專利名稱：基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微球由光子晶體特異的光反射峰來編碼的多元免疫檢測方法，屬于生物醫(yī)學研究、環(huán)境監(jiān)測和臨床檢測的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫分析主要是利用抗體能夠與相應抗原及半抗原發(fā)高特異性結(jié)合這一性質(zhì)，通過將特定抗體(或抗原)作為選擇性試劑來對相應待測抗原(或抗體)進行分析測定的方法。它的提出及發(fā)展是20世紀以來在生物分析化學領(lǐng)域所取得的最偉大的成就之一。免疫分析技術(shù)具有高度的準確性和特異性，因而在臨床檢驗領(lǐng)域中倍受重視，發(fā)展迅速，成為檢驗方法中最為重要的技術(shù)之一。隨著抗體和抗原制備技術(shù)的成熟及標記技術(shù)的發(fā)展和完善，免疫分析技術(shù)作為疾病診斷的主要手段已被廣泛應用于機體免疫功能、腫瘤標志物、內(nèi)分泌功能、傳染性疾病、治療藥物監(jiān)測、過敏原檢測等體外診斷實驗中，其中血凝技術(shù)、酶免疫技術(shù)、放射免疫分析技術(shù)、熒光免疫分析及免疫膠體金技術(shù)等已被大量地應用于日常的檢驗工作中。最為常見的基于微孔板的酶免疫分析是將抗原、抗體首先固定于微孔板固相載體上面，接著用酶標記的抗原或抗體與固定在固相載體上的抗體或抗原的發(fā)生特異性免疫反應，最后用標記酶催化相應的底物產(chǎn)生可以檢測的信號。這樣就使特異免疫反應和酶的高效催化作用有機結(jié)合起來，從而通過肉眼觀察或借助簡單的光學儀器測定酶催化底物所生成的有色產(chǎn)物的顏色或吸光度就可方便的進行定量測定。該方法中酶標試劑容易制備、性質(zhì)穩(wěn)定、有效期長，且克服了放射免疫分析中放射性同位素對操作人員的危害及熒光免疫分析中所需儀器復雜的缺點，保持了放射免疫技術(shù)的靈敏度，成為目前臨床檢驗中應用最為廣泛的免疫分析技術(shù)。
但是作為酶免疫分析的主要載體96微孔板每孔只包被一種抗原或者抗體，所以一種試劑盒只能檢測一種抗體或者抗原。如果需要檢測不同的抗原或者抗體，則需要不同的試劑盒，而分析所用的試驗步驟基本上是一致的，這樣既浪費人力物力又延長了診斷時間。因此，用同一份樣品同時測定兩種或者兩種以上的多元免疫分析方法新近發(fā)展起來并越來越多的引起人們的興趣。多元分析的實現(xiàn)一般通過兩種方式來實現(xiàn)。第一種是多探針標記法，也就是利用不同的熒光染料或者同位素等能在相同的分析條件下產(chǎn)生顯著不同檢測信號的標記探針來分析。隨著需要測定的分析物的種類的增加多探針標記法對信號檢測系統(tǒng)復雜度的要求增加，而且適合于同時檢測的標記物體系也很少，因此其應用收到限制，一般只用于兩元或者三元的免疫分析。第二種是編碼載體法，即把抗原或者抗體固定在不同的編碼載體上進行免疫分析，常見的有抗體微陣列芯片和液相芯片?？贵w微陣列芯片是在DNA微陣列芯片的基礎上發(fā)展起來的，它利用芯片上的坐標位置來編碼抗體分子，在不同的位置固定不同的抗體，這樣只需要一種標記物如熒光分子標記就可以進行多組分的免疫分析。液相芯片則是近幾年來才發(fā)展起來的一種多元免疫分析技術(shù)，它利用熒光染料來編碼微球，把不同的抗體固定到不同的熒光微球上面，同樣采用一種標記分子來檢測多種組分。兩種方法可以多達一百種甚至一百種以上組分的免疫分析，但是臨床免疫檢測的組分數(shù)極少能達到一百種，而基于高通量DNA微陣列芯片的蛋白質(zhì)微陣列芯片技術(shù)需要專業(yè)的分析和數(shù)據(jù)處理儀器，其價格昂貴，試劑耗費嚴重。液相芯片技術(shù)采用大小為5個微米左右的熒光微球作為分析載體，其分析只能通過流式細胞儀這樣的精密儀器，成本較高，而且標記物只選擇熒光分子，難以與普遍應用的酶免疫分析儀檢測方法如吸光度法，化學發(fā)光法等整合以降低成本，不便于臨床推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，該檢測方法用于多元免疫分析具有檢測時間短，靈敏度高，檢測通量大，載體解碼簡單，檢測成本低廉的優(yōu)點。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的可以通過以下方案實現(xiàn)采用具有編碼的光子晶體微球，使抗體或者抗原與光子晶體微球結(jié)合，抗體或者抗原的種類用光子晶體微球的編碼來標識，通過多種利用光子晶體微球標識的抗體或者抗原，同時檢測同一個待測樣品中相應的抗原或者抗體，所述檢測方法包括以下步驟1.選取不同編碼的光子晶體微球，在同一種編碼的微球表面包被同一種特異性抗原或者抗體制成一種免疫微球；制備好的免疫微球用磷酸鹽緩沖液洗滌，封閉緩沖液封閉之后，將分別包被有不同特異性抗體或者抗原的多種編碼的微球進行混合，即得到多元免疫測定用光子晶體微球；2.將多元免疫測定用光子晶體微球與待測樣品混合進行抗原和抗體的特異性結(jié)合反應，反應完畢，用磷酸鹽緩沖液洗滌，并加入標記二抗進行第二次結(jié)合反應，然后再用磷酸鹽緩沖液洗滌；3.檢測微球的編碼，以及微球表面的標記二抗的信號。
所述光子晶體微球的結(jié)構(gòu)是膠體粒子有序自組裝的蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體，或是反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體；蛋白石或者反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體能反射特定波長的光，其反射光譜具有特征反射峰，波長范圍涵蓋紫外，可見與紅外區(qū)。所述的光子晶體微球的編碼為光子晶體反射光譜中特征反射峰波長的數(shù)值。所述的光子晶體微球是基于液滴或者球形孔洞為模板的膠體粒子自組裝法制備的光子晶體微球，或是全息光刻法制備的光子晶體微球。光子晶體微球表面抗原或者抗體采用物理吸附法固定，或利用微球表面的功能基團進行共價連接，或?qū)ξ⑶虮砻孢M行處理以得到衍生的功能基團從而用于共價固定或者增加物理吸附能力。抗體或者抗原的種類用光子晶體微球的編碼來標識，在同種編碼的微球上固定同種抗體或者抗原，使抗體或者抗原的種類與編碼形成一一對應的關(guān)系。標記二抗的標記物是酶標記、化學發(fā)光物質(zhì)、熒光標記、或者量子點標記。標記二抗的標記物是酶時，反應步驟3)，要首先按照微球的編碼將微球分開，然后加入標記酶的底物進行酶促反應，以檢測酶促反應的顯色或者發(fā)光信號。
微球由光子晶體特異的光反射峰來編碼，不同編碼的微球表面分別固定不同的抗原或者抗體，抗體或者抗原的種類用光子晶體微球的編碼來標識。將多個不同編碼的微球與同一個待測樣品混合，可以同時檢測樣品中多個待分析物。該多元免疫檢測方法可以廣泛應用于生物醫(yī)學研究，環(huán)境監(jiān)測和臨床檢測領(lǐng)域。
有益效果根據(jù)本發(fā)明基于光子晶體編碼多元免疫分析用微球與現(xiàn)有多元免疫分析載體相比具有以下優(yōu)點
1)由于光子晶體微球在三維方向上都具有有序納米結(jié)構(gòu)，所以其編碼反射峰可以在各個方向檢測到，而且強度很高，因此對微球編碼的解讀非常簡單方便。
2)采用不同結(jié)構(gòu)的光子晶體可以得到不同的反射峰位置編碼，反射峰位置可以涵蓋紫外、可見以及紅外區(qū)域，甚至可以用多個反射峰作為一個編碼。因此，光子晶體微球的編碼量可以有數(shù)千個甚至數(shù)萬個，可以滿足同時檢測多個指標的需要，也可以滿足高通量檢測的需要。
3)光子晶體微球的制備可以采用“自下而上”(bottom-up)的納米粒子自組裝方法，例如，利用表面帶有等功能基團的納米粒子組裝得到的光子晶體微球表面自然帶有-NH2或者-COOH。因此，光子晶體微球具有多樣化的功能表面，很容易滿足不同免疫分析對微球表明化學的要求。
4)光子晶體微球為蛋白石或者反蛋白石的納米結(jié)構(gòu)，所以其表面為亞微米級的粗糙表面，微球具有極高的比表面積，滿足適合高靈敏度載體的要求，能獲得高的檢測靈敏度。
5)與熒光染料編碼微球相比，光子晶體微球編碼顏色穩(wěn)定，耐紫外和長期儲存。微球的解碼只需要白光就可以，不用專門的激發(fā)光，大大降低了解碼光學系統(tǒng)的復雜性。
6)另外由于光子晶體的反射結(jié)構(gòu)，載體表面對熒光標記的熒光的吸收降低，所以能夠提高熒光的強度和檢測反應的靈敏度。
7)光子晶體微球載體的粒徑范圍為幾十個微米到幾個毫米，很容易滿足多種免疫分析檢測方法如酶聯(lián)顯色法、化學發(fā)光法、熒光法等對載體尺寸的要求。因此，光子晶體微球載體可以與常規(guī)的酶標儀，化學發(fā)光檢測儀，以及熒光顯微鏡等儀器配合使用，不需要專門的檢測儀器配套，從而滿足多種硬件條件，降低了使用成本，方便推廣使用。


圖1是混合多元免疫測定微球進行反應(以雙抗夾心法為例)的示意圖。
圖2是反應結(jié)束后分開多元免疫檢測微球檢測信號(以雙抗夾心法為例)的示意圖。
圖3是光子晶體微球的兩種結(jié)構(gòu)—蛋白石和反蛋白石結(jié)構(gòu)圖4是一個多元免疫檢測的實際結(jié)果。
以上的圖中有光子晶體編碼微球1、抗原2、標記二抗3。
具體實施例方式
將不同抗原或者抗體通過物理吸附或者化學鍵共價連接分別固定到不同編碼的光子晶體微球上面，吸去作為載體的微球表面未結(jié)合的抗原或者抗體并對空位點進行封閉。混合不同編碼的光子晶體微球，加入待測樣品，與微球上的抗原或者抗體進行抗原抗體反應。洗去未反應的物質(zhì)，加入標記過的二抗或者抗原進行第二次結(jié)合反應，吸去未結(jié)合的反應物，然后根據(jù)微球的編碼將微球分開檢測標記信號。信號的強弱與樣品中待測成分的含量成一定正相關(guān)。
其中，所述光子晶體微球的大小在0.1～6mm之間，粒度均一，并具有不同的光子晶體編碼以方便區(qū)分。微球的結(jié)構(gòu)可以是膠體粒子有序自組裝的蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體，也可以是反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體。微球的編碼來自于蛋白石或者反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體對特定波長的光的反射。
待測樣品可以是體液、組織液、細胞裂解液、血液、血清中的病原微生物抗原或其抗體、細胞因子、腫瘤標志物、自身抗體、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、毒品、興奮劑、各種細胞表面的可溶性標記或者各種可溶性受體分子。
基于光子晶體微球的多元免疫分析方法包括以下步驟選取不同編碼的微球，在同一種編碼的微球表面包被同一種特異性抗原或者抗體制成一種免疫微球；制備好的免疫微球用磷酸鹽緩沖液洗滌，封閉緩沖液封閉之后，將包被有不同特異性抗體或者抗原的不同編碼的微球進行混合，即得到多元免疫測定用微球。
將多元免疫測定用微球與待測樣品混合進行抗原和抗體的特異性結(jié)合反應，用磷酸鹽緩沖液洗滌之后，加入標記二抗進行第二次結(jié)合反應，然后再用磷酸鹽緩沖液洗滌。
上述二抗的標記物可以是酶標記、化學發(fā)光物質(zhì)、熒光標記和量子點標記。按照微球的顏色將微球分開，對于酶標記物，加入標記酶的底物進行酶促反應或者化學發(fā)光反應后用酶標儀檢測。對于熒光標記物，熒光信號可以通過熒光顯微鏡、熒光分光光度計、熒光光譜或者時間分辨熒光測定儀測定。
微球利用光子晶體特異的光反射峰來編碼，不同編碼的微球表面固定有不同的抗原或者抗體，將多個不同編碼的微球與同一個樣品混合，可以同時檢測樣品中多個待分析物。
實施例一。使用光子晶體微球進行血液中艾滋病病毒(HIV)和乙型肝炎病毒(HBV)的檢測1分別在600nm和560nm編碼的光子晶體微球上包被艾滋病病毒合成肽抗原和乙型肝炎表面抗原，在450nm編碼的光子晶體微球上包被牛血清白蛋白做為對照。三種包被過的編碼微球分別用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，加入1％的牛血清白蛋白(BSA)封閉。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，將三種包被過的編碼微球混合，得到不同特異性的多元免疫微球。
2將混合后的三種編碼微球，加入到100ul待測血清中，37℃孵育30分鐘，吸去反應液，PBS洗滌兩次后加入熒光FITC標記的羊抗人IgG，37℃孵育30分鐘，PBS洗滌兩次。
3在熒光顯微鏡下觀察微球表面的熒光強度，并用光纖光譜儀測定微球的反射光譜。
實施例二。使用多元免疫微球進行TORCH診斷1分別在430nm、480nm、530nm、600nm和650nm編碼光子晶體微球上包T.gondii，Rubella virus，CMV，HSV Type II抗原和對照牛血清白蛋白，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，加入1％的牛血清白蛋白(BSA)封閉，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次后，將6種包被過的編碼微球混合得到不同特異性的多元免疫微球。
2將混合后的五種編碼微球，加入到100ul待測血清中，37℃孵育30分鐘，吸去反應液，PBS洗滌兩次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgM，37℃孵育30分鐘，PBS洗滌兩次后把五種編碼微球分別放入微孔板的五個微孔中，加入辣根過氧化物酶顯色底物TMB溶液，37℃催化反應20分鐘，加入2M的硫酸終止反應。
3在酶標儀上測定每個微孔在450nm處的吸光度，并用光纖光譜儀測定微球的反射光譜。
權(quán)利要求
1.一種基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，其特征在于采用具有編碼的光子晶體微球，使抗體或者抗原與光子晶體微球結(jié)合，抗體或者抗原的種類用光子晶體微球的編碼來標識，通過多種利用光子晶體微球標識的抗體或者抗原，同時檢測同一個待測樣品中相應的抗原或者抗體，所述檢測方法包括以下步驟1)選取不同編碼的光子晶體微球，在同一種編碼的微球表面包被同一種特異性抗原或者抗體制成一種免疫微球；制備好的免疫微球用磷酸鹽緩沖液洗滌，封閉緩沖液封閉之后，將分別包被有不同特異性抗體或者抗原的多種編碼的微球進行混合，即得到多元免疫測定用光子晶體微球；2)將多元免疫測定用光子晶體微球與待測樣品混合進行抗原和抗體的特異性結(jié)合反應，反應完畢，用磷酸鹽緩沖液洗滌，并加入標記二抗進行第二次結(jié)合反應，然后再用磷酸鹽緩沖液洗滌；3)檢測微球的編碼，以及微球表面的標記二抗的信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，其特征在于所述的光子晶體微球的編碼為光子晶體反射光譜中特征反射峰波長的數(shù)值。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，其特征在于所述光子晶體微球的結(jié)構(gòu)是膠體粒子有序自組裝的蛋白石結(jié)構(gòu)光子晶體，或是反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體；蛋白石或者反蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體能反射特定波長的光，其反射光譜具有特征反射峰，波長范圍涵蓋紫外，可見與紅外區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，其特征在于所述的光子晶體微球是基于液滴或者球形孔洞為模板的膠體粒子自組裝法制備的光子晶體微球，或是全息光刻法制備的光子晶體微球。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，其特征在于光子晶體微球表面抗原或者抗體采用物理吸附法固定，或利用微球表面的功能基團進行共價連接，或?qū)ξ⑶虮砻孢M行處理以得到衍生的功能基團從而用于共價固定或者增加物理吸附能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，其特征在于抗體或者抗原的種類用光子晶體微球的編碼來標識，在同種編碼的微球上固定同種抗體或者抗原，使抗體或者抗原的種類與編碼形成一一對應的關(guān)系。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，其特征在于標記二抗的標記物是酶標記、化學發(fā)光物質(zhì)、熒光標記、或者量子點標記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的基于光子晶體微球的多元免疫檢測方法，其特征在于標記二抗的標記物是酶時，反應步驟3)，要首先按照微球的編碼將微球分開，然后加入標記酶的底物進行酶促反應，以檢測酶促反應的顯色或者發(fā)光信號。
全文摘要
基于光子晶體微球用于多元免疫檢測方法涉及一種微球由光子晶體特異的光反射峰來編碼的多元免疫檢測方法，該方法采用具有編碼的光子晶體微球，使抗體或者抗原與光子晶體微球結(jié)合，抗體或者抗原的種類用光子晶體微球的編碼來標識，通過多種利用光子晶體微球標識的抗體或者抗原，同時檢測同一個待測樣品中相應的抗原或者抗體，微球利用光子晶體特異的光反射峰來編碼，不同編碼的微球表面分別固定不同的抗原或者抗體，將多個不同編碼的微球與同一個待測樣品混合，可以同時檢測樣品中多個待分析物。這種基于光子晶體微球的多元免疫分析方法具有靈敏度高，檢測通量大，載體解碼簡單，檢測成本低廉等優(yōu)點。
文檔編號G01N21/25GK1928561SQ200610041559
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月15日
發(fā)明者顧忠澤, 趙祥偉 申請人:東南大學