼峰。
實施例3
染料B
圖9顯示了被稱為染料B的本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案的化學結 構。它包含用作SERRS表面結合基團的苯并三唑基。圖IO顯示了染料 B的SERRS光鐠。在<1100波數(shù)處存在染料B的溴引起的特征拉曼峰。
實施例4
肽綴合物
圖11顯示了被稱為"肽綴合物"的本發(fā)明另一個優(yōu)選實施方案的 化學結構。在這一化合物中，苯并三唑基(它用作SERRS表面結合基團)通過一個連接基團共價連接到茂金屬的Cp環(huán)上，所述連接基團已經(jīng)與 肽(序列GGVYLLPRRGPR(SEQ ID N0:1))反應。圖12顯示了所述肽綴合 物的SERRS光鐠?？梢杂^察到由所述肽引起的光鐠背景，但由溴引起 的特征拉曼峰存在在〈1100波數(shù)處，并且可以與光傳背景區(qū)別開。
權利要求
1.共振拉曼光譜法標記物，它包含共價連接到用于將所述標記物共價連接到分析物上的反應性基團、SERRS表面結合基團和鹵素上的茂金屬，其中所述鹵素與所述茂金屬的連接使得當所述標記物經(jīng)歷共振拉曼光譜分析法時，所述鹵素導致產(chǎn)生特征性的拉曼峰。
2. 共振拉曼光譜法標記物，它包含共價連接到用于將所述標記物 共價連接到分析物上的反應性基團和卣素上的茂金屬，其中所述卣素 共價連接到茂金屬的環(huán)戊二烯基環(huán)[如本文所定義]上，使得當所述標 記物經(jīng)歷共振拉曼光譜分析法時，所述卣素導致產(chǎn)生特征性的拉曼峰， 但是排除(l-氯-2-甲?；蚁┗?二茂鐵、l，l，-二溴二茂鐵、l-(l，-溴代二茂鐵)-羧酸、l-溴-l，-(氯羰基)二茂鐵、[C5Cl4P(Ph)2]Mn(CO)3] 和氯取代的三(羰基).(Tl5-環(huán)戊二烯基)合錳基硫醚。
3. 共價連接到分析物上的共振拉曼光鐠法標記物，該標記物包含 共價連接到茂金屬上的卣素，使得當所述標記物經(jīng)歷共振拉曼光譜分 析法時，所述卣素導致產(chǎn)生特征性的拉曼峰，但是排除N，N，-雙[(三 羰基)(三氯(甲硫基)(thrimethylthio)-環(huán)戊二烯基)合錳]-脲。
4. 權利要求2或3的標記物，其中所述茂金屬共價連接到表面增 強的共振拉曼光鐠法(SERRS)表面結合基團上。
5. 權利要求1或3的標記物，其中所述卣素共價連接到茂金屬的 環(huán)戊二烯基環(huán)[如本文所定義]上。
6. 權利要求1或3的標記物，其中所述卣素共價連接到茂金屬的 過渡金屬離子上。
7. 權利要求2或5的標記物，其中所述面素直接共價連接到環(huán)戊 二烯基環(huán)的環(huán)原子上。
8. 權利要求2或5的標記物，其中所述鹵素通過碳、硅或氮原子 共價連接到環(huán)戊二烯基環(huán)上。
9. 權利要求2或5的標記物，其中所述鹵素通過包含離域電子體 系的基團共價連接到環(huán)戊二烯基環(huán)上。
10. 前述任何一項權利要求的標記物，其中多個卣素共價連接到茂金屬上，使得當所述標記物經(jīng)歷共振拉曼光鐠分析法時產(chǎn)生特征性 的拉曼峰信號。
11. 權利要求10的標記物，其中所述多個卣素包括不同的卣素。
12. 前述任何一項權利要求的標記物，其中所述環(huán)戊二烯基環(huán)具 有下述結構其中<formula>formula see original document page 3</formula>Ri是分析物或者用于共價連接到分析物上的反應性基團； R2、 R3、 l和Rs獨立地為X或YRxRyRz; Y是C、 Si或N;Rx、 Ry和Rz獨立地為X或H;和 X是鹵素；任選地，R2-R5之一是金屬結合基團；任選地，環(huán)碳之一被雜原子(氮、硫、硅或氧)替代；條件是R2 - R5中的至少一個包含X。
13. 前述任何一項權利要求的標記物，其中所述分析物是生物分 子，生物分子的類似物，或者生物分子的特異性結合配偶體。
14. 權利要求13的標記物，其中所述生物分子是肽、核酸或碳水 化合物。
15. 權利要求13的標記物，其中所述生物分子的特異性結合配偶 體是抗體或核酸。
16. 權利要求1或2的標記物，其中所述反應性基團包括用于與 肽分析物反應的羧酸基，或者用于與核酸分析物反應的胺基。
17. 前述任何一項權利要求的標記物，其中可以改變所述標記物 的氧化還原態(tài)，以影響所述標記物在共振拉曼光鐠法中的可視性。
18. 用于通過共振拉曼光譜法檢測多種不同分析物的多種不同標 記物，其中每種不同的標記物如前面任何一項權利要求所述，并且所 述每種不同的標記物在經(jīng)歷共振拉曼光鐠法時產(chǎn)生特征性的拉曼峰信 號，所述特征性的拉曼峰信號可以被用于區(qū)分該標記物與其它標記物。
19. 多種不同標記物用于通過共振拉曼光譜法檢測多種不同分析 物的用途，其中每一種標記物如權利要求1-17中任何一項所述。
20. 共價連接到閨素上的茂金屬作為共振拉曼光傳法標記物的用途。
21. 權利要求20的用途，其中所述卣素直接取代在茂金屬的環(huán)戊 二烯基環(huán)上，或者通過單一原子連接到環(huán)戊二烯基環(huán)上。
22. 權利要求20或21的用途，其中由權利要求1-17任何一項 所述的標記物提供所述共價連接到閨素上的茂金屬，或者由(l-氯-2-甲?；蚁┗?二茂鐵、l，l，-二溴二茂鐵、l-(l，-溴代二茂鐵)-羧酸、 l-溴-l，-(氯羰基)二茂鐵、[C5Cl4P(Ph)2]Mn(CO)3]、氯取代的三(羰 基)，("5-環(huán)戊二烯基)合錳基硫醚或N，N，-雙[(三羰基)(三氯(曱硫 基)(thrimethylthio)-環(huán)戊二烯基)合錳]-脲提供所述共價連接到卣 素上的茂金屬。
23. 作為SERRS標記物的權利要求20或21的用途，其中SERRS表面結合基團還共價連接到所述茂金屬上。
24. 權利要求23的用途，其中由權利要求1或4 - 17中任何一項 所述的標記物來提供所述共價連接到卣素和SERRS表面結合基團上的 茂金屬。
25. 共價連接到囟素上的茂金屬作為標記物或者電化學傳感用電 化學介體的用途。
26. 權利要求25的用途，其中由權利要求1-17任何一項所述的 標記物提供所述共價連接到卣素上的茂金屬，或者由(l-氯-2-曱?；?乙烯基)二茂鐵、1，1，-二溴二茂鐵、1-(i，-溴代二茂鐵)-羧酸、l-溴 -1，-(氯羰基)二茂鐵、[C5Cl4P(Ph)2〗Mn(CO)3]、氯取代的三(羰基).(V-環(huán)戊二烯基)合錳基硫醚或N，N，-雙[(三羰基)(三氯(曱硫 基)(thrimethylthio)-環(huán)戊二烯基)合錳]-脲提供所述共價連接到鹵 素上的茂金屬。
27. 權利要求25或26的用途，其中所述茂金屬還共價連接到用于將茂金屬固定到金屬電極上的金屬結合基團上。
28. 權利要求27的用途，其中所述金屬結合基團是SERRS表面結合基團。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類化合物，該類化合物特別被設計用作分析物如蛋白質、肽、核酸和相關分子的共振拉曼光譜法標記物，尤其是表面增強的共振拉曼光譜法(SERRS)標記物。本發(fā)明的共振拉曼光譜法標記物包含共價連接到用于將所述標記物共價連接到分析物上的反應性基團、SERRS表面結合基團和鹵素上的茂金屬，其中所述鹵素與所述茂金屬的連接使得當所述標記物經(jīng)歷共振拉曼光譜分析法時，所述鹵素導致產(chǎn)生特征性的拉曼峰。在優(yōu)選的方面中，所述標記物還具有適合于作為電化學傳感標記物的第二用途的氧化還原性能。
文檔編號G01N33/58GK101189521SQ200680016072
公開日2008年5月28日 申請日期2006年3月9日 優(yōu)先權日2005年3月9日
發(fā)明者R·吉爾伯特 申請人:E2V生物傳感器有限公司