專利名稱：不同阻抗系列免疫微球及制備方法、以及對其進(jìn)行檢測的方法與裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及不同阻抗系列免疫微球及其制備方法，以及對其進(jìn)行檢測的方法與裝置。
背景技術(shù)：
目前建立在抗原抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的實(shí)驗診斷技術(shù)，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)技術(shù)，放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、發(fā)光免疫技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和生物傳感技術(shù)等.建立在核酸分子雜交技術(shù)上的實(shí)驗診斷技術(shù)，包括Northern blot技術(shù)、Southern blot技術(shù)和原位雜交技術(shù)等。這些技術(shù)是醫(yī)學(xué)檢驗工作中常見的技術(shù)，但都存在一些缺點(diǎn)。
我們以ELISA技術(shù)為例，說明目前建立在抗原抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的實(shí)驗診斷技術(shù)一般存在以下不足1、是一種試劑只能測定一個項目。比如測定乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的試劑只能測定HBsAg，而不能同時測定乙型肝炎病毒e抗原(HbeAg)。醫(yī)院檢驗科或科研技術(shù)人員每次實(shí)驗只能測定一項指標(biāo)，要檢測某種疾病的相關(guān)物質(zhì)，就要進(jìn)行大量的重復(fù)性工作(如乙型肝炎兩對半系列)，花費(fèi)大量的人力，物力和資源，增加檢驗成本。2、是質(zhì)量控制比較困難。人們不可能對一批試劑盒中的所有測定板上的所有測定孔，逐一進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測。質(zhì)量控制部門，只能從一批ELISA測定扳中，隨機(jī)抽樣檢查，這很難保證標(biāo)本測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。3、是準(zhǔn)確定量比較困難，靈敏度不高，操作復(fù)雜。ELISA技術(shù)最終以測定孔液體顏色深淺作為陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)，由于受到顯色時間的影響，使結(jié)果很難做到準(zhǔn)確定量。此外該技術(shù)測定步驟煩瑣，需要時間長，存在人為誤差等缺點(diǎn)。
除了ELISA技術(shù)之外，其它技術(shù)也各有各的缺點(diǎn)和不足，有的技術(shù)雖然快速，但只能定性、不能定量；有的技術(shù)雖然能夠定量，但檢測成本很高，且難以同時對多種物質(zhì)同時進(jìn)行測定。固體生物芯片(包括蛋白質(zhì)和基因芯片)技術(shù)，同時可以測定上千種物質(zhì)，但一般用于定性(判斷陰性和陽性)而難以用于定量測定。
20世紀(jì)80年代國外開發(fā)出流式細(xì)胞技術(shù)，對人體血液內(nèi)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測，并已經(jīng)用于白血病的診斷與分類。最近，國外也開發(fā)出建立在不同顏色微球基礎(chǔ)上的液態(tài)芯片技術(shù)，其制作方法為，不同顏色微球代表不同測定物質(zhì)，微球表面熒光強(qiáng)度代表物質(zhì)含量。該技術(shù)解決了可以同時定量測定100種以內(nèi)的待測物質(zhì)的難題，是固態(tài)生物芯片技術(shù)的一次飛躍，被認(rèn)為是一場世界范圍內(nèi)檢驗技術(shù)革命。
但是，建立在不同顏色微球基礎(chǔ)上的液態(tài)芯片技術(shù)，也存在不足，主要表現(xiàn)在以下幾個方面1、不同顏色代表不同測定物質(zhì)，但能被儀器準(zhǔn)確識別顏色變化并不是無限的。因此該技術(shù)測定物質(zhì)種類還不是真正意義上的無限多。
2、不同顏色微球，因保存時間長，可能會出現(xiàn)脫色。
3、微球顏色對微球表面的光信號測定，會產(chǎn)生干擾。
4、測定設(shè)備要求條件高。需要高靈敏的顏色判斷和可以消除微球自身顏色的微球表面光信號定量測定設(shè)備。
5、檢測設(shè)備對顏色種類精細(xì)判讀，可能存在誤差，不可能同時檢測無數(shù)種待測物質(zhì)，根據(jù)資料報道，最多只能得到100種比較穩(wěn)定的不同顏色微球，這無法滿足日益增多的檢驗科檢測和醫(yī)學(xué)科研項目的要求。
6、發(fā)展中國家獨(dú)自開發(fā)和生產(chǎn)出這種測定設(shè)備，在技術(shù)上尚不成熟。
本發(fā)明是顏色變量免疫微球液態(tài)芯片基礎(chǔ)上的一次革命性創(chuàng)新，具有同時測定項目更廣，檢測結(jié)果更可靠，發(fā)展中國家技術(shù)能滿足其檢測裝置的技術(shù)要求等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，用不同阻抗系列免疫微球液態(tài)生物芯片技術(shù)，取代目前醫(yī)院檢驗科或醫(yī)學(xué)院校所有ELISA項目、放射免疫項目和基因檢測項目、以及最近從國外進(jìn)口的不同顏色免疫微球液態(tài)生物芯片技術(shù)。不同阻抗微球液態(tài)芯片可以對傳統(tǒng)建立在抗原抗體反應(yīng)和核酸分子雜交原理上的所有項目，進(jìn)行定量測定。本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新是，用不同阻抗免疫微球代表不同測定項目，用微球表面熒光或發(fā)光信號強(qiáng)度代表待測物質(zhì)的含量。本發(fā)明為醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)產(chǎn)業(yè)部門和臨床檢驗試劑盒開發(fā)部門，提供不同阻抗系列免疫微球及其制備方法、以及對其進(jìn)行檢測的方法與裝置。
本發(fā)明的一種不同阻抗系列免疫微球，包括乳膠微球，其主要特征如下1)不同阻抗系列免疫微球含不同濃度的金屬和碳粉末導(dǎo)電物質(zhì)，導(dǎo)電物質(zhì)濃度越高，微球電阻率越小，反之依然。
2)不同阻抗系列免疫微球大小體積不同。同樣電阻率微球，體積越大，阻抗越大，反之依然。最大微球直徑不大于100微米，最小微球直徑不小于最大微球直徑的一半。
3)由于微球電阻率不同，同樣電阻率的微球體積不同，可以形成無數(shù)種穩(wěn)定的不同阻抗系列微球。
4)不同阻抗段免疫微球，代表不同系列測定物質(zhì)，如1至10歐姆代表乙型肝炎抗原系列，10歐姆至20歐姆代表腫瘤標(biāo)記物系列等，不同具體阻抗數(shù)值代表不同具體測定物質(zhì)。如1歐姆代表HbsAg測定，2歐姆代表HbeAg測定，4歐姆代表HbcAg測定。微球阻抗變量的無限性，代表同時測定的物質(zhì)種類的無限性。
5)不同阻抗免疫微球表面共價結(jié)合不同特異性抗原、抗體或特異DNA片段，相同阻抗免疫微球表面共價結(jié)合相同特異性抗原、抗體或特異DNA片段。
6)不同阻抗免疫微球表面共價結(jié)合的特異性抗原、抗體或特異DNA片段，是針對正常人或患者機(jī)體內(nèi)具有診斷價值的待測相應(yīng)抗體，如抗甲型肝炎病毒抗體，抗HAV抗體，抗原，如乙型肝炎病毒表面抗原，HBsAg或特異DNA片段如乙型肝炎病毒DNA的互補(bǔ)特異性抗原、抗體或特異DNA片段。
2、本發(fā)明所述的不同阻抗系列免疫微球的制備方法如下第一步制備不同阻抗系列的微球，包括乳膠微球。
將導(dǎo)電物質(zhì)，如金屬粉末和碳粉末和乳膠原料，按1∶10-1∶100000000進(jìn)行混合，按照成熟的工藝，控制實(shí)驗條件，生產(chǎn)出相同導(dǎo)電物質(zhì)濃度的不同大小體積的乳膠微球，然后采用微孔濾膜小于100μm且大于50μm。過濾再通過密度梯度離心，分離不同大小體積的乳膠微球。因為同一配方生產(chǎn)的乳膠微球電阻率相同，因此分離出來的體積相同的微球，其阻抗也相同。
為了從外觀上可以區(qū)分不同阻抗的乳膠微球，我們使用相同電阻率的不同體積微球用于不同物質(zhì)的測定，乳膠體積越大，電阻越大，微球體積越小，電阻越小。乳膠微球直徑不超過100微米，是為了保證普通阻抗型血球記數(shù)儀，能夠完成本發(fā)明的微球阻抗大小測定。最小微球體積不小于最大微球體積一半，是為了保證不讓2個微球同時進(jìn)入阻抗測定微孔。不同阻抗微球經(jīng)測試后，注明阻抗數(shù)值，保存?zhèn)溆谩?br> 以苯乙烯為原料合成乳膠微球為例，首先將金屬銀粉末與苯乙烯，按1∶10---1∶100000000混合，通過成熟工藝，生產(chǎn)出符合要求的不同阻抗系列的羧化或胺化聚苯乙烯乳膠微球，這種乳膠微球可共價牢固連接抗原、抗體和DNA化學(xué)分子如表1所示。生產(chǎn)出的不同阻抗系列羧化或胺化聚苯乙烯乳膠微球，通過孔徑為100μm尼龍膜過濾，過濾后乳膠微球通過密度梯度離心，10000轉(zhuǎn)/分鐘20分鐘，不同體積微球停留在不同位置，精確吸取不同體積的乳膠微球，最后，用顯微鏡標(biāo)尺測定微球體積，把同體積的微球放置同一個試管內(nèi)保存。同體積大小微球通過微孔阻抗測定裝置，精確測定阻抗大小，并計算該批乳膠產(chǎn)品的電阻率，電阻率＝微球阻抗/微球體積。對于同一批乳膠微球產(chǎn)品導(dǎo)電物質(zhì)濃度相同，電阻率相同。微球阻抗大小取決于微球體積大小，同體積大小微球，阻抗相同。
表1不同阻抗聚苯乙烯乳膠微球的生產(chǎn)配方。
苯乙烯(克)100 100 100 100 100 100 100 100 100......
銀粉末(毫克) 1.5 22.5 33.5 44.5 55.5 ......
本發(fā)明所指的導(dǎo)電物質(zhì)，包含能改變?nèi)槟z微球?qū)щ娐首兓钠渌磺形镔|(zhì)。
第二步制備不同阻抗系列免疫診斷乳膠微球生物芯片。
首先，確定不同乳膠微球阻抗與測定成分一一對應(yīng)。不同阻抗微球代表不同測定項目。一個阻抗范圍即阻抗段，代表一個測定系列項目如乙肝測定系列，腫瘤標(biāo)記物測定系列等。不同具體阻抗數(shù)值代表不同具體待測物質(zhì)如HBsAg，HBeAg，HBcAg等。由于微球電阻變化無限性，也決定著待測項目的無限性，如表2所示。我們將不同阻抗對應(yīng)的待測物質(zhì)，輸入計算機(jī)軟件，供判斷阻抗免疫微球代表的待測物質(zhì)種類分析。
表2不同乳膠微球阻抗代表不同測定項目。
微球電阻(歐姆) 123...1112... 101 102...
測定物質(zhì)HbsAg HbeAg HBcAg...AFP CEA... T3 T4...
然后，根據(jù)阻抗大小與待測物質(zhì)種類對應(yīng)表，采用成熟的化學(xué)共價標(biāo)記技術(shù)，將成千上萬種不同特異性抗體、特異性抗原或特異性已知DNA片段，標(biāo)記在成千上萬種相對應(yīng)的不同阻抗乳膠微球表面，做成不同阻抗系列微球液態(tài)生物芯片。
最后，配制不同阻抗微球系列液態(tài)生物芯片所需的配套試劑，根據(jù)待測物質(zhì)的性質(zhì)不同，設(shè)計不同配套試劑。
①待測成分為蛋白質(zhì)抗原。這類物質(zhì)包括細(xì)菌、支原體、衣原體、病毒等表面特異抗原、多種腫瘤標(biāo)記物、體內(nèi)蛋白質(zhì)多肽物質(zhì)如C反應(yīng)蛋白，激素、類風(fēng)濕因子等。這類項目的檢測需要乳膠微球表面包被相對應(yīng)的特異性抗體，進(jìn)行分析。
測定這類物質(zhì)成分試劑盒，需要以下配套試劑。
(1)游離的相應(yīng)抗體及其緩沖液
(2)熒光或發(fā)光物標(biāo)記的第二抗體(抗抗體)及其緩沖液(3)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)緩沖液(4)乳膠微球洗滌液(5)熒光或發(fā)光測定試劑②待測物質(zhì)為蛋白質(zhì)抗體。這類物質(zhì)主要包括由于患者感染了細(xì)菌、支原體、衣原體、病毒，而產(chǎn)生的特異抗體。此外，某些疾病也會診斷自身物質(zhì)產(chǎn)生的病理性抗體。這類項目的檢測需要乳膠微球表面包被相對應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原，進(jìn)行分析。
測定這類物質(zhì)成分，需要以下配套試劑。
(1)游離的相應(yīng)熒光或發(fā)光物標(biāo)記的第二抗體(抗抗體)及其緩沖液(2)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)緩沖液(3)乳膠微球洗滌液(4)熒光或發(fā)光測定試劑③待測物質(zhì)為DNA或RNA。這類物質(zhì)主要包括體內(nèi)微生物尤其是病毒的特異DNA或RNA片段，以及用于科學(xué)研究的某些DNA或RNA的檢測與分析。這類項目的檢測需要乳膠微球表面包被相對應(yīng)的DNA或RNA片段，進(jìn)行分析。測定這類物質(zhì)，需要以下配套試劑。
(1)游離的熒光或發(fā)光物標(biāo)記的DNA片段(基因探針)及其緩沖液(2)雜交反應(yīng)液(3)乳膠微球洗滌液(4)熒光或發(fā)光測定試劑以上緩沖液均可在公開的資料文獻(xiàn)或教材上，找到配方，這里不再詳述。
第三步組裝阻抗變量液態(tài)生物芯片試劑盒。
將已標(biāo)記的不同抗原、抗體和DNA的不同阻抗乳膠診斷微球和配套試劑，組合包裝成為阻抗變量液態(tài)生物芯片試劑盒。試劑盒內(nèi)有多少種不同電阻的診斷微球，就代表能同時測定多少種項目，但某種抗原和該抗原對應(yīng)的抗體測定微球不能同時在一個試劑盒內(nèi)存在、如HBsAg和HBsAb不能同時測定。不同阻抗診斷乳膠微球可以凍干保存，其它配套試劑可以5℃冰箱保存。
試劑盒內(nèi)含有以下幾種試劑1)不同凍干阻抗診斷微球2)不同測定物質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)品3)各種反應(yīng)液4)各種緩沖液5)各種稀釋液和洗滌液6)熒光和發(fā)光物質(zhì)測定試劑3、本發(fā)明不同阻抗系列免疫微球，阻抗變量微球液態(tài)生物芯片的檢測方法如下1)待測物質(zhì)為抗原類第一步將不同阻抗系列標(biāo)記有不同相應(yīng)抗體的免疫微球與待測樣品中的待測抗原混合，進(jìn)行第一次抗原抗體特異結(jié)合，離心后用PBS洗滌微球。
第二步將洗滌后微球與游離的相應(yīng)抗體進(jìn)行二次結(jié)合反應(yīng)，離心后用PBS洗滌微球。
第三步將洗滌后微球與熒光或發(fā)光物標(biāo)記的抗原抗體進(jìn)行第三次結(jié)合反應(yīng)，微球經(jīng)離心后，再用PBS洗滌，棄取游離的熒光或發(fā)光標(biāo)記的抗原抗體，微球重新懸浮待測。如果樣品中有待測抗原，不同阻抗系列免疫微球表面出現(xiàn)熒光或發(fā)光。
2)待測物質(zhì)為抗體類第一步將不同阻抗系列標(biāo)記有不同相應(yīng)抗原的免疫微球與待測樣品中的待測抗體混合，進(jìn)行第一次抗原抗體特異結(jié)合，離心后用PBS洗滌微球。
第二步將洗滌后微球與熒光或發(fā)光物標(biāo)記的抗原抗體進(jìn)行第二次結(jié)合反應(yīng)，微球經(jīng)離心后，再用PBS洗滌，棄取游離的熒光或發(fā)光標(biāo)記的抗原抗體，微球重新懸浮待測。如果樣品中有待測抗體，不同阻抗系列免疫微球表面出現(xiàn)熒光或發(fā)光。
3)待測物質(zhì)為DNA或RNA類第一步將不同阻抗系列標(biāo)記有與不同待測DNA或RNA部分互補(bǔ)的DNA片段的免疫微球與待測樣品中的待測DNA或RNA混合，進(jìn)行第一次核酸分子雜交反應(yīng)，離心后用PBS洗滌微球。
第二步將洗滌后微球與熒光或發(fā)光物標(biāo)記的與待測DNA或RNA部分互補(bǔ)的DNA，進(jìn)行第二次核酸分子雜交反應(yīng)，微球經(jīng)離心后，再用PBS洗滌，棄取游離的熒光或發(fā)光標(biāo)記DNA片段，微球重新懸浮待測。如果樣品中有待測DNA或RNA，不同阻抗系列免疫微球表面出現(xiàn)熒光或發(fā)光。
以上洗滌后不同阻抗系列免疫熒光或發(fā)光微球，通過阻抗變量微球液態(tài)生物芯片檢測裝置，進(jìn)行微球阻抗分析判別待測物質(zhì)，以及微球表面熒光或發(fā)光信號強(qiáng)度分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度的微球熒光或發(fā)光強(qiáng)度大小，計算待測物質(zhì)含量。
4、不同阻抗系列免疫微球檢測裝置。
本發(fā)明的阻抗變量免疫微球液態(tài)生物芯片檢測裝置，包括2個測定裝置和一套軟件分析系統(tǒng)。兩個測定裝置是指微球阻抗檢測裝置和微球表面光信號測定裝置，一套軟件分析系統(tǒng)指對微球阻抗大小及其表面光信號進(jìn)行處理分析的系統(tǒng)。2個測定裝置和一個軟件分析系統(tǒng)是一個統(tǒng)一的整體，是微孔阻抗測定技術(shù)和微球表面光信號測定技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。
第一部分是微孔阻抗測定裝置，能測定通過微孔的單個微球電阻大小；微孔直徑不超過最小微球直徑的2倍。其技術(shù)原理與細(xì)胞記數(shù)儀的工作原理基本相同。
第二部分是對通過微孔的微球表面熒光或發(fā)光信號，進(jìn)行定量檢測裝置；其原理與流式細(xì)胞儀工作原理基本相同。
第三部分是軟件分析系統(tǒng)，能接收微球阻抗信號以及該微球表面光信號，通過預(yù)設(shè)的技術(shù)參數(shù)，分析微球阻抗大小以判定待測物質(zhì)種類，分析該阻抗微球表面熒光或發(fā)光信號強(qiáng)度，并以標(biāo)準(zhǔn)品做參比，計算出該待測物質(zhì)的含量，并打印報告。
本發(fā)明的阻抗變量免疫微球液態(tài)生物芯片測定裝置軟件分析系統(tǒng)至少需預(yù)設(shè)技術(shù)參數(shù)包括①阻抗變量免疫微球液態(tài)生物芯片的不同微球阻抗數(shù)值代表的待測物質(zhì)種類，②多種標(biāo)準(zhǔn)品濃度。
5本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下1)、不同阻抗微球代表不同測定物質(zhì)，阻抗變化信息量更大，從理論上做到同時測定無限多個檢測項目。
2)、不同阻抗微球容易被判讀，一般血球細(xì)胞記數(shù)儀工作原理，能滿足本發(fā)明要求。
3、微球表面待測物質(zhì)光信號，不受微球阻抗干擾。
4、不同阻抗微球，穩(wěn)定，可以長期保存，且容易生產(chǎn)。
5、所需設(shè)備的技術(shù)相對低，血球記數(shù)儀和流式細(xì)胞儀技術(shù)結(jié)合，即可完成本發(fā)明技術(shù)要求。
具體實(shí)施例實(shí)施例1測定體內(nèi)某些物質(zhì)抗原，能直接說明體內(nèi)感染了某些物質(zhì)。發(fā)明人以同時測定乙型肝炎病毒三項抗原物質(zhì)(HBsAg，HBeAg，HbcAg)為例，加以說明抗原類物質(zhì)測定的操作步驟。
1)將導(dǎo)電物質(zhì)和乳膠原料，按1∶1000、1∶2000、1∶3000的重量份進(jìn)行混合，制作不同阻抗的可用來化學(xué)共價鍵標(biāo)記的乳膠微球。
2)將乳膠微球分為低阻抗n1，中阻抗n2和高阻抗n3三種，并預(yù)設(shè)阻抗n1，n2和n3分別代表HBsAg，HBeAg和HbcAg測定，并將該對應(yīng)信息輸入阻抗變量微球液態(tài)生物芯片檢測裝置軟件系統(tǒng)。三種乳膠微球直徑分別為60μm，80μm和100μm。
3)制作抗HBsAg，HBeAg和HbcAg三種單克隆抗體。
4)將抗HBsAg，HBeAg和HbcAg三種單克隆抗體，分別共價鍵結(jié)合在低、中、高三種不同阻抗的微球表面，制作免疫微球，2000g離心5分鐘，棄去游離未標(biāo)記的抗體。
5)三種免疫微球用磷酸緩沖液(PBS)洗滌，離心后，棄取上清液，用含抗原抗體反應(yīng)緩沖液進(jìn)行重懸，制成10％微球濃度的三元診斷微球液態(tài)芯片。
6)將250微升三元微球芯片放入1毫升的EF離心管內(nèi)，再加250微升血清或其他測定標(biāo)本，充分混勻，37℃震蕩保溫50分鐘，使微球表面三種抗HBsAg，HBeAg和HBcAg三種單克隆抗體分別與樣品中待測的HBsAg，HBeAg和HBcAg三種不同抗原充分結(jié)合。
7)離心管1500g離心10分鐘，棄取上清，用PBS重懸，再離心，再去上清，對三元阻抗微球芯片進(jìn)行洗滌，徹底洗去離心管中游離的待測物質(zhì)。
8)加入含有游離抗HBsAg，HBeAg和HBcAg三種單克隆抗體PBS溶液500毫升，37℃震蕩保溫30分鐘，使它們分別與結(jié)合在微球上的待測HBsAg，HBeAg和HBcAg充分結(jié)合，重復(fù)第7)步，對三元診斷微球進(jìn)行洗滌，離心棄取上清液。
9)加入熒光標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體(抗抗體)500毫升，37℃震蕩保溫45分鐘，與結(jié)合在微球表面的抗HBsAg，HBeAg和HBcAg三種單克隆抗體充分結(jié)合，重復(fù)步驟7)，徹底洗滌，離心，留取微球沉淀。
10)將微球熒光測定緩沖液重懸微球沉淀，使用阻抗變量微球液態(tài)生物芯片檢測裝置，進(jìn)行微球阻抗(測定項目)和微球表面熒光強(qiáng)度(物質(zhì)含量)測定，通過數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)，分析HBsAg，HBeAg和HBcAg的含量。
11)結(jié)果判讀如果低阻抗微球表面熒光陽性，說明血清HBsAg陽性，熒光強(qiáng)度與HBsAg，濃度呈正比。采用標(biāo)準(zhǔn)HBsAg濃度做參比測定，可對HBsAg進(jìn)行準(zhǔn)確定量。如果低阻抗和高阻抗表面熒光同時陽性，說明血液內(nèi)同時存在HBsAg和HBcAg，依次類推。
以上操作事例只起示范作用，具體詳見有關(guān)技術(shù)資料。如果要測n種抗原物質(zhì)，需要n種不同電阻的微球，操作同上。
實(shí)施例2測定體內(nèi)某些物質(zhì)的抗體，能間接說明體內(nèi)感染了某些物質(zhì)。發(fā)明人以同時測定甲型肝炎病毒(HAV)抗體、乙型肝炎病毒(HBV)抗體和丙型肝炎病毒(HCV)抗體和丁型肝炎病毒(HDV)抗體為例，加以說明抗體類物質(zhì)測定的操作步驟。
1)將導(dǎo)電物質(zhì)和乳膠原料，按1∶100、1∶200、1∶300、1∶400的重量份進(jìn)行混合，制作4種不同阻抗(n1，n2，n3和n4)特征的可供共價結(jié)合抗原蛋白質(zhì)的乳膠微球。
2)生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品HAV、HBV、HCV和HDV特異抗原片段或滅活病毒蛋白顆粒。
3)預(yù)設(shè)n1，n2，n3，n4四種阻抗乳膠微球分別代表抗HAV、HBV、HCV、HDV四種抗體測定，并將該對應(yīng)信息輸入阻抗變量微球液態(tài)生物芯片檢測裝置軟件系統(tǒng)。
4)分別將HAV、HBV、HCV、HDV抗原片段分別化學(xué)共價標(biāo)記在n1，n2，n3，n4四種阻抗乳膠微球表面，制作四元免疫微球。2000g離心5分鐘，棄去游離未標(biāo)記的抗原。
5)四種免疫微球用磷酸緩沖液(PBS)洗滌，用含抗原抗體反應(yīng)PBS緩沖液進(jìn)行重懸，制成10％微球濃度的四元診斷微球液態(tài)芯片。
6)將250微升四元微球芯片放入1毫升的EF離心管內(nèi)，再加250微升血清或其他測定標(biāo)本，充分混勻，37℃震蕩保溫40分鐘，使微球表面的HAV，HBV，HCV，HDV抗原和樣品中待測相應(yīng)抗體充分結(jié)合。
7)2000g離心5分鐘，棄取上清，用PBS重懸，再離心，再去上清，對四元阻抗微球芯片進(jìn)行洗滌，徹底洗去離心管中游離的待測抗體。
8)加入含有熒光標(biāo)記的抗抗體(抗人類免疫球蛋白抗體)PBS溶液500毫升，37℃震蕩保溫40分鐘，使它們分別與結(jié)合在微球上的待測抗體反應(yīng)，重復(fù)第7)步，對微球進(jìn)行徹底洗滌，棄取上清液，保留微球沉淀。
9)將微球熒光測定試劑，重懸微球沉淀，使用阻抗變量微球液態(tài)生物芯片檢測裝置，進(jìn)行微球阻抗(測定項目)和微球表面熒光強(qiáng)度(物質(zhì)含量)測定，通過數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)，分析抗HAV、HBV、HCV和HDV四種抗體的含量。
10)結(jié)果判讀如果n1阻抗微球表面熒光陽性，說明血清HAV抗體陽性，熒光強(qiáng)度與HAV抗體濃度呈正比。采用HAV抗體標(biāo)準(zhǔn)濃度做參比測定，可對HAV抗體進(jìn)行準(zhǔn)確定量。如果n2、n3和n3阻抗微球表面熒光同時陽性，說明血液內(nèi)同時存在HAV抗體、HBV抗體、HCV抗體和HDV抗體，依次類推。
以上操作事例只起示范作用，具體詳見有關(guān)技術(shù)資料和文獻(xiàn)。如果要測n種抗體物質(zhì)，需要n種不同電阻的微球，操作同上。
實(shí)施例3測定某微生物的特異核酸(DNA或RNA)片段，能夠特異診斷機(jī)體存在該微生物感染。核酸能夠按照堿基互補(bǔ)結(jié)合原理，進(jìn)行特異雜交。發(fā)明人以同時測定甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和丁型肝炎病毒(HDV)特異DNA或RNA片段為例，加以說明DNA或RNA類物質(zhì)測定的操作步驟。
1)將導(dǎo)電物質(zhì)和乳膠原料，按1∶10000、1∶20000、1∶30000、1∶40000的重量份進(jìn)行混合，制作4種不同阻抗可供核酸(DNA)標(biāo)記的胺化乳膠微球。
2)預(yù)設(shè)不同阻抗(n1，n2，n3和n4)分別代表HAV，HBV，HCV和HDV特RNA或DNA片段測定項目，將阻抗與待測物質(zhì)對應(yīng)信息，輸入阻抗變量微球液態(tài)生物芯片檢測裝置軟件系統(tǒng)。
3)購買或自己合成HAV，HBV，HCV和HDV病毒特異DNA或RNA的互補(bǔ)堿基序列DNA。
4)將HAV，HBV，HCV和HDV病毒特異DNA的互補(bǔ)堿基序列DNA片段，分別共價結(jié)合在n1，n2，n3和n4不同阻抗微球表面，制作四元基因診斷微球芯片。
5)2000g離心5分鐘，棄去游離未標(biāo)記上的HAV，HBV，HCV和HDV病毒特異DNA的互補(bǔ)堿基序列DNA片段。四種免疫微球用磷酸緩沖液(PBS)洗滌，離心后用核酸分子雜交液進(jìn)行重懸，制成10％微球濃度的四元基因診斷液態(tài)芯片。
6)將250微升四元微球基因芯片放入1毫升的EF離心管內(nèi)，再加250微升血清或其他測定標(biāo)本，充分混勻，37℃震蕩保溫1小時，使微球表面已知DNA和樣品中待測DNA或RNA分子充分雜交結(jié)合。
7)2000g離心5分鐘，棄取上清，用PBS重懸，再離心，再去上清，對四元阻抗微球基因芯片進(jìn)行洗滌，徹底洗去離心管中未與乳膠表面DNA雜交上的游離待測DNA或RNA片段。
8)加入含有熒光物質(zhì)標(biāo)記的HAV，HBV，HCV和HDV病毒特異DNA或RNA的互補(bǔ)DNA片段(多元探針，該互補(bǔ)序列不同用于標(biāo)記的DNA序列)的雜交緩沖液500毫升，37℃震蕩保溫1小時-12小時，使它們分別與結(jié)合在微球上的待測DNA或RNA雜交，重復(fù)第7)步，對微球進(jìn)行徹底洗滌，棄取上清液未雜交上的游離多元探針，保留微球沉淀。
9)將微球熒光或發(fā)光測定試劑，重懸微球沉淀，使用阻抗變量微球液態(tài)生物芯片檢測裝置，進(jìn)行微球阻抗(測定項目)和微球表面熒光強(qiáng)度(物質(zhì)含量)測定，通過數(shù)據(jù)分析軟件系統(tǒng)，分析HAV、HBV、HCV和HDV特異DNA或RNA含量。
10)結(jié)果判讀如果n2阻抗微球表面熒光陽性，說明血清HBV病毒RNA陽性，熒光強(qiáng)度與DNA濃度呈正比。采用HBV病毒DNA標(biāo)準(zhǔn)濃度做參比測定，可對HBV病毒DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。如果n1、n2、n3和n4阻抗微球表面熒光同時陽性，說明血液內(nèi)同時存在HAV病毒特異RNA、HBV病毒特異DNA，HCV病毒特異RNA和HDV病毒特異RNA片段，依次類推。
以上操作事例只起示范作用，具體詳見有關(guān)技術(shù)資料和文獻(xiàn)。如果要測n種微生物DNA或RNA物質(zhì)，需要n種不同電阻的微球，操作同上。
權(quán)利要求
1.一種不同阻抗系列免疫微球，包括乳膠微球，其特征在于免疫微球含不同濃度的金屬和碳粉末導(dǎo)電成分，導(dǎo)電物質(zhì)和乳膠原料，按1∶10-1∶100000000的重量份進(jìn)行混合，免疫微球直徑為50--100微米。
2.如權(quán)利要求1所述不同阻抗系列免疫微球，其特征在于1)不同阻抗系列免疫微球表面共價結(jié)合不同特異性抗原、抗體或特異DNA片段，2)相同阻抗系列免疫微球表面共價結(jié)合相同特異性抗原、抗體或特異DNA片段，3)不同阻抗系列免疫微球表面共價結(jié)合的特異性抗原、抗體或特異DNA片段，是針對正常人或患者機(jī)體內(nèi)具有診斷價值的待測相應(yīng)抗體，抗原、特異DNA片段。
3.如權(quán)利要求1或2所述的不同阻抗系列免疫微球的制備方法，其特征在于1)將導(dǎo)電物質(zhì)和乳膠原料，按1∶10--1∶100000000進(jìn)行混合，生產(chǎn)出不同電阻特征的乳膠微球，2)按不同阻抗數(shù)值微球代表不同待測物質(zhì)，不同阻抗數(shù)值段微球代表不同系列待測物質(zhì)，將不同阻抗微球表面，標(biāo)記不同的特異性抗原、抗體和特異DNA片段。
4.一種如權(quán)利要求1或2所述的不同阻抗系列免疫微球的檢測方法，其特征在于1)將不同阻抗系列免疫微球與待測樣品混合，進(jìn)行抗原抗體特異結(jié)合和核酸分子雜交，然后用磷酸緩沖液即PBS洗滌微球；2)將洗滌后微球與熒光標(biāo)記的特異抗體、抗原或DNA片段，進(jìn)行特異結(jié)合，使不同阻抗系列免疫微球表面出現(xiàn)熒光或發(fā)光，熒光或發(fā)光微球經(jīng)離心后，再用PBS洗滌重新懸浮。3)洗滌后不同阻抗系列免疫熒光或發(fā)光微球，首先通過血球記數(shù)儀，進(jìn)行微球阻抗分析，判斷檢測物質(zhì)種類，然后通過流式細(xì)胞儀，進(jìn)行不同微球表面熒光或發(fā)光強(qiáng)度分析，根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度，計算待測物質(zhì)含量。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于將10％濃度的不同阻抗系列免疫微球，放入離心管中，加入足量待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，35--39℃溫育，2000g離心5--8分鐘，用PBS洗滌2次，棄取上清液，用PBS重懸；再加入熒光或發(fā)光素標(biāo)記的抗體、抗原或DNA片段，35--39℃溫育30-60分鐘，2000g離心5-8分鐘，棄取上清液，留取離心管底部微球，用PBS進(jìn)行重懸，再離心，再用PBS重懸。
6.如權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于對結(jié)合熒光或發(fā)光物質(zhì)的不同阻抗系列免疫微球，經(jīng)PBS洗滌重懸后，加入熒光或發(fā)光測定試劑，首先通過微球阻抗測定裝置測定其阻抗，隨后進(jìn)入微球表面熒光或發(fā)光強(qiáng)度檢測裝置檢測熒光或發(fā)光強(qiáng)度；微球阻抗測定判斷待測物質(zhì)種類，熒光或發(fā)光信號強(qiáng)度測定判斷待測物質(zhì)含量。
7.如權(quán)利要求6所述的一種同時檢測不同阻抗系列免疫微球的阻抗大小和微球表面熒光或發(fā)光信號強(qiáng)度的裝置，其特征在于該裝置包括三個部分，第一部分是微孔阻抗測定裝置，能測定通過微孔的單個微球電阻大??；第二部分是對已經(jīng)通過微孔的微球表面熒光或發(fā)光信號，進(jìn)行定量檢測裝置；第三部分是軟件分析系統(tǒng)，能先后接收微球電阻信號以及該微球表面光信號，準(zhǔn)確分析出不同阻抗微球表面的熒光或發(fā)光信號強(qiáng)度，并在標(biāo)準(zhǔn)參比條件下進(jìn)行定量；三部分為統(tǒng)一而不是分離的系統(tǒng)裝置，所述的軟件分析系統(tǒng)是首先設(shè)定微球阻抗值代表的測定項目，然后分析不同阻抗即測定項目的微球表面的熒光或光信號強(qiáng)度即物質(zhì)含量，以標(biāo)準(zhǔn)物做參比，計算待測物質(zhì)含量，并將數(shù)據(jù)傳輸給打印機(jī)，打印結(jié)果報告。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種醫(yī)院檢驗診斷試劑及儀器開發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域，本發(fā)明技術(shù)方案包括1)制備不同阻抗系列微球。2)將已知抗原、抗體和DNA片段包被在不同阻抗微球上，制成診斷微球芯片，3)加入熒光或發(fā)光物標(biāo)記的第二抗體或DNA片段，使不同阻抗的診斷微球表面帶有光信號，4)對微球進(jìn)行阻抗判讀和光信號量分析。其優(yōu)點(diǎn)是一種測定試劑盒可同時檢測多種待測物質(zhì)。本發(fā)明的阻抗變量微球液態(tài)生物芯片，阻抗變量的無限性決定測定項目的無限性，使測定項目更多，靈敏度更高。此外，不同阻抗診斷微球可以長期保存，測定設(shè)備技術(shù)要求相對比較低，更易產(chǎn)業(yè)化和推廣。
文檔編號G01N33/533GK1588072SQ20041006085
公開日2005年3月2日 申請日期2004年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月13日
發(fā)明者王占科, 胡新勇, 祝仲珍, 柴長春, 馮青青, 楊莉萍, 李國輝 申請人:王占科