磁性分離的制作方法
【專利說(shuō)明】磁性分離
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2013年11月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)61/908,473的權(quán)益，該申請(qǐng)通過(guò)引用以其全部?jī)?nèi)容結(jié)合在此。
[0003]背景
[0004]生物分子的分離是任何樣品加工系統(tǒng)的關(guān)鍵部分。對(duì)于所有生物化學(xué)過(guò)程來(lái)說(shuō)，靶樣品的分離和純化是其成功的關(guān)鍵。生物化學(xué)分析過(guò)程中的限制-焦磷酸測(cè)序、核酸連接、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、數(shù)字PCR、qPCR、核酸測(cè)序、蛋白檢測(cè)/蛋白強(qiáng)化、遺傳珠涂覆、稀少細(xì)胞檢測(cè)以及細(xì)胞富集-并且不限于這些，歸因于靶標(biāo)的起始濃度以及分析中使用的反應(yīng)樣品內(nèi)存在的生物化學(xué)抑制劑的水平。
[0005]對(duì)于大多數(shù)生物化學(xué)分析，要對(duì)樣品進(jìn)行一系列預(yù)分析步驟以從最初樣品中分離靶標(biāo)并且去除生物化學(xué)抑制劑。典型地，這些步驟是費(fèi)時(shí)和費(fèi)力的并且最終降低靶標(biāo)的起始濃度。
[0006]—種樣品純化方法利用旋轉(zhuǎn)離心柱。然而，旋轉(zhuǎn)離心柱需要多個(gè)離心步驟，并且因此不可與自動(dòng)化DNA文庫(kù)制備平臺(tái)整合。類似地，用于從瓊脂糖凝膠中純化核酸片段的純化技術(shù)也需要多個(gè)離心步驟以實(shí)現(xiàn)核酸分離。
[0007]用于樣品純化的一項(xiàng)技術(shù)是基于順磁性珠粒的純化。該方法提供了一種可提供改進(jìn)的DNA恢復(fù)率和可調(diào)緩沖條件的途徑，這些條件可以用于選擇性地結(jié)合特定的DNA片段大小。
[0008]該基于順磁性珠粒的純化是一種靜態(tài)孔分批法。當(dāng)前的方法涉及將珠?；旌衔?順磁性珠粒和一種緩沖液-連同最初樣品移液至微量滴定板的孔中。將該溶液移液、混合、并在室溫下孵育以使DNA結(jié)合至這些珠粒。然后將該微量滴定板置于磁性板上。具有該結(jié)合的DNA的這些珠粒移動(dòng)到該板的邊緣并且被磁體保持。接下來(lái)，使用移液管將上清液(包含廢物)去除并且丟棄。然后進(jìn)行多個(gè)洗滌步驟以去除存在于珠狀小球上/處的殘余廢物。將乙醇移液至含有該珠狀小球的板，孵育并且然后使用移液管去除。重復(fù)該洗滌步驟兩次。然后添加洗脫緩沖液。將該板從該磁性板中移除，并且通過(guò)移液管混合將該洗脫緩沖液混合。將該微量滴定板放回到該磁性板上。然后，使用移液管將含有經(jīng)純化的DNA的洗脫液取出。
[0009]該基于順磁性珠粒的方案是一項(xiàng)勞動(dòng)密集型過(guò)程，并且其自動(dòng)化是復(fù)雜的。移液步驟數(shù)量多還導(dǎo)致最初和最終樣品體積大，從而導(dǎo)致每數(shù)據(jù)點(diǎn)的高試劑成本。
[0010]—種應(yīng)用并且不限于該應(yīng)用是為了用于下一代測(cè)序平臺(tái)的改進(jìn)的樣品純化。很多下一代測(cè)序平臺(tái)需要多個(gè)由特定范圍內(nèi)的堿基對(duì)長(zhǎng)度的DNA片段組成的DNA文庫(kù)。此外，這些DNA片段需要用特定核苷酸序列(接頭)進(jìn)行標(biāo)記以使得使用PCR對(duì)這些序列進(jìn)行擴(kuò)增并且使得這些文庫(kù)片段退火至測(cè)序儀流動(dòng)池。當(dāng)在單一流動(dòng)池內(nèi)復(fù)用樣品時(shí)，還可以向這些DNA片段中添加序列特異性指標(biāo)以識(shí)別單獨(dú)樣品。DNA的標(biāo)記片段化(tagmentat1n) (DNA被片斷化并用接頭進(jìn)行標(biāo)記)以及常用接頭和指標(biāo)的添加在兩個(gè)單獨(dú)的生物反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)。在這些反應(yīng)后，清潔該DNA文庫(kù)以移除過(guò)量的核苷酸、酶、引物、鹽及其他污染物。因此，標(biāo)記片段化DNA、純化經(jīng)標(biāo)記片段化的DNA、添加常用接頭和指標(biāo)以及純化最終文庫(kù)產(chǎn)物所需要的工作流程是復(fù)雜且勞動(dòng)密集型的。
[0011]本文概述的系統(tǒng)和方法可有助于實(shí)現(xiàn)樣品處理，該樣品處理可減少(在某些實(shí)施例中可去除)污染并且可實(shí)現(xiàn)低體積、高通量、低成本和/或高樣品濃度。
[0012]概述
[0013]復(fù)合液體池處理系統(tǒng)用于進(jìn)行樣品處理，并且因此通常包括從周圍樣品中磁力分離目標(biāo)分子的能力。高效磁性分離在樣品和試劑體積較小、單個(gè)細(xì)胞中的靶分子數(shù)目也相應(yīng)較小的復(fù)合液體池中特別重要。雖然針對(duì)復(fù)合液體池處理的應(yīng)用而對(duì)在此處描述的某些具體實(shí)施例進(jìn)行了優(yōu)化，所述的裝置和方法也廣泛適用于具有和不具有復(fù)合液體池的系統(tǒng)。
[0014]披露了用于對(duì)順磁性珠粒進(jìn)行磁性分離而用于生物分子的分離和處理的裝置、系統(tǒng)和方法。
[0015]附圖簡(jiǎn)述
[0016]圖1是一種液體處理系統(tǒng)的不意圖。
[0017]圖2A-C展示了圖1的液體處理系統(tǒng)的歧管層。
[0018]圖3A-E展示了圖1的液體處理系統(tǒng)的磁體層。
[0019]圖4展示了圖1的液體處理系統(tǒng)的管導(dǎo)層。
[0020]詳細(xì)描述
[0021]如在先前的申請(qǐng)(如美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)US 20120045765、美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)US20130280726、PCT公開(kāi)號(hào)WO 2012011091、PCT公開(kāi)號(hào)WO 2013111016和PCT公開(kāi)號(hào)WO2014083435，所有這些專利特此通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此)中所解釋的，可使用流體處理系統(tǒng)生成復(fù)合液體池。這種流體處理系統(tǒng)可具有用于吸取和分配液體的液體導(dǎo)管。這些液體導(dǎo)管可以移動(dòng)并對(duì)準(zhǔn)用于從現(xiàn)有的復(fù)合液體池中或從其他位置或結(jié)構(gòu)中吸取和分配流體的特定位置。
[0022]在一些實(shí)施例中，有利的是具有共同作用的多個(gè)液體導(dǎo)管。這些液體導(dǎo)管可以布置成任何形式，例如布置成一條線、矩形或笛卡爾網(wǎng)格或六邊結(jié)構(gòu)。每個(gè)液體導(dǎo)管通常具有工作端，可從該工作端分配液體，并且可將液體吸入工作端。這些液體導(dǎo)管可以是毛細(xì)管，即具有親水性的內(nèi)表面以及必要的幾何形狀而通過(guò)毛細(xì)作用吸入水溶液或純水?？商娲?，在工作端的對(duì)側(cè)，這些液體導(dǎo)管可以附接到能夠產(chǎn)生足以吸入液體或空氣的負(fù)壓的栗上。這種栗還可以被構(gòu)造成產(chǎn)生正壓以將液體從所述導(dǎo)管的工作端分配出去。不管液體導(dǎo)管是否能夠產(chǎn)生毛細(xì)作用，都可以包括栗。
[0023]在許多生化實(shí)驗(yàn)方案中，從較大的生物樣品中分離目標(biāo)生物分子(例如DNA)是有用的或必需的。用于這種分離的一種方便的方法是通過(guò)使目標(biāo)分子與磁性珠粒在溶液中結(jié)合，施加磁場(chǎng)而使珠粒與其結(jié)合的目標(biāo)分子固定，并且使洗滌溶液流經(jīng)固定化的珠粒以除去除了固定結(jié)合的目標(biāo)分子以外的其他原始樣品材料。一旦目標(biāo)分子已被如此分離，可以去除磁場(chǎng)，并且釋放目標(biāo)分子用于進(jìn)一步的處理。
[0024]這種磁性分離可在如上所述的流體處理系統(tǒng)中來(lái)完成。一個(gè)或多個(gè)磁體可與各液體導(dǎo)管相關(guān)聯(lián)。磁體可以連接到致動(dòng)器或能夠在至少兩個(gè)位置之間移動(dòng)各磁體的致動(dòng)器，在第一個(gè)位置處，磁體與液體導(dǎo)管間隔開(kāi)，在第二位置處，磁體與液體導(dǎo)管并置。在一些實(shí)施例中，兩個(gè)磁體可與各液體導(dǎo)管相關(guān)聯(lián)。磁體可以沿著導(dǎo)管的流動(dòng)軸線的方向而間隔開(kāi)。將磁體沿著導(dǎo)管的流動(dòng)軸線的方向而間隔開(kāi)可以提高分離效率。流過(guò)第一個(gè)磁體時(shí)未被固定的任何珠粒隨后會(huì)流過(guò)第二個(gè)磁體。鑒于給定的珠粒在經(jīng)過(guò)單個(gè)磁體時(shí)無(wú)法被固定的可能性較小，珠粒在經(jīng)過(guò)兩個(gè)磁體時(shí)無(wú)法被固定的可能性會(huì)更小，是較小可能性的平方。這種效率的提高在處理復(fù)合液體池時(shí)是有利的，因?yàn)樗婕暗捏w積如此之小。當(dāng)用較大量液體進(jìn)行處理時(shí)，不能使一小部分磁性珠粒固定化不用太多關(guān)注。自然地，如果需要更高效的固化化，可以使用串聯(lián)的三個(gè)、四個(gè)或更多的磁體。
[0025]在圖1中展示了這種流體處理系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施例。系統(tǒng)I具有三層:歧管層2、磁體層3和管導(dǎo)層4。為了清楚起見(jiàn)，示出了沒(méi)有液體導(dǎo)管的系統(tǒng)。
[0026]圖2A單獨(dú)地展示了歧管層2。歧管層2包括四個(gè)通常是線性的模塊201、202、203、204，各模塊具有六個(gè)輸入口 205。圖2B示出了單獨(dú)的一個(gè)單線性模塊204，可從模塊204的頂部看到其輸入口 205。圖2C示出了同一個(gè)線性模塊204，其近壁面被去除以展現(xiàn)模塊的內(nèi)部。各輸入口 205連接到將流體路徑分成四個(gè)輸出口的支管206。輸出口位于歧管層2面向磁體層3的一側(cè)。因此，歧管層2將總共二十四條輸入管線分成九十六條輸出管線。而在一些實(shí)施例中，歧管可構(gòu)成所展示的單獨(dú)的線性模塊，在另一些實(shí)施例中，歧管可以是一個(gè)單一元件，在某些情況下是整體件或整合件。在一些實(shí)施例中，歧管可由如圖2A-C所示可以是線性的或可以不是線性的較小的模塊的組合組成。在任何給定的實(shí)施例中，歧管中的端口數(shù)目不必是如圖所示的96個(gè)，可以為特定的應(yīng)用而進(jìn)行調(diào)整，如可以是輸入和/或輸出口的幾何布局。
[0027]圖3A單獨(dú)地展示了磁體層3。磁體層3包括四個(gè)二十四線磁體模塊301、302、303、304 ο圖3B單獨(dú)地展示了單磁體模塊304。磁體模塊包括插口 305、以及可在插口 305內(nèi)可滑動(dòng)地移位的磁體螺栓306。圖3C示出了同一個(gè)磁體模塊304，將其插口 305的一側(cè)移除以便看到磁體螺栓306的整個(gè)長(zhǎng)度。槽縫307會(huì)保持磁體，為了清楚起見(jiàn)將其省略。圖3D以橫截面示出了磁體層3。該橫截面穿過(guò)液體導(dǎo)管308，并且示出了與液體導(dǎo)管308對(duì)齊的磁體槽縫307。圖3E以水平截面示出了磁體層3，以便可以看到所有的九十六個(gè)磁體槽縫307。
[0028]磁體螺栓306可被致動(dòng)器擊發(fā)到插口305中的完全插入的位置。如圖3A_E所示，在這個(gè)完全插入的位置，兩個(gè)磁體與各液體導(dǎo)管是并置的?？商娲?，致動(dòng)器可將螺栓306移動(dòng)到撤回位置，未示出。磁體螺栓306位于兩行(各十二個(gè)液體導(dǎo)管)之間。在所示的實(shí)施例中，磁體螺栓306可包含四十八個(gè)磁體，每個(gè)液體導(dǎo)管308有兩個(gè)，在每個(gè)槽縫307中有兩個(gè)分立的磁體?？商娲?，每個(gè)螺栓可只包括十二個(gè)磁體槽縫，每個(gè)槽縫中有兩個(gè)單獨(dú)的磁體，這些磁體水平穿過(guò)螺栓，以便每個(gè)磁體可在螺栓306的對(duì)側(cè)與兩個(gè)液體導(dǎo)管并置。磁體螺栓306可包含二十四個(gè)磁體，設(shè)置這些磁體按大小并安排在螺栓中，以便當(dāng)螺栓被擊發(fā)時(shí)，每個(gè)磁體與兩個(gè)液體導(dǎo)管并置，螺栓的每側(cè)各有一個(gè)。在其他實(shí)施例中，可能有磁體的不同安排。
[0029]圖4展示了管導(dǎo)層4。管導(dǎo)層的功能是保持液體導(dǎo)管筆直。盡管為了清楚起見(jiàn)已經(jīng)省略了，管導(dǎo)層4通常會(huì)通