專利名稱：人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列。
背景技術(shù)：
胃癌是我國引起死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤，化療是當(dāng)前治療胃癌的主要手段之一，但其治療效果仍無重大進(jìn)展，其主要原因就是胃癌細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥。腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multi-drug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對某一化療藥物產(chǎn)生耐藥后，對其它化學(xué)結(jié)構(gòu)及機(jī)理不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。
目前的研究表明，腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的產(chǎn)生主要與以下機(jī)制有關(guān)1.發(fā)生在細(xì)胞膜水平的藥物攝取減少和外排增多，引起細(xì)胞內(nèi)藥物的絕對濃度降低，如由P-糖蛋白引起的耐藥；2.發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器水平的藥物亞細(xì)胞分布的改變，使藥物無法接近其作用靶點，引起藥物有效濃度降低；3.藥物靶點在質(zhì)和量的改變，如拓?fù)洚悩?gòu)酶II表達(dá)降低，減弱了以此酶為靶點的藥物的細(xì)胞毒性；4.細(xì)胞解毒系統(tǒng)功能加強(qiáng)，使藥物迅速滅活，如與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)有關(guān)的耐藥等。這些機(jī)制多是共同起作用，其中腫瘤細(xì)胞上某些膜蛋白的過多表達(dá)是產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因。目前發(fā)現(xiàn)的與多藥耐藥有關(guān)的膜蛋白有三種P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、多藥耐藥蛋白(multidrug resistance protein，MRP)、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白(Breastcancer resistance protein，BCRP)，這三種膜蛋白在腫瘤細(xì)胞膜上行使著“分子泵”的功能，即將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)“泵”出，使腫瘤細(xì)胞免受化療藥物的殺傷(NatureBiotechnology.2000；18SupplIT18-20)。
目前人們針對腫瘤細(xì)胞膜上已知的耐藥相關(guān)分子采用單克隆抗體及單鏈抗體(scFv)進(jìn)行腫瘤耐藥程度及預(yù)后的判斷，以及腫瘤耐藥細(xì)胞的靶向及逆轉(zhuǎn)耐藥治療，如抗P-gp單克隆抗體MRK-16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992；895824-5829；JControl Release 2001；77(1-2)77-86)能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，而抗FAS(Urology 2001；57(5)993-998)單克隆抗體則能明顯提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度。但單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)以及生物工程抗體等。但單抗有難以克服的缺陷，如免疫原性較強(qiáng)、相對缺乏C區(qū)依賴的功能效應(yīng)及穿透能力較弱等。雖然ScFv具有分子量較小，免疫原性弱，滲透力強(qiáng)，并可用于藥物導(dǎo)向，中和毒素等優(yōu)點，但其無抗體C區(qū)，不能介導(dǎo)抗體的其它生物學(xué)效應(yīng)。目前篩選到的單克隆抗體及單鏈抗體(scFv)治療只是針對已知的膜表面耐藥分子，如P-gp、MRP、BCRP等，而且用來篩選相應(yīng)抗體及單抗的分子是人工表達(dá)或合成純化的分子，其構(gòu)象及功能表位特征與細(xì)胞表面生理狀態(tài)下的分子還有一定的差異。而且對于表達(dá)和純化困難的細(xì)胞膜表面抗原難以進(jìn)行相關(guān)配體的篩選。
目前耐藥逆轉(zhuǎn)治療的效果還不理想，其主要原因之一還在于有很多與耐藥相關(guān)的分子尚未被發(fā)現(xiàn)，其中包括很多膜表面耐藥分子。我們知道在耐藥腫瘤細(xì)胞膜表面存在著與藥敏腫瘤細(xì)胞不同的膜分子表達(dá)譜，或者一些膜分子在耐藥細(xì)胞的構(gòu)象發(fā)生改變，這些膜分子的改變都是腫瘤細(xì)胞在化療藥物持續(xù)存在的壓力下，為對抗化療藥物對細(xì)胞的作用而被誘導(dǎo)表達(dá)的，發(fā)生這些改變的膜分子與腫瘤細(xì)胞的耐藥存在著必然的聯(lián)系。因此尋找能夠特異性結(jié)合及改變這些耐藥相關(guān)膜分子生物學(xué)功能的配體，對于逆轉(zhuǎn)耐藥的治療以及胃癌耐藥相關(guān)分子的研究都有重要的現(xiàn)實及理論意義。而目前篩選逆轉(zhuǎn)耐藥配體的策略只能是針對已知膜表面的耐藥分子，無法直接找到未知的膜表面耐藥分子的配體。
鑒于目前尋找耐藥腫瘤細(xì)胞靶向及逆轉(zhuǎn)治療分子中存在的不足，我們采用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選完整的活的腫瘤耐藥細(xì)胞，可以篩選到與生理狀態(tài)下細(xì)胞膜表面分子結(jié)合的多肽，可以找到未知耐藥相關(guān)分子的配體。多肽分子分子量更小，穿透能力強(qiáng)，沒有抗原性，可具有生物活性的特點，更適合在體內(nèi)應(yīng)用。
用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)肽庫篩選完整的細(xì)胞，對于細(xì)胞表面分子復(fù)雜多變的腫瘤細(xì)胞尤其適合(Curr Opin Chem Biol.2000 Feb；4(1)16-21)。噬菌體隨機(jī)肽庫活細(xì)胞篩選有很多優(yōu)勢，首先不要求預(yù)先確定目的的受體；除了篩選結(jié)合的受體外，還可以篩選內(nèi)化的受體。Johnston和其同事用這種方法獲得了表達(dá)20肽的噬菌體不但能夠和纖維母細(xì)胞結(jié)合，并且能夠內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞(Nat Genet 2001 Jan；27(1)6-8)。Hartley O等應(yīng)用噬菌體肽庫成功地篩得與表達(dá)在CHO-CCR5細(xì)胞及HEK-CCR5細(xì)胞表面的CCR5特異性結(jié)合的多肽(J Virol.2003 Jun；77(12)6637-44)。已知技術(shù)利用噬菌體隨機(jī)肽庫體內(nèi)篩選到了與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽，申請?zhí)?00510042810.4的專利申請，利用噬菌體隨機(jī)肽庫體外消減篩選胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，得到了與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽。這表明以活細(xì)胞作為篩選靶標(biāo)可以篩得能與細(xì)胞膜表面分子特異結(jié)合的多肽配基。但是200510042810.4的專利只是簡單的篩選與細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，并沒有針對性的篩選對細(xì)胞功能有影響的多肽。而本研究篩選的方法中加入了針對細(xì)胞功能的篩選，比其的優(yōu)勢在于能夠直接篩選到對腫瘤細(xì)胞耐藥功能有影響的多肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，它利用噬菌體多肽篩選全細(xì)胞能夠同時篩選腫瘤耐藥細(xì)胞膜上所有特異性表達(dá)分子的配體，并通過功能篩選直接得到有生物活性的能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥細(xì)胞耐藥特性的多肽，同時提供一種人胃癌多藥耐藥細(xì)胞特異性結(jié)合及具有逆轉(zhuǎn)耐藥特性，生物活性短肽及其序列(GMBPs)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它通過噬菌體隨機(jī)肽庫聯(lián)合MTT體外藥敏試驗篩選，得到能夠逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞耐藥特性的噬菌體克隆多肽，其能夠降低胃癌耐藥細(xì)胞在化療藥物作用下的生存率和IC50值，并有統(tǒng)計學(xué)差異的克隆(p＜0.05)。
所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽序列選擇下列序列之一GMBP1 E T A P L S T M L S P YGMBP2 T T F S P P S P L S S I；GMBP3 F N N H Y P A A A T Y P；GMBP4 E V F W P L N A P R L L；GMBP5 S WQ I P Y P I S P R S；GMBP6 K T A P T P Y A L V H D；GMBP7 S N F M H N T R I W S H；GMBP8 S W Q I T Y P I S P R S；GMBP9 A W T W V L P S S I R A；GMBP10T D S Y H V A S A R Q P；GMBP11S T Y S H P L S L R P D；GMBP12Y T T W P F T S L Q L D；GMBP13A F M E T T S Q N A W L；GMBP14E T A P P T P Y S V M F；GMBP15T T F N P L Y L R L D T；GMBP16S S F P Q V I P L D Y L；GMBP17A P K Y S L S D L Y L N；GMBP18Q I E K I S Q H L D M H；GMBP19T W N Q P Y I P P L Y P；GMBP20Y A S P P N P S L R L T；GMBP21Y H G L T P V R Y V S V；GMBP22Y T F M P E L T T P R T；GMBP23N S F N Y A P L L M P R；GMBP24T S P Y H L L H A H L Q；GMBP25S S F V A L S I S P S M；GMBP26A N L S S H S S P G D S；GMBP27T T L Q F T G Q T N K T；GMBP28T P P P R D A S L S R W；GMBP29H N I G T W G P K S H L；GMBP30S G F F E P Q H S H P L；GMBP31Q I E E S F V R G H T T；GMBP32S P Q T D G L V S T P S；GMBP33Y T F D P Q I R P A G L；GMBP34Y E R S I L P F S H V F；GMBP35Y P S V T F P T Q T L L；GMBP36A S T N V F A R P M Y L；GMBP37S P W Y M T P S P N T A；GMBP38H I S V I N Y T T K I S；GMBP39M N V T V S G R L S G P；GMBP40T I P Y P F S L L N N P；GMBP41G P F L Y S Q V A W R S；GMBP42T A L P N H W S D A S P；
GMBP43S V S V G M K P S P R P；GMBP44Y Q E E T P A S S F S R；GMBP45N S S Q L A P Y T T H R；GMBP46 T L H P S V L S Y V L K；GMBP47H N G L P N F F Q T R L；GMBP48E A A P N F Y P P L T F；GMBP49D L F Q F A F P L N T I；GMBP50F T F S Y A E S V S Y F。
它們分別由12個氨基酸組成，都具有蘇氨酸——(1-3個)氨基酸——脯氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP1 E T A P L S T M L S P Y；GMBP2 T T F S P P S P L S S I；GMBP3 F N N H Y P A A A T Y P；GMBP6 K T A P T P Y A L V H D；GMBP8 S W Q I T Y P I S P R S；GMBP9 A W T W V L P S S I R A；GMBP11S T Y S H P L S L R P D；GMBP12Y T T W P F T S L Q L D；GMBP14E T A P P T P Y S V M F；GMBP15T T F N P L Y L R L D T；GMBP19T W N Q P Y I P P L Y P；GMBP22Y T F M P E L T T P R T；GMBP24T S P Y H L L H A H L Q；GMBP28T P P P R D A S L S R W；GMBP29H N I G T W G P K S H L；GMBP33Y T F D P Q I R P A G L；GMBP35Y P S V T F P T Q T L L；GMBP37 S P W Y M T P S P N T A；GMBP40 T I P Y P F S L L N N P；GMBP42T A L P N H W S D A S P；GMBP46 T L H P S V L S Y V L K。
它們分別由12個氨基酸組成，都具有絲氨酸——(0-4個)氨基酸——脯氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP5 S W Q I P Y P I S P R S；GMBP10T D S Y H V A S A R Q P；GMBP16S S F P Q V I P L D Y L；GMBP20 Y A S P P N P S L R L T；GMBP23 N S F N Y A P L L M P R；GMBP25S S F V A L S I S P S M；
GMBP26A N L S S H S S P G D S；GMBP30 S G F F E P Q H S H P L；GMBP32 S P Q T D G L V S T P S；GMBP34Y E R S I L P F S H V F；GMBP39M N V T V S G R L S G P；GMBP43S V S V G M K P S P R PGMBP45 N S S Q L A P Y T T H R。
它們分別由12個氨基酸組成，都具有苯丙氨酸——(0-2個)氨基酸——脯氨酸及脯氨酸——(0-2個)氨基酸——亮氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP4E V F W P L N A P R L L；GMBP36 A S T N V F A R P M Y L；GMBP48E A A P N F Y P P L T F；GMBP49D L F Q F A F P L N T I。
它們分別由12個氨基酸組成，都具有蘇氨酸——(0-3個)氨基酸——絲氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP7 S N F M H N T R I W S H；GMBP13A F M E T T S Q N A W L；GMBP38H I S V I N Y T T K I S；GMBP50F T F S Y A E S V S Y F。
它們分別由12個氨基酸組成，都具有亮氨酸——(4個)氨基酸——谷氨酰胺——蘇氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP27T T L Q F T G Q T N K T；GMBP47H N G L P N F F Q T R L。
它們分別由12個氨基酸組成，都具有谷氨酰胺——異亮氨酸——谷氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP18Q I E K I S Q H L D M H；GMBP31Q I E E S F V R G H T T。
它們分別由12個氨基酸組成，都具有脯氨酸——(1-4個)氨基酸——絲氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP17 A P K Y S L S D L Y L N；GMBP21 Y H G L T P V R Y V S V；GMBP41 G P F L Y S Q V A W R S；GMBP44 Y Q E E T P A S S F S R。
所述的(1)噬菌體肽庫的體外全細(xì)胞消減篩選篩選流程以人正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES及胃癌藥敏細(xì)胞SGC7901為陰性消減細(xì)胞，與原始肽庫共孵育，取未結(jié)合的噬菌體再和胃癌耐藥細(xì)胞(SGC7901/ADR，SGC7901/VCR)共孵育，回收結(jié)合噬菌體，擴(kuò)增后投入下一輪篩選，4輪后挑取噬菌體單克隆進(jìn)行DNA序列測定；(2)體外篩選步驟用市售EDTA細(xì)胞分離液收獲對數(shù)生長期的GES細(xì)胞1×107，與取原始肽庫10μl(2×1011pfu)混合，4℃孵育1.5h，800rpm，離心5min，收集上清，以同樣的方法將SGC7901與回收的上清共孵育，再離心，收集上清；用EDTA收獲SGC7901/ADR或SGC7901/VCR 1×107，與上述回收上清共孵育，離心，棄上清，用BF重懸SGC7901/ADR或SGC7901/VCR，混旋3min后再離心，重復(fù)洗7遍，0.2％PBST洗1遍，PBS洗2遍；以pH2.2的甘氨酸洗脫緩沖液4℃洗脫10min，加入pH9.1的Tris/HCl中和緩沖液，離心，去上清，再以pH2.2的甘氨酸洗脫緩沖液4℃洗脫10min，加入pH9.1的Tris/HCl中和緩沖液，收集上清，即為膜洗脫噬菌體或膜結(jié)合噬菌體；以含PMSF的TEA堿洗脫液4℃裂解洗脫5min，加入pH7.4的Tris/HCl中和緩沖液，離心，收集上清，即為裂解洗脫噬菌體或內(nèi)化噬菌體(AN或VN)；(3)噬菌體的體外擴(kuò)增鋪制LB-Tet平板，并加入X-gal/IPTG，顛倒培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取間距0.5cm以上、生長良好的藍(lán)色噬斑400-500個，分為5部分分別加入宿主菌，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)4-6h；將培養(yǎng)物4℃、10000rpm離心15min，上清與1/6體積的PEG/NaCl溶液4℃過夜；再離心，TBS重懸沉淀，微離心，將上清與1/6體積的PEG/NaCl溶液冰浴1h，離心，棄上清，以200μl 0.02％NaN3溶液重懸沉淀物，即為第一輪擴(kuò)增的噬菌體；(4)下一輪篩選將擴(kuò)增后的膜洗脫噬菌體和裂解洗脫噬菌體各取2×1011pfu，投入下一輪分別進(jìn)行篩選；篩選過程同前，共進(jìn)行4輪篩選，逐漸增加篩選強(qiáng)度與陰性細(xì)胞孵育的時間增加至2h，與靶細(xì)胞的孵育時間減為30mins；BF、PBST、PBS混旋洗滌時間增至5min，PBST濃度漸增為0.2％、0.3％、0.5％；(5)陽性噬菌體克隆的挑選及MTT體外藥敏試驗篩選經(jīng)過4輪篩選，從胃癌耐藥細(xì)胞上回收的噬菌體顯著增高，鋪制LB平板，在克隆數(shù)少于100個的平板上隨機(jī)挑取噬菌體單克隆共200個，其中AN，AM各50個，VN，VM各50個，編號為AN1-AN15，AN41-AN435，AM1-AM25，AM41-AM425，VN1-VN50，VN1-VN50；以AN2為例利用MTT體外藥物敏感實驗進(jìn)行噬菌體對胃癌耐藥細(xì)胞耐藥特性影響的檢測；收獲對數(shù)生長中期的SGC7901/ADR細(xì)胞，按照每孔8×103個細(xì)胞/200μL接種入96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；經(jīng)過MTT篩選檢測AN2-AN10，AN41-AN43，AN45-AN418，AN420-AN425，AN428-AN430，AM1-AM13，AM15-AM23，AM41-AM45，AM47-AM413，AM415-AM425，VN1-VN14，VN17-VN21，VN23-VN30，VN34-VN42，VN45-VN50，VM1-VM7，VM9，VM11-VM14，VM16，VM17，VM19-VM30，VM35-VM47這些克隆可以使胃癌耐藥細(xì)胞在4μg/ml阿霉素(ADR)的環(huán)境中生存率下降，與不加噬菌體克隆及加同等劑量無關(guān)噬菌體(原始肽庫Ph.D.-12的擴(kuò)增液)的胃癌耐藥細(xì)胞相比有顯著差異，并有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；(6)陽性噬菌體克隆的測序采用單鏈DNA提取試劑盒進(jìn)行噬菌體單鏈DNA的提取，然后以以單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒中所提供的測序引物，-96gIII，5′-CCC TCATAG TTA GCG TAA CG-3′測序；根據(jù)測序得出的DNA序列，推導(dǎo)出呈現(xiàn)隨機(jī)肽的氨基酸序列。
本發(fā)明特點目前人們針對腫瘤細(xì)胞膜上已知的耐藥相關(guān)分子采用單克隆抗體及單鏈抗體(scFv)進(jìn)行腫瘤耐藥程度及預(yù)后的判斷，以及腫瘤耐藥細(xì)胞的靶向及逆轉(zhuǎn)耐藥治療，如抗P-gp單克隆抗體MRK-16(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992；895824-5829；J Control Release 2001；77(1-2)77-86)能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，而抗FAS(Urology2001；57(5)993-998)單克隆抗體則能明顯提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度。但單克隆抗體、單鏈抗體(scFv)以及生物工程抗體等。單克隆抗體有難以克服的缺陷，如免疫原性較強(qiáng)、相對缺乏C區(qū)依賴的功能效應(yīng)及穿透能力較弱等。雖然ScFv具有分子量較小，免疫原性弱，滲透力強(qiáng)，并可用于藥物導(dǎo)向，中和毒素等優(yōu)點，但其無抗體C區(qū)，不能介導(dǎo)抗體的其它生物學(xué)效應(yīng)。
目前篩選到的單克隆抗體及單鏈抗體(scFv)治療只是針對已知的膜表面耐藥分子，如P-gp、MRP、BCRP等，而且用來篩選相應(yīng)抗體及單抗的分子是人工表達(dá)或合成純化的分子，其構(gòu)象及功能表位特征與細(xì)胞表面生理狀態(tài)下的分子還有一定的差異。而且對于表達(dá)和純化困難的細(xì)胞膜表面抗原難以進(jìn)行相關(guān)配體的篩選。耐藥逆轉(zhuǎn)治療的效果還不理想，其主要原因之一還在于有很多與耐藥相關(guān)的分子尚未被發(fā)現(xiàn)，其中包括很多膜表面耐藥分子。我們知道在耐藥腫瘤細(xì)胞膜表面存在著與藥敏腫瘤細(xì)胞不同的膜分子表達(dá)譜，或者一些膜分子在耐藥細(xì)胞的構(gòu)象發(fā)生改變，這些膜分子的改變都是腫瘤細(xì)胞在化療藥物持續(xù)存在的壓力下，為對抗化療藥物對細(xì)胞的作用而被誘導(dǎo)表達(dá)的，發(fā)生這些改變的膜分子與腫瘤細(xì)胞的耐藥存在著必然的聯(lián)系。因此尋找能夠特異性結(jié)合及改變這些耐藥相關(guān)膜分子生物學(xué)功能的配體，對于逆轉(zhuǎn)耐藥的治療以及胃癌耐藥相關(guān)分子的研究都有重要的現(xiàn)實及理論意義。而目前篩選逆轉(zhuǎn)耐藥配體的策略只能是針對已知膜表面的耐藥分子，無法直接找到未知的膜表面耐藥分子的配體。
鑒于目前尋找耐藥腫瘤細(xì)胞靶向及逆轉(zhuǎn)治療分子中存在的不足，本發(fā)明采用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選完整的活的腫瘤耐藥細(xì)胞，可以篩選到與生理狀態(tài)下細(xì)胞膜表面分子結(jié)合的多肽，找到未知耐藥相關(guān)分子的配體。多肽分子分子量更小，穿透能力強(qiáng)，沒有抗原性，可具有生物活性的特點，更適合在體內(nèi)應(yīng)用。用噬菌體隨機(jī)呈現(xiàn)肽庫篩選完整的細(xì)胞，對于細(xì)胞表面分子復(fù)雜多變的腫瘤細(xì)胞尤其適合(Curr OpinChem Biol.2000 Feb；4(1)16-21)。噬菌體隨機(jī)肽庫活細(xì)胞篩選有很多優(yōu)勢，首先不要求預(yù)先確定目的的受體；除了篩選結(jié)合的受體外，還可以篩選內(nèi)化的受體。Johnston和其同事用這種方法獲得了表達(dá)20肽的噬菌體不但能夠和纖維母細(xì)胞結(jié)合，并且能夠內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞(Nat Genet 2001 Jan；27(1)6-8)。Hartley O等應(yīng)用噬菌體肽庫成功地篩得與表達(dá)在CHO-CCR5細(xì)胞及HEK-CCR5細(xì)胞表面的CCR5特異性結(jié)合的多肽(J Virol.2003Jun；77(12)6637-44)。現(xiàn)有技術(shù)中利用噬菌體隨機(jī)肽庫體內(nèi)篩選到了與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽，申請?zhí)?00510042810.4的專利申請，利用噬菌體隨機(jī)肽庫體外消減篩選胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，得到了與胃癌血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的短肽。這表明以活細(xì)胞作為篩選靶標(biāo)可以篩得能與細(xì)胞膜表面分子特異結(jié)合的多肽配基。
但是目前利用噬菌體多肽篩選全細(xì)胞，只是簡單的篩選與細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，并沒有針對性的篩選對細(xì)胞功能有影響的多肽。本發(fā)明則利用噬菌體肽庫生物淘篩技術(shù)，先從逆轉(zhuǎn)耐藥的功能著手，結(jié)合MTT體外藥敏試驗篩選方案，有針對性地篩選能逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥細(xì)胞耐藥特性的有生物活性的多肽。本發(fā)明利用噬菌體多肽篩選全細(xì)胞，它能夠同時篩選腫瘤耐藥細(xì)胞膜上所有特異性表達(dá)分子的配體，同時通過功能篩選直接得到有生物活性的能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥細(xì)胞耐藥特性的多肽，是一種高效的尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥細(xì)胞耐藥特性多肽的方法。
以下結(jié)合附圖表對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
圖1噬菌體肽庫體外篩選流程圖；圖2四輪篩選中噬菌體在胃癌多藥耐藥細(xì)胞上逐漸富集圖示；圖3 17個噬菌體克隆與SGC7901/ADR結(jié)合特異性的ELISA鑒定結(jié)果圖示；圖4 7個噬菌體克隆與SGC7901/VCR結(jié)合特異性的ELISA鑒定結(jié)果；圖5 AN2體外活細(xì)胞結(jié)合實驗結(jié)果圖示；圖6 GMBP1與AN2細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗；圖7 AN2噬菌體與SGC7901/ADR結(jié)合特異性的免疫熒光檢測；圖8 GMBP1合成肽對于AN2噬菌體與胃癌SGC7901/ADR細(xì)胞結(jié)合特異性阻斷的免疫熒光檢測；表4 VCR作用于加有多肽GMBP42、對隨機(jī)多肽和PBS的SGC7901/VCR細(xì)胞株的細(xì)胞生存率(％)及IC50值；表5多肽GMBP42裸鼠體內(nèi)藥物敏感試驗。
具體實施例方式
胃癌耐藥細(xì)胞表面分子標(biāo)記物是胃癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)治療的關(guān)鍵靶標(biāo)之一，通過噬菌體隨機(jī)肽庫體外全細(xì)胞篩選，結(jié)合MTT體外藥敏實驗功能鑒定成功地獲得了一組人胃癌耐藥細(xì)胞的特異性結(jié)合及逆轉(zhuǎn)耐藥短肽GMBPs，并利用噬菌體細(xì)胞結(jié)合實驗、免疫細(xì)胞/組織化學(xué)染色、細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗、免疫熒光檢測等方法鑒定了GMBPs的結(jié)合特異性，進(jìn)一步采用多肽MTT體外藥敏實驗、裸鼠體內(nèi)藥物敏感實驗確定了GMBPs的逆轉(zhuǎn)耐藥特性，具體方法如下1.技術(shù)方案1.1.噬菌體肽庫的體外全細(xì)胞消減篩選
1.1.1.篩選流程以人正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES及胃癌藥敏細(xì)胞SGC7901為陰性消減細(xì)胞，與原始肽庫共孵育(原始肽庫購于New England Biolabs公司)，取未結(jié)合的噬菌體再和胃癌耐藥細(xì)胞(SGC7901/ADR，SGC7901/VCR)共孵育，回收結(jié)合噬菌體，擴(kuò)增后投入下一輪篩選，4輪后挑取噬菌體單克隆進(jìn)行DNA序列測定(上海華諾公司)及同源性分析(見圖1)。
1.1.2.體外篩選步驟用EDTA(市售)細(xì)胞分離液收獲對數(shù)生長期的GES細(xì)胞1×107，與取原始肽庫10μl(2×1011pfu)混合，4℃孵育1.5h，800rpm，離心5min，收集上清，以同樣的方法將SGC7901與回收的上清共孵育，再離心，收集上清。用EDTA收獲SGC7901/ADR或SGC7901/VCR 1×107，與上述回收上清共孵育，離心，棄上清，用BF重懸SGC7901/ADR或SGC7901/VCR，混旋3min后再離心，重復(fù)洗7遍，0.2％PBST洗1遍，PBS洗2遍。以pH2.2的甘氨酸洗脫緩沖液4℃洗脫10min，加入pH9.1的Tris/HCl中和緩沖液，離心，去上清，再以pH2.2的甘氨酸洗脫緩沖液4℃洗脫10min，加入pH9.1的Tris/HCl中和緩沖液，收集上清，即為膜洗脫噬菌體或膜結(jié)合噬菌體(AM或VM)。以含PMSF的TEA堿洗脫液4℃裂解洗脫5min，加入pH7.4的Tris/HCl中和緩沖液，離心，收集上清，即為裂解洗脫噬菌體或內(nèi)化噬菌體(AN或VN)。
1.1.3.噬菌體的體外擴(kuò)增鋪制LB-Tet平板，并加入X-gal/IPTG(購于上海生工)，顛倒培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取間距0.5cm以上、生長良好的藍(lán)色噬斑400-500個，分為5部分分別加入宿主菌，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)4-6h。將培養(yǎng)物4℃、10000rpm離心15min，上清與1/6體積的PEG/NaCl溶液4℃過夜。再離心，TBS重懸沉淀，微離心，將上清與1/6體積的PEG/NaCl溶液冰浴1h，離心，棄上清，以200μl 0.02％NaN3溶液重懸沉淀物，即為第一輪擴(kuò)增的噬菌體。
1.1.4.下一輪篩選將擴(kuò)增后的膜洗脫噬菌體和裂解洗脫噬菌體各取2×1011pfu，投入下一輪分別進(jìn)行篩選。篩選過程同前，共進(jìn)行4輪篩選，逐漸增加篩選強(qiáng)度與陰性細(xì)胞孵育的時間增加至2h，與靶細(xì)胞的孵育時間減為30mins；BF、PBST、PBS混旋洗滌時間增至5min，PBST濃度漸增為0.2％、0.3％、0.5％。
1.1.5.陽性噬菌體克隆的挑選及MTT體外藥敏試驗篩選經(jīng)過4輪篩選，從胃癌耐藥細(xì)胞上回收的噬菌體顯著增高，明顯高于對照細(xì)胞(見圖2)。鋪制LB平板，在克隆數(shù)少于100個的平板上隨機(jī)挑取噬菌體單克隆共200個，其中AN，AM各50個，VN，VM各50個，編號為AN1-AN15，AN41-AN435，AM1-AM25，AM41-AM425，VN1-VN50，VN1-VN50。以AN2為例利用MTT體外藥物敏感實驗進(jìn)行噬菌體對胃癌耐藥細(xì)胞耐藥特性影響的檢測。
收獲對數(shù)生長中期的SGC7901/ADR細(xì)胞，按照每孔8×103個細(xì)胞/200μL接種入96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。分為3組，各組設(shè)4個復(fù)孔，每孔分別加入AN2噬菌體1×1010pfu，以同樣劑量的無關(guān)噬菌體(原始肽庫Ph.D.-12的擴(kuò)增液)及PBS作為對照，2小時后，每組再加入4μg/ml濃度的阿霉素(ADR)，繼續(xù)培養(yǎng)3天。每孔加新鮮配制MTT溶液(5g/L)20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時；小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入150μL的DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；波長490nm，在全自動酶標(biāo)儀儀上測各孔光吸收值，取每4個重復(fù)孔A值的平均數(shù)，計算細(xì)胞的存活率細(xì)胞存活率＝(實驗組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100％；以第四軍醫(yī)大學(xué)統(tǒng)計學(xué)教研室的Nosa統(tǒng)計軟件進(jìn)行顯著性檢驗。結(jié)果顯示，AN2能夠逆轉(zhuǎn)SGC7901/ADR的耐藥特性，與無關(guān)噬菌體及PBS相比使胃癌耐藥細(xì)胞的生存率下降，(p＜0.05)有統(tǒng)計學(xué)意義。
經(jīng)過MTT篩選檢測AN2-AN10，AN41-AN43，AN45-AN418，AN420-AN425，AN428-AN430，AM1-AM13，AM15-AM23，AM41-AM45，AM47-AM413，AM415-AM425，VN1-VN14，VN17-VN21，VN23-VN30，VN34-VN42，VN45-VN50，VM1-VM7，VM9，VM11-VM14，VM16，VM17，VM19-VM30，VM35-VM47這些克隆可以使胃癌耐藥細(xì)胞的生存率下降，并有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
1.1.6.陽性噬菌體克隆的測序?qū)TT試驗篩選的陽性噬菌體克隆進(jìn)行測序。采用華舜公司生產(chǎn)的單鏈DNA提取試劑盒進(jìn)行噬菌體單鏈DNA的提取，按操作說明書進(jìn)行操作在含有單個噬菌體克隆的LB培養(yǎng)液中加入沉淀液，高速離心后得到噬菌體顆粒沉淀，加入裂解液裂解噬菌體外殼蛋白，經(jīng)過樹脂純化，洗脫得到噬菌體單鏈DNA。以單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒中所提供的測序引物，-96gIII，5′-CCC TCATAG TTA GCG TAA CG -3′送至上海華諾有限公司測序。除AM20，AM23，AM421，AM424，VN34，VN39，VN48，VM40，VM44號克隆測序失敗，由于一部分克隆序列重復(fù)，最終得到50個不同的噬菌體克隆(見表1)，將其呈現(xiàn)短肽命名為GMBPs(Gastric cancer MDR cell Binding Peptides)。根據(jù)測序得出的DNA序列，推導(dǎo)出呈現(xiàn)隨機(jī)肽的氨基酸序列，以AN2為例。DNA測序報告為CCTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTTGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCTGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTGCTGAGGGTGACGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTGAAAAAATTATTATTCGCAATTCCTTTAGTGGTACCTTTCTATTCTCACTCTGAGACTGCTCCGCTTTCGACGATGTTGTCGCCTTATGGTGGAGGTTCGGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAATCCCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGAC根據(jù)斜體有下劃線的為內(nèi)切酶KPN1的酶切位點，在其下游找到在噬菌體上表達(dá)插入蛋白的DNA序列，即后面下劃線的部分。然后再根據(jù)DNA序列，按照遺傳密碼規(guī)則推導(dǎo)出其蛋白序列為ETAPLSTMLSPY。
字母縮寫與氨基酸的對應(yīng)關(guān)系如下A丙氨酸；R精氨酸；N天冬酰氨；D天冬氨酸；C半胱氨酸；Q谷氨酰胺；E谷氨酸；G甘氨酸；H組氨酸；I異亮氨酸；L亮氨酸；K賴氨酸；M甲硫氨酸；F苯丙氨酸；P脯氨酸；S絲氨酸；T蘇氨酸；W色氨酸；Y酪氨酸；V纈氨酸。
表1測序得到50個隨機(jī)插入片段及其編碼的短肽




*表示該片段在所有測序克隆中重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)，未注明的均為1次1.2.GMBPs氨基酸序列的同源性分析1.2.1. 50個GMBPs間的同源性分析登陸ClustalW網(wǎng)站(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)，12個短肽氨基酸序列之間進(jìn)行對比分析，部分序列之間呈現(xiàn)出較高的同源性，發(fā)現(xiàn)有7種不同特征的共有序列模式。見表2所示。
表2 50個短肽序列中7種不同特征的共有序列模式



1.2.2.通過數(shù)據(jù)庫檢索進(jìn)行同源性分析登陸NCBI/BLAST網(wǎng)站(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)含有與這些短肽氨基酸序列完全一致的蛋白質(zhì)，GMBPs與某些蛋白質(zhì)分子具有較好的同源性(見表3)。
表3 50個GMBPs短肽的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索同源性分析

<p>附表表1 隔離液體系密度、流動度及懸浮穩(wěn)定性

注采用鉆井液中壓濾失量測定儀器，溫度70℃表2 隔離液體系流變性能測定

分別吸取所述對照品溶液和供試樣品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄各組分峰面積，代入線性回歸方程，計算即得樣品TIAs含量。
在本發(fā)明中共轉(zhuǎn)str/g10h基因顯著提高長春花毛狀根TIAs含量。共轉(zhuǎn)str/g10h基因長春花毛狀根中長春堿、長春新堿和阿嗎堿的平均含量分別為61.07mg/g DW、5.91mg/g DW和2.11mg/g DW，是非轉(zhuǎn)化普通根的234.8倍、3.3倍和40.6倍(0.26mg/g DW長春堿、1.81mg/g DW長春新堿和0.052mg/g DW阿嗎堿)。共轉(zhuǎn)str/g10h基因毛狀根總TIAs含量為69.09mg/g DW，是非轉(zhuǎn)化普通根的32.6倍(2.12mg/g DW)。在所測試的共轉(zhuǎn)str/g10h長春花毛狀根無性系中，SG11中TIAs含量最高(78.13mg/g DW)。
本實施例采用HPLC法測定了轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根TIAs含量。采用共轉(zhuǎn)化str和g10h基因的代謝工程策略獲得了TIAs高產(chǎn)的長春花毛狀根，為規(guī)模化生產(chǎn)長春花TIAs并最終解決TIAs匱乏提供了一種理想方法。
本發(fā)明涉及的序列和記號分列如下SEQ ID NO.1的信息&lt;110&gt;上海交通大學(xué)&lt;120&gt;雙關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)化策略提高長春花毛狀根TIAs含量&lt;140&gt;
&lt;141&gt;2005-12-05&lt;160&gt;1
以AN2噬菌體及其呈現(xiàn)短肽GMBP1為例，采用噬菌體細(xì)胞結(jié)合實驗、免疫細(xì)胞熒光染色、細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗等方法鑒定其結(jié)合活性及特異性。其它噬菌體克隆或短肽的鑒定，以同樣方法進(jìn)行。
1.4.1.體外細(xì)胞結(jié)合/內(nèi)化實驗為驗證AN2噬菌體在SGC7901/ADR上結(jié)合的特異性，以SGC7901，GES為對照細(xì)胞，進(jìn)行噬菌體體外結(jié)合實驗。方法如下收獲對數(shù)生長期的SGC7901、SGC7901/ADR、GES細(xì)胞各1×107個，將1×1010pfu AN2噬菌體及無關(guān)噬菌體分別與三種細(xì)胞共孵育，洗滌、pH2.2的甘氨酸洗脫細(xì)胞膜上噬菌體、TEA堿裂解洗脫回收內(nèi)化入細(xì)胞內(nèi)的噬菌體并滴定，比較三種細(xì)胞上的回收噬菌體量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從SGC7901/ADR上回收的內(nèi)化的AN2噬菌體滴度是無關(guān)噬菌體的34倍，是對照細(xì)胞SGC7901的32.4倍、GES的14.8倍。而從SGC7901和GES細(xì)胞上回收的內(nèi)化的AN2噬菌體與無關(guān)噬菌體無明顯差異(見圖5)。
1.4.2.體外結(jié)合競爭抑制實驗為明確AN2噬菌體是否通過其表面呈現(xiàn)的GMBP1短肽特異結(jié)合于SGC7901/ADR，可以利用GMBP1的人工合成肽對AN2噬菌體的特異性結(jié)合進(jìn)行干預(yù)，通過以體外活細(xì)胞結(jié)合內(nèi)化實驗進(jìn)行競爭抑制實驗。體外活細(xì)胞結(jié)合內(nèi)化競爭抑制實驗與體外細(xì)胞結(jié)合內(nèi)化實驗相似，收獲14組對數(shù)生長期的SGC7901/ADR1×107，6個實驗組細(xì)胞先與濃度分別為50μM、10μM、5μM、1μM、0.1μM的合成肽GMBP1(上海生工公司)及隨機(jī)多肽(12肽)，分別與1×1010pfu的AN2噬菌體4℃孵育2h，blocking buffer為對照組。然后洗脫、回收并滴定結(jié)合噬菌體。計算合成肽GMBP1對AN2噬菌體結(jié)合內(nèi)化的競爭抑制率抑制率＝(對照組回收噬菌體的數(shù)量或OD值-實驗組回收噬菌體的數(shù)量或OD值)/對照組回收噬菌體的數(shù)量或OD值×100％，作出抑制率-合成肽濃度曲線。結(jié)果隨著GMBP1濃度的增高，抑制率逐漸上升，在10-50μM時，抑制率維持在較高水平，表明GMBP1合成肽對AN2噬菌體在SGC7901/ADR上的結(jié)合內(nèi)化有競爭抑制作用(見圖6)。
1.4.3.AN2噬菌體及其GMBP1合成肽結(jié)合特異性的免疫熒光檢測采用免疫熒光技術(shù)鑒定AN2噬菌體與SGC7901/ADR結(jié)合的特異性，以SGC7901作對照。細(xì)胞爬片經(jīng)正常血清封閉后，先與AN2噬菌體1×1010pfu 37℃孵育2h，振蕩洗滌5min×6次，然后依次與鼠抗M13單體(購于美國Pharmacia公司)、FITC標(biāo)記的抗鼠IgG二抗孵育、DAPI染色。PBS代替噬菌體，作陰性對照。于熒光顯微鏡下觀察比較結(jié)果顯示，AN2噬菌體在SGC7901/ADR上呈陽性，而對照細(xì)胞為陰性(見圖7)。
采用免疫熒光技術(shù)鑒定GMBP1合成肽與SGC7901/ADR結(jié)合的特異性。SGC7901/ADR及SGC7901細(xì)胞爬片經(jīng)正常血清封閉后，加入AN2噬菌體1×1010pfu和100μl 10μM的GMBP1，另一組單獨加入AN2噬菌體1×1010pfu，37℃孵育2h，振蕩洗滌5min×6次，然后依次與鼠抗M13單體(購于美國Pharmacia公司)、FITC標(biāo)記的抗鼠IgG二抗孵育、DAPI染色。于熒光顯微鏡下觀察比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入GMBP1的SGC7901/ADR呈弱陽性或陰性，而SGC7901加入GMBP1或不加入GMBP1的無明顯差別，均呈陰性或弱陽性，這表明，GMBP1短肽確實能夠特異性結(jié)合于胃癌多藥耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR，而與胃癌藥敏細(xì)胞未見明顯結(jié)合(見圖8)。
綜合上述結(jié)果，AN2、AN46、AN49、AN410、AM410這5個噬菌體克隆在SGC7901和SGC7901/ADR上有明顯的差異性結(jié)合；VN4、VN23、VM2這3個噬菌體克隆在SGC7901和SGC7901/VCR上有明顯的差異性結(jié)合。其中AN2、AN46、AN49、AN410、AM410、VN4、VN23、VM2噬菌體克隆相應(yīng)的短肽GMBP1、GMBP6、GMBP8、GMBP9、GMBP23、GMBP30、GMBP42、GMBP46均能夠抑制其與耐藥腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。
1.5 8個差異結(jié)合噬菌體及其呈現(xiàn)短肽對于逆轉(zhuǎn)耐藥特異性鑒定對于上述實驗證實的有差異明顯結(jié)合的8個噬菌體克隆AN2、AN46、AN49、AN410、AM410、VN4、VN23、VM2逆轉(zhuǎn)耐藥特性進(jìn)行鑒定。以VN23噬菌體呈現(xiàn)短肽GMBP42為例，利用MTT體外藥物敏感性實驗，裸鼠體內(nèi)藥物敏感實驗鑒定其對于胃癌多藥耐藥細(xì)胞耐藥特異性逆轉(zhuǎn)的作用。其它噬菌體克隆或短肽的鑒定，以同樣方法進(jìn)行。
1.5.1 8個差異結(jié)合噬菌體及其呈現(xiàn)短肽MTT體外藥物敏感性實驗收獲對數(shù)生長中期的SGC7901/VCR細(xì)胞，按照每孔8×103個細(xì)胞/200μL接種入96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。分為3組，各組中每孔分別加入100μl10μM的GMBP42，以同樣劑量的隨機(jī)多肽及100ul PBS作為對照，每組再加入不同濃度的長春新堿(0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml，4ug/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)3天。每孔加新鮮配制MTT溶液(5g/L)20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時；小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，每孔加入150μL的DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解；波長490nm，在全自動酶標(biāo)儀儀上測各孔光吸收值，取每4個重復(fù)孔A值的平均數(shù)，計算細(xì)胞的存活率細(xì)胞存活率＝(實驗組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100％；以第四軍醫(yī)大學(xué)統(tǒng)計學(xué)教研室的Nosa統(tǒng)計軟件計算細(xì)胞對每種藥物的IC50值，并進(jìn)行顯著性檢驗。結(jié)果顯示，GMBP42多肽能夠逆轉(zhuǎn)SGC7901/VCR的耐藥特性，與隨機(jī)多肽及PBS相比有明顯差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義。(表4)MTT體外藥物敏感性實驗還顯GMBP8；GMBP46也能夠逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞的耐藥特性，降低其IC50值，與無關(guān)噬菌體及隨機(jī)多肽相比有明顯差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。而GMBP1；GMBP6；GMBP9；這3個克隆對于SGC7901/VCR和SGC7901/ADR的耐藥特性無明顯影響，與無關(guān)噬菌體及隨機(jī)多肽結(jié)果近似。
1.5.2噬菌體短肽裸鼠體內(nèi)藥物敏感性實驗收集胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/VCR細(xì)胞，消化液消化使細(xì)胞分散，用無血清培養(yǎng)基離心洗滌兩次，計數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞懸浮于PBS中。用注射器抽取細(xì)胞懸液接種于裸鼠的腋下，含活細(xì)胞數(shù)2×106。12只4周齡雌性BALB/c裸鼠分成4組在背部皮下接種SGC7901/VCR細(xì)胞。兩周后瘤體可觸及時(其大小約0.3～0.4cm)，第1組尾靜脈注射PBS作為空白對照，第2組尾靜脈注射500mg/kg5-FU(每日1次)，連續(xù)5d；第3組尾靜脈注射500mg/kg 5-FU+200μM隨機(jī)多肽(每日1次)，連續(xù)5d；第4組尾靜脈注射500mg/kg 5-FU+200μM GMBP42(每日1次)，連續(xù)5d；于第6天處死部分小鼠，游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小。
結(jié)果顯示，GMBP42能夠逆轉(zhuǎn)SGC7901/VCR的耐藥特性，腫瘤體積明顯小于單加5-FU、隨機(jī)多肽及PBS組，且有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)(表5)。GMBP8；GMBP46裸鼠體內(nèi)藥物敏感性實驗，也證實其能夠逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞的耐藥特性，縮小腫瘤體積，與隨機(jī)多肽組、單用藥物組及PBS組相比有明顯差異，且有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
2.技術(shù)效果本發(fā)明噬菌體隨機(jī)肽庫聯(lián)合MTT藥物敏感實驗，體外篩選全細(xì)胞，或得到能與胃癌多藥耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及逆轉(zhuǎn)耐藥的短肽GMBPs，經(jīng)細(xì)胞ELISA、體外細(xì)胞結(jié)合實驗、體外結(jié)合競爭抑制實驗、免疫熒光檢測等方法進(jìn)行鑒定，證實GMBPs短肽與胃癌多藥耐藥細(xì)胞結(jié)合的特異性，而且MTT體外藥物敏感實驗及裸鼠體內(nèi)藥物敏感實驗證實，GMBPs短肽能夠逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥細(xì)胞的耐藥特性。這表明，本發(fā)明所建立的利用噬菌體多肽聯(lián)合MTT體外藥敏試驗體外篩選，獲得胃癌多藥耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及逆轉(zhuǎn)耐藥的短肽模型是一種成功的模型，可以作為人胃癌多藥耐藥細(xì)胞膜表面耐藥相關(guān)分子研究的技術(shù)平臺。經(jīng)氨基酸序列的同源性分析，在目前蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)含有與本發(fā)明氨基酸序列完全一致的蛋白分子，因此本發(fā)明具有唯一性。這表明，這些短肽的發(fā)現(xiàn)，在胃癌的診斷、靶向治療、多藥耐藥逆轉(zhuǎn)治療以及胃癌多藥耐藥相關(guān)分子機(jī)制的研究等方面，具有的潛在的應(yīng)用價值及理論研究意義?，F(xiàn)可用于以下幾個方面1.腫瘤多藥耐藥細(xì)胞特異性結(jié)合及逆轉(zhuǎn)耐藥生物活性短肽的篩選以正常細(xì)胞及腫瘤藥敏細(xì)胞為陰性消減細(xì)胞，與原始肽庫共孵育(原始肽庫購于New England Biolabs公司)，取未結(jié)合的噬菌體再和腫瘤耐藥細(xì)胞共孵育，回收結(jié)合噬菌體，擴(kuò)增后投入下一輪篩選，4輪后挑取噬菌體單克隆，直接進(jìn)行單一藥物濃度的MTT藥物敏感試驗篩選，得到的能降低腫瘤耐藥細(xì)胞生存率的噬菌體克隆，再進(jìn)行DNA序列測定及同源性分析。并利用噬菌體細(xì)胞結(jié)合實驗、免疫細(xì)胞/組織化學(xué)染色、細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗、免疫熒光檢測等方法鑒定了噬菌體克隆的結(jié)合特異性，同時利用MTT體外藥敏實驗、裸鼠體內(nèi)藥物敏感實驗確定噬菌體克隆表達(dá)多肽的逆轉(zhuǎn)耐藥特性。為尋找腫瘤多藥耐藥細(xì)胞新的靶向藥物、特異性逆轉(zhuǎn)耐藥的分子以及新的腫瘤多藥耐藥相關(guān)膜分子，提供了新的思路和方法。
2.胃癌診斷試劑盒的研制將本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的特異性結(jié)合短肽與熒光物質(zhì)、同位素等物質(zhì)偶聯(lián)，研制開發(fā)用于胃癌診斷的試劑盒，如果在更大標(biāo)本范圍內(nèi)通過鑒定，有望成為胃癌耐藥程度的診斷及判斷胃癌預(yù)后的一種途徑。
3.胃癌耐藥細(xì)胞的靶向藥物構(gòu)建對于有特異性結(jié)合能力，但沒有生物學(xué)活性短肽，可以用它作為針對胃癌多藥耐藥細(xì)胞的靶向工具，用于胃癌多藥耐藥的靶向治療，比如構(gòu)建如下的胃癌靶向藥物。
胃癌耐藥細(xì)胞靶向性毒性復(fù)合肽的構(gòu)建將本發(fā)明中這些特異性短肽與白喉毒素、假單胞菌外毒素、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌腸毒素等毒素分子相連接，利用特異性短肽將毒素導(dǎo)入胃癌多藥耐藥細(xì)胞，達(dá)到殺死胃癌多藥耐藥細(xì)胞的目的。
4.胃癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)短肽藥物的構(gòu)建將對胃癌多藥耐藥逆轉(zhuǎn)具有生物學(xué)活性的短肽，直接研發(fā)具有逆轉(zhuǎn)耐藥作用的短肽藥物。
5.GMBPs短肽結(jié)合靶分子的研究通過對胃癌耐藥細(xì)胞cDNA表達(dá)文庫的篩選或親和層析等方法，可以用GMBPs短肽為誘餌釣取其結(jié)合靶分子或其編碼基因，從而闡明短肽與胃癌耐藥細(xì)胞特異性結(jié)合的分子基礎(chǔ)，并進(jìn)一步研究此靶分子的功能，如果該靶分子在胃癌多藥耐藥發(fā)生中發(fā)揮重要作用，有可能成為胃癌治療新的靶分子。
3.


圖1是噬菌體肽庫體外篩選流程圖它表示與GES細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞不結(jié)合的噬菌體再與SGC7901/ADR或者SGC7901/VCR共孵育，回收并擴(kuò)增與其結(jié)合的噬菌體，重復(fù)進(jìn)行四輪篩選。
圖2是四輪篩選中噬菌體在SGC7901/ADR或SGC7901/VCR上逐漸富集圖示R1→R4，從SGC7901/ADR或SGC7901/VCR回收的噬菌體滴度增加了105-106倍。
圖3是17個噬菌體克隆與SGC7901/ADR結(jié)合特異性的ELISA鑒定結(jié)果圖示17個噬菌體克隆中，AN2、AN41、AN46、AN49、AM410這5個克隆能特異性結(jié)合于SGC7901/ADR。
圖4是7個噬菌體克隆與SGC7901/VCR結(jié)合特異性的ELISA鑒定結(jié)果7個噬菌體克隆中，VN4、VN23、VM2這3個克隆能特異性結(jié)合于SGC7901/VCR。
圖5是體外活細(xì)胞結(jié)合實驗結(jié)果圖示AN2噬菌體在SGC7901/ADR上的回收量分別是對照細(xì)胞SGC7901組、GES組的32.4、14.8倍。這提示AN2噬菌體與SGC7901/ADR具有特異結(jié)合活性。
圖6是細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗活細(xì)胞結(jié)合競爭抑制實驗及競爭ELISA實驗均表明，隨著GMBP1合成肽濃度的增高，抑制率不斷上升，當(dāng)GMBP1濃度在10-50μM時，抑制率維持在較高水平，這表明GMBP1合成肽對AN2噬菌體在SGC7901/ADR上的結(jié)合活性有競爭抑制作用。
圖7是AN2噬菌體與SGC7901/ADR結(jié)合特異性的免疫熒光檢測(×400)SGC7901/ADR呈陽性，胞膜、胞漿發(fā)出綠色熒光，而SGC7901為陰性。這表明AN2噬菌體能特異結(jié)合于SGC7901/ADR上。胞核由DAPI染成藍(lán)色。
圖8是GMBP1合成肽對于AN2噬菌體與胃癌SGC7901/ADR細(xì)胞結(jié)合特異性阻斷的免疫熒光檢測(×400)對于SGC7901/ADR細(xì)胞加入AN2噬菌體同時加入GMBP1合成肽，人胃癌SGC7901/ADR呈陰性，而未加入GMBP1合成肽呈陽性。
而SGC7901細(xì)胞加不加入GMBP1合成肽均為陰性。這表明GMBP1合成肽能特異結(jié)合于胃癌SGC7901/ADR細(xì)胞，并能阻斷AN2噬菌體與SGC7901/ADR的結(jié)合。胞核由DAPI染成藍(lán)色。
表4是VCR作用于加有多肽GMBP42、對隨機(jī)多肽和PBS的SGC7901/VCR細(xì)胞株的細(xì)胞生存率(％)及IC50值。

*p＜0.05表4
加有GMBP42多肽的SGC7901/VCR細(xì)胞在同等藥物濃度時，生存率及IC50值明顯低于加對照噬菌體、隨機(jī)多肽及只加長春新堿的SGC7901/VCR細(xì)胞，并有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。說明VN23噬菌體多肽GMBP42對于SGC7901/VCR細(xì)胞的耐藥特性有逆轉(zhuǎn)作用。
表5是裸鼠體內(nèi)藥物敏感試驗多肽GMBP42對荷瘤小鼠腫瘤的影響。給藥6天后5-FU+GMBP42組小鼠腫瘤直徑明顯小于PBS組、單加5-FU組及5-FU+隨機(jī)多肽組，并有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)。

*p＜0.05 表權(quán)利要求
1.人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它通過噬菌體隨機(jī)肽庫聯(lián)合MTT體外藥敏試驗篩選，得到能夠逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞耐藥特性的噬菌體克隆多肽，其能夠降低胃癌耐藥細(xì)胞在化療藥物作用下的生存率和IC50值，并有統(tǒng)計學(xué)差異的克隆(p＜0.05)。
2.人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽序列選擇下列序列之一GMBP1 E T A P L S T M L S P YGMBP2 T T F S P P S P L S S I；GMBP3 F N N H Y P A A A T Y P；GMBP4 E V F W P L N A P R L L；GMBP5 S WQ I P Y P I S P R S；GMBP6 K T A P T P Y A L V H D；GMBP7 S N F M H N T R I W S H；GMBP8 S W Q I T Y P I S P R S；GMBP9 A W T W V L P S S I R A；GMBP10T D S Y H V A S A R Q P；GMBP11S T Y S H P L S L R P D；GMBP12Y T T W P F T S L Q L D；GMBP13A F M E T T S Q N A W L；GMBP14E T A P P T P Y S V M F；GMBP15T T F N P L Y L R L D T；GMBP16S S F P Q V I P L D Y L；GMBP17A P K Y S L S D L Y L N；GMBP18Q I E K I S Q H L D M H；GMBP19T W N Q P Y I P P L Y P；GMBP20Y A S P P N P S L R L T；GMBP21Y H G L T P V R Y V S V；GMBP22Y T F M P E L T T P R T；GMBP23N S F N Y A P L L M P R；GMBP24T S P Y H L L H A H L Q；GMBP25S S F V A L S I S P S M；GMBP26A N L S S H S S P G D S；GMBP27T T L Q F T G Q T N K T；GMBP28T P P P R D A S L S R W；GMBP29H N I G T W G P K S H L；GMBP30S G F F E P Q H S H P L；GMBP31Q I E E S F V R G H T T；GMBP32S P Q T D G L V S T P S；GMBP33Y T F D P Q I R P A G L；GMBP34Y E R S I L P F S H V F；GMBP35Y P S V T F P T Q T L L；GMBP36A S T N V F A R P M Y L；GMBP37S P W Y M T P S P N T A；GMBP38H I S V I N Y T T K I S；GMBP39M N V T V S G R L S G P；GMBP40T I P Y P F S L L N N P；GMBP41G P F L Y S Q V A W R S；GMBP42T A L P N H W S D A S P；GMBP43S V S V G M K P S P R P；GMBP44Y Q E E T P A S S F S R；GMBP45N S S Q L A P Y T T H R；GMBP46 T L H P S V L S Y V L K；GMBP47H N G L P N F F Q T R L；GMBP48E A A P N F Y P P L T F；GMBP49D L F Q F A F P L N T I；GMBP50F T F S Y A E S V S Y F。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它們分別由12個氨基酸組成，都具有蘇氨酸——(1-3個)氨基酸——脯氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP1 E T A P L S T M L S P Y；GMBP2 T T F S P P S P L S S I；GMBP3 F N N H Y P A A A T Y P；GMBP6 K T A P T P Y A L V H D；GMBP8 S W Q I T Y P I S P R S；GMBP9 A W T W V L P S S I R A；GMBP11S T Y S H P L S L R P D；GMBP12Y T T W P F T S L Q L D；GMBP14E T A P P T P Y S V M F；GMBP15T T F N P L Y L R L D T；GMBP19T W N Q P Y I P P L Y P；GMBP22Y T F M P E L T T P R T；GMBP24T S P Y H L L H A H L Q；GMBP28T P P P R D A S L S R W；GMBP29H N I G T W G P K S H L；GMBP33Y T F D P Q I R P A G L；GMBP35Y P S V T F P T Q T L L；GMBP37S P W Y M T P S P N T A；GMBP40T I P Y P F S L L N N P；GMBP42T A L P N H W S D A S P；GMBP46 T L H P S V L S Y V L K。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它們分別由12個氨基酸組成，都具有絲氨酸——(0-4個)氨基酸——脯氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP5 S W Q I P Y P I S P R S；GMBP10T D S Y H V A S A R Q P；GMBP16S S F P Q V I P L D Y L；GMBP20Y A S P P N P S L R L T；GMBP23N S F N Y A P L L M P R；GMBP25S S F V A L S I S P S M；GMBP26A N L S S H S S P G D S；GMBP30S G F F E P Q H S H P L；GMBP32S P Q T D G L V S T P S；GMBP34Y E R S I L P F S H V F；GMBP39M N V T V S G R L S G P；GMBP43S V S V G M K P S P R PGMBP45N S S Q L A P Y T T H R。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它們分別由12個氨基酸組成，都具有苯丙氨酸——(0-2個)氨基酸——脯氨酸及脯氨酸——(0-2個)氨基酸——亮氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP4E V F W P L N A P R L L；GMBP36 A S T N V F A R P M Y L；GMBP48E A A P N F Y P P L T F；GMBP49D L F Q F A F P L N T I。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它們分別由12個氨基酸組成，都具有蘇氨酸——(0-3個)氨基酸——絲氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP7 S N F M H N T R I W S H；GMBP13A F M E T T S Q N A W L；GMBP38H I S V I N Y T T K I S；GMBP50F T F S Y A E S V S Y F。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它們分別由12個氨基酸組成，都具有亮氨酸——(4個)氨基酸——谷氨酰胺——蘇氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP27T T L Q F T G Q T N K T；GMBP47H N G L P N F F Q T R L。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它們分別由12個氨基酸組成，都具有谷氨酰胺——異亮氨酸——谷氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP18Q I E K I S Q H L D M H；GMBP31Q I E E S F V R G H T T。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是它們分別由12個氨基酸組成，都具有脯氨酸——(1-4個)氨基酸——絲氨酸特征性共有序列模式，其氨基酸序列如下列之一GMBP17 A P K Y S L S D L Y L N；GMBP21 Y H G L T P V R Y V S V；GMBP41 G P F L Y S Q V A W R S；GMBP44Y Q E E T P A S S F S R。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列，其特征是(1)噬菌體肽庫的體外全細(xì)胞消減篩選篩選流程以人正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES及胃癌藥敏細(xì)胞SGC7901為陰性消減細(xì)胞，與原始肽庫共孵育，取未結(jié)合的噬菌體再和胃癌耐藥細(xì)胞(SGC7901/ADR，SGC7901/VCR)共孵育，回收結(jié)合噬菌體，擴(kuò)增后投入下一輪篩選，4輪后挑取噬菌體單克隆進(jìn)行DNA序列測定；(2)體外篩選步驟用市售EDTA細(xì)胞分離液收獲對數(shù)生長期的GES細(xì)胞1×107，與取原始肽庫10μl(2×1011pfu)混合，4℃孵育1.5h，800rpm，離心5min，收集上清，以同樣的方法將SGC7901與回收的上清共孵育，再離心，收集上清；用EDTA收獲SGC7901/ADR或SGC7901/VCR 1×107，與上述回收上清共孵育，離心，棄上清，用BF重懸SGC7901/ADR或SGC7901/VCR，混旋3min后再離心，重復(fù)洗7遍，0.2％PBST洗1遍，PBS洗2遍；以pH2.2的甘氨酸洗脫緩沖液4℃洗脫10min，加入pH9.1的Tris/HCl中和緩沖液，離心，去上清，再以pH2.2的甘氨酸洗脫緩沖液4℃洗脫10min，加入pH9.1的Tris/HCl中和緩沖液，收集上清，即為膜洗脫噬菌體或膜結(jié)合噬菌體；以含PMSF的TEA堿洗脫液4℃裂解洗脫5min，加入pH7.4的Tris/HCl中和緩沖液，離心，收集上清，即為裂解洗脫噬菌體或內(nèi)化噬菌體(AN或VN)；(3)噬菌體的體外擴(kuò)增鋪制LB-Tet平板，并加入X-gal/IPTG，顛倒培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取間距0.5cm以上、生長良好的藍(lán)色噬斑400-500個，分為5部分分別加入宿主菌，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)4-6h；將培養(yǎng)物4℃、10000rpm離心15min，上清與1/6體積的PEG/NaCl溶液4℃過夜；再離心，TBS重懸沉淀，微離心，將上清與1/6體積的PEG/NaCl溶液冰浴1h，離心，棄上清，以200μl 0.02％NaN3溶液重懸沉淀物，即為第一輪擴(kuò)增的噬菌體；(4)下一輪篩選將擴(kuò)增后的膜洗脫噬菌體和裂解洗脫噬菌體各取2×1011pfu，投入下一輪分別進(jìn)行篩選；篩選過程同前，共進(jìn)行4輪篩選，逐漸增加篩選強(qiáng)度與陰性細(xì)胞孵育的時間增加至2h，與靶細(xì)胞的孵育時間減為30mins；BF、PBST、PBS混旋洗滌時間增至5min，PBST濃度漸增為0.2％、0.3％、0.5％；(5)陽性噬菌體克隆的挑選及MTT體外藥敏試驗篩選經(jīng)過4輪篩選，從胃癌耐藥細(xì)胞上回收的噬菌體顯著增高，鋪制LB平板，在克隆數(shù)少于100個的平板上隨機(jī)挑取噬菌體單克隆共200個，其中AN，AM各50個，VN，VM各50個，編號為AN1-AN15，AN41-AN435，AM1-AM25，AM41-AM425，VN1-VN50，VN1-VN50；以AN2為例利用MTT體外藥物敏感實驗進(jìn)行噬菌體對胃癌耐藥細(xì)胞耐藥特性影響的檢測；收獲對數(shù)生長中期的SGC7901/ADR細(xì)胞，按照每孔8×103個細(xì)胞/200μL接種入96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜；經(jīng)過MTT篩選檢測AN2-AN10，AN41-AN43，AN45-AN418，AN420-AN425，AN428-AN430，AM1-AM13，AM15-AM23，AM41-AM45，AM47-AM413，AM415-AM425，VN1-VN14，VN17-VN21，VN23-VN30，VN34-VN42，VN45-VN50，VM1-VM7，VM9，VM11-VM14，VM16，VM17，VM19-VM30，VM35-VM47這些克隆可以使胃癌耐藥細(xì)胞在4μg/ml阿霉素(ADR)的環(huán)境中生存率下降，與不加噬菌體克隆及加同等劑量無關(guān)噬菌體(原始肽庫Ph.D.-12的擴(kuò)增液)的胃癌耐藥細(xì)胞相比有顯著差異，并有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；(6)陽性噬菌體克隆的測序采用單鏈DNA提取試劑盒進(jìn)行噬菌體單鏈DNA的提取，然后以以單鏈DNA為模板，采用噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒中所提供的測序引物，-96gIII，5′-CCC TCATAG TTA GCG TAA CG-3′測序；根據(jù)測序得出的DNA序列，推導(dǎo)出呈現(xiàn)隨機(jī)肽的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人胃癌耐藥細(xì)胞特異結(jié)合及耐藥逆轉(zhuǎn)短肽篩選方法及序列。其特征是它通過噬菌體隨機(jī)肽庫聯(lián)合MTT體外藥敏試驗篩選，得到能夠逆轉(zhuǎn)胃癌耐藥細(xì)胞耐藥特性的噬菌體克隆多肽，其能夠降低胃癌耐藥細(xì)胞在化療藥物作用下的生存率和IC50值，并有統(tǒng)計學(xué)差異的克隆(p＜0.05)。它利用噬菌體多肽篩選全細(xì)胞能夠同時篩選腫瘤耐藥細(xì)胞膜上所有特異性表達(dá)分子的配體，并通過功能篩選直接得到有生物活性的能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥細(xì)胞耐藥特性的多肽，同時提供一種人胃癌多藥耐藥細(xì)胞特異性結(jié)合及具有逆轉(zhuǎn)耐藥特性，生物活性短肽及其序列(GMBPs)。
文檔編號G01N33/574GK1858253SQ20061004175
公開日2006年11月8日 申請日期2006年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月28日
發(fā)明者林濤, 丁杰, 梁樹輝, 韓全利, 吳開春, 樊代明 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)