針對(duì)msk1基因的相關(guān)制劑在制備5-fu耐藥性檢測(cè)試劑及5-fu耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及5-FU耐藥性檢測(cè)試劑及5-FU耐藥逆轉(zhuǎn)劑，更具體地說(shuō)，涉及MSK1相關(guān)制劑在制備5-FU耐藥性檢測(cè)試劑及5-FU耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的應(yīng)用。5-FU藥物耐藥性/敏感性與細(xì)胞MSK1表達(dá)量之間具有顯著的關(guān)聯(lián)性。當(dāng)細(xì)胞低表達(dá)MSK1時(shí)，對(duì)5-FU藥物的敏感性高；反之，當(dāng)細(xì)胞高表達(dá)MSK1時(shí)，對(duì)5-FU藥物的敏感性降低。本發(fā)明首次提供了MSK1表達(dá)量檢測(cè)試劑或測(cè)試系統(tǒng)在制備5-FU藥物耐藥性/敏感性檢測(cè)試劑中的應(yīng)用；以及MSK1表達(dá)抑制劑在制備5-FU藥物增敏劑/耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】針對(duì)MSK1基因的相關(guān)制劑在制備5-FU耐藥性檢測(cè)試劑及 5-FU耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及5-FU耐藥性檢測(cè)試劑及5-FU耐藥逆轉(zhuǎn)劑。

【背景技術(shù)】
[0002] 化療藥5-FU用于治療腫瘤已有40余年，可通過(guò)多種途徑發(fā)揮作用，其中最主要的 作用方式是作為胸苷酸合成酶抑制劑，阻斷DNA復(fù)制的必需原料--胸腺嘧啶的合成。胸 苷酸合成使單磷酸脫氧尿嘧啶（dUMP)發(fā)生甲基化從而變成單磷酸胸腺嘧啶（dTMP)。
[0003] 與其它抗腫瘤藥類似，5-FU作用于全身各個(gè)系統(tǒng)，快速分裂的細(xì)胞（如腫瘤細(xì)胞， 亦包括消化道上皮細(xì)胞以及生殖細(xì)胞）因其核酸合成活動(dòng)活躍而受到的影響最大。
[0004] 5-FU主要用于結(jié)直腸癌以及前列腺癌的治療，數(shù)十年前就已建立了標(biāo)準(zhǔn)的化療方 案。結(jié)直腸癌對(duì)5-FU的耐藥機(jī)制主要有固有耐藥和獲得性耐藥兩種，隨著化療方案的進(jìn) 行，獲得性耐藥一般很難逆轉(zhuǎn)。
[0005] 因此，在化療前先對(duì)患者的5-FU耐藥性進(jìn)行一定的預(yù)測(cè)，以及開(kāi)發(fā)5-FU藥物增敏 齊U，具有突出的臨床應(yīng)用意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的之一在于提供一種5-FU藥物耐藥性/敏感性檢測(cè)試劑，可用以判斷患 者對(duì)5-FU藥物的耐藥性/敏感性。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種5-FU藥物增敏劑/耐藥逆轉(zhuǎn)劑，可用以提高患 者對(duì)5-FU藥物的敏感性。
[0008] 發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，5-FU藥物耐藥性/敏感性與細(xì)胞MSK1表達(dá)量之間具有顯著 的關(guān)聯(lián)性。當(dāng)細(xì)胞中MSK1表達(dá)量低時(shí)，對(duì)5-FU藥物的敏感性高；反之，當(dāng)細(xì)胞中MSK1表達(dá) 量高時(shí)，對(duì)5-FU藥物的敏感性降低。
[0009] 本發(fā)明首次提供了 MSK1檢測(cè)試劑或測(cè)試系統(tǒng)在制備5-FU藥物耐藥性/敏感性 檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。所述的MSK1檢測(cè)試劑可以檢測(cè)MSK1的表達(dá)量，可以是用以檢測(cè)MSK1 mRNA或蛋白量的檢測(cè)試劑。
[0010] 優(yōu)選地，所述的MSK1檢測(cè)試劑或測(cè)試系統(tǒng)用于制備結(jié)直腸癌患者對(duì)5-FU藥物的 耐藥性/敏感性檢測(cè)試劑。
[0011] 在研究過(guò)程中，發(fā)明人以結(jié)直腸癌細(xì)胞作為主要研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌細(xì)胞 中，MSK1表達(dá)量可以作為5-FU藥物耐藥性/敏感性的判斷指標(biāo)。
[0012] 發(fā)明同時(shí)提供了一種用于判斷結(jié)直腸癌患者對(duì)5-FU藥物耐藥性/敏感性的試劑 盒，含有MSK1檢測(cè)試劑。
[0013] 同時(shí)，發(fā)明提供了 MSK1抑制劑在制備5-FU藥物增敏劑/耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的應(yīng)用。 MSK1抑制劑可以用作結(jié)直腸癌患者對(duì)5-FU藥物的藥物增敏劑/耐藥逆轉(zhuǎn)劑。
[0014] 作為可選的方案，MSK1抑制劑可以是現(xiàn)有的能抑制或降低MSK1表達(dá)水平的物質(zhì)， 例如針對(duì)MSK1基因的shRNA干擾片段、小分子化合物抑制劑等。
[0015] 發(fā)明還提供了一種治療癌癥的藥物，含有5-FU藥物和MSK1抑制劑。所述癌癥為 已知的可采用5-FU藥物進(jìn)行治療的癌癥，例如結(jié)直腸癌、消化道腫瘤、乳腺癌、卵巢癌、絨 毛膜上皮癌、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、皮膚癌等。
[0016] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通過(guò)基因工程手段將原本低表達(dá)MSK1蛋白的野生型結(jié)直腸癌細(xì) 胞改造為高表達(dá)MSK1蛋白的細(xì)胞時(shí)，其對(duì)5-FU藥物的敏感性降低，IC50值明顯提高。而 當(dāng)將原本高表達(dá)MSK1蛋白的野生型結(jié)直腸癌細(xì)胞改造為低表達(dá)MSK1蛋白的細(xì)胞時(shí)，則對(duì) 5-FU藥物的敏感性提高，IC50值明顯降低，可以降低給藥量。
[0017] 因此，MSK1表達(dá)量高低可以作為患者對(duì)5-FU藥物敏感性判斷的一個(gè)重要指標(biāo)。同 時(shí)，在給患者采用5-FU藥物治療時(shí)，同時(shí)給以能降低或抑制MSK1蛋白表達(dá)的藥物，將能提 高5-FU藥物的敏感性，降低5-FU用藥量及副作用。
[0018] 在化療前先對(duì)病人5-FU藥物敏感性的預(yù)測(cè)，對(duì)于不敏感的病人進(jìn)行一定手段的 干預(yù)，可以進(jìn)一步減少獲得性耐藥的產(chǎn)生，從而減少由于盲目增大藥物用量而引起的毒副 作用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為能表達(dá)針對(duì)MSK1基因的shRNA干擾片段的質(zhì)粒圖譜
[0020] 圖2為能表達(dá)對(duì)所有基因均無(wú)干擾效果的對(duì)照shRNA的質(zhì)粒圖譜
[0021] 圖3為超表達(dá)MSK1基因的質(zhì)粒的圖譜
[0022] 圖4為未插入外源基因的空載體對(duì)照質(zhì)粒的圖譜
[0023] 圖5為MSK1蛋白表達(dá)量的Western鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A為HCT116細(xì)胞對(duì)照組及實(shí) 驗(yàn)組結(jié)果；B為Cac 〇2細(xì)胞對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組結(jié)果
[0024] 圖6為半數(shù)致死量5-FU濃度比較；A為HCT116實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組結(jié)果；B為Caco2 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組結(jié)果

【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下實(shí)施方式是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不局限于以下的實(shí) 施例介紹，凡依照本發(fā)明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應(yīng)視為本發(fā)明保護(hù)的范 疇。
[0026] 實(shí)施例1 MSK1高表達(dá)/低表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建
[0027] 本實(shí)施例以兩種結(jié)直腸癌細(xì)胞：野生型Cac〇2(本身為MSK1蛋白低表達(dá)細(xì)胞）和 野生型HCT116細(xì)胞（本身為MSK1蛋白高表達(dá)細(xì)胞）為研究對(duì)象，進(jìn)一步構(gòu)建MSK1蛋白高 表達(dá)的Caco2細(xì)胞（本專利記為Caco2-MSKl細(xì)胞），以及MSK1蛋白低表達(dá)的HCT116細(xì)胞 (本專利記為HCT116-shMSKl細(xì)胞）。
[0028] 超表達(dá)MSK1基因的質(zhì)粒構(gòu)建委托上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司完成，用于制 備慢病毒后感染野生型Cac 〇2細(xì)胞；表達(dá)干擾MSK1基因 shRNA片段的質(zhì)粒構(gòu)建委托長(zhǎng)沙贏 潤(rùn)生物技術(shù)有限公司完成，直接轉(zhuǎn)染野生型HCT116細(xì)胞；作為對(duì)照組所采用的對(duì)照細(xì)胞， 以空載體對(duì)照質(zhì)粒制備慢病毒后感染野生型Cac 〇2細(xì)胞，成為Cac〇2對(duì)照細(xì)胞（本專利記 為Cac〇2-Ctrl細(xì)胞）；另外以對(duì)照shRNA質(zhì)粒（對(duì)所有基因均無(wú)干擾效果）轉(zhuǎn)染野生型 HCT116細(xì)胞，成為HCT116對(duì)照細(xì)胞（本專利記為HCT116-shCtrl)。上述質(zhì)粒圖譜分別如 圖1-4所示。
[0029] 慢病毒感染Caco2細(xì)胞流程：
[0030] 1、六孔板中每孔接種5X 104野生型Caco2細(xì)胞，用DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco,貨號(hào) C11330500BT)培養(yǎng) 24h，長(zhǎng)到 50% -60%。
[0031] 2、第二天，每孔吸棄300ul培養(yǎng)基。解凍病毒液。
[0032] 3、用培養(yǎng)基直接稀釋病毒液，使得病毒的感染復(fù)數(shù)（Μ0Ι)為100。
[0033] 4、配制好感染復(fù)數(shù)（Μ0Ι)為100的病毒液后，向其中加入Polybrene感染添加劑 至終濃度8ug/ml，將病毒液與細(xì)胞混勻后放入37°C，C0 2培養(yǎng)箱。
[0034] 5、6h后每孔加入300ul細(xì)胞培養(yǎng)液，感染至48h后換液。
[0035] 6、用終濃度為0. 5ug/ml的嘌呤霉素篩選實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞。
[0036] 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞流程：
[0037] 1、六孔板中每孔接種5X104野生型HCT116細(xì)胞，培養(yǎng)24h，長(zhǎng)到50% -60%。
[0038] 2、第二天，每孔吸棄2ml培養(yǎng)基，用無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco,貨號(hào) C11330500BT)洗 2 次。
[0039] 3、每孔加入1. 5ml的無(wú)血清無(wú)雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，解凍質(zhì)粒。
[0040] 4、配制轉(zhuǎn)染試劑：向1ml Opti-mem培養(yǎng)基（Gibco,貨號(hào)31985-062)中加入 10 ul I」pofectamine.KlLTX and PLUS?Reagents 化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen,貨號(hào)： 15338-100)中的PLUS試劑，再加入10ug質(zhì)粒，混勻，室溫放置10min。取上述混合物750ul， 加入 750ul Opti-mem 培養(yǎng)基和 22. 5ul Lip〇fectamine?LTX and PLUS?Reagents 化學(xué)轉(zhuǎn) 染試劑盒（Invitrogen，貨號(hào)：15338-100)中的LTX試劑，吸打混勻，室溫放置30min，即配 制好轉(zhuǎn)染試劑。
[0041] 5、每孔加入500ul轉(zhuǎn)染試劑，混勻后放入37°C，C02培養(yǎng)箱。
[0042] 6、6h后換成含血清培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染至48h后換液，在熒光顯微鏡下觀察熒光。
[0043] 7、用終濃度為lOOOug/ml的G418篩選實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞。
[0044] 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株名稱及定義如下：
[0045] 1、Caco2_Ctrl細(xì)胞：野生型Caco2細(xì)胞本身為一種MSK1蛋白低表達(dá)的細(xì)胞， Cac〇2-Ctrl細(xì)胞是指用對(duì)MSK1蛋白表達(dá)無(wú)影響的病毒感染野生型Cac〇2細(xì)胞后穩(wěn)定篩選 所得細(xì)胞株。即Cac 〇2-Ctrl細(xì)胞仍為MSK1蛋白低表達(dá)細(xì)胞株。
[0046] 2、Caco2_MSKl細(xì)胞：野生型Caco2細(xì)胞本身為一種MSK1蛋白低表達(dá)的細(xì)胞， Cac〇2-MSKl細(xì)胞是指用可使MSK1蛋白超表達(dá)的病毒感染后穩(wěn)定篩選所得細(xì)胞株。即 Caco2-MSKl細(xì)胞為MSK1蛋白高表達(dá)細(xì)胞株。
[0047] 3、HCT116-shCtrl細(xì)胞：野生型HCT116細(xì)胞本身為一種MSK1蛋白高表達(dá)的細(xì)胞， HCT116-shCtrl細(xì)胞是轉(zhuǎn)染入對(duì)MSK1蛋白表達(dá)無(wú)影響的質(zhì)粒后穩(wěn)定篩選所得細(xì)胞株。即 HCT116-shCtrl細(xì)胞仍為MSK1蛋白高表達(dá)細(xì)胞株。
[0048] 4、HCT116-shMSKl細(xì)胞：野生型HCT116細(xì)胞本身為一種MSK1蛋白高表達(dá)的細(xì) 胞，HCT116-shMSKl細(xì)胞是轉(zhuǎn)染入干擾MSK1蛋白表達(dá)的質(zhì)粒后穩(wěn)定篩選所得細(xì)胞株。即 HCT116-shMSKl細(xì)胞為MSK1蛋白低表達(dá)細(xì)胞株。
[0049] 實(shí)施例2 MSK1蛋白表達(dá)量的Western鑒定實(shí)驗(yàn)
[0050] 對(duì)實(shí)施例1的4種細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定：
[0051] 1、提取蛋白
[0052] (l)900rpmX4min 收集細(xì)胞沉淀。
[0053] (2)用PBS緩沖液將細(xì)胞洗2遍，棄去上清后加入M-PER細(xì)胞裂解液（Thermo Scientific Pierce，貨號(hào) 78503)，混勻后冰上放置 30min。
[0054] (3)4°C離心，12000rpm, lOmin，取上清。
[0055] (4)加入 5XSDS buffer，10(TC變性 5min。
[0056] 2、按照Western實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行蛋白表達(dá)鑒定，大致如下：
[0057] (1)電泳：分離膠電泳條件：80V20min ;濃縮膠電泳條件：120V50min。
[0058] (2)電轉(zhuǎn)：用半干轉(zhuǎn)移儀Oio-rad，型號(hào)Bolt-turbo)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，條件為20V、 0· 5A、50min〇
[0059] ⑶封閉：用PBST配制5%的脫脂奶粉，完全溶解之后，把帶有目的蛋白的NC膜浸 泡在脫脂牛奶中，室溫下在搖床上封閉lh。
[0060] (4)孵育一抗：按照1:1000比例稀釋MSK1蛋白的抗體（Bethyl，貨號(hào)A302-747A)， 按照1:10000比例稀釋Actin蛋白的抗體（Proteintech，貨號(hào)60008-1-Ig)，冰上孵育2h 后，4°C過(guò)夜。
[0061] (5)洗膜：PBST 洗 3 遍，每次 10min。
[0062] (6)孵二抗：分別用帶熒光的兔抗（LIC0R，貨號(hào)926-32211)和帶熒光的鼠抗 (LIC0R，貨號(hào)926-68020)孵育帶MSK1蛋白和帶Actin蛋白的膜，避光孵育lh。
[0063] (7)漂洗：用 PBST 洗 3 遍，每次 10min。
[0064] (8)用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)（LIC0R，型號(hào)0DY-3153)掃描。
[0065] 結(jié)果如圖5所示。由結(jié)果可見(jiàn)，在內(nèi)參蛋白（Actin)表達(dá)一致的情況下，HCT116 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中（圖5A)，MSK1蛋白的實(shí)驗(yàn)組（HCT116-shMSKl組）蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組 (HCT116-shCtrl組）；而Caco2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中（圖5B)，MSK1蛋白的實(shí)驗(yàn)組（Caco2-MSKl組） 蛋白表達(dá)量高于對(duì)照組（Caco2-Ctrl組）。Western鑒定結(jié)果證明成功構(gòu)建出抑制MSK1蛋 白表達(dá)的HCT116細(xì)胞株和超表達(dá)MSK1蛋白的Caco2細(xì)胞株。
[0066] 實(shí)施例3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
[0067] 1、使用RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析儀（Roche，型號(hào)Xcelligence)進(jìn)行細(xì)胞動(dòng)態(tài)培 養(yǎng)檢測(cè)，在E-plate板上各孔加入100ul帶不同5-FU濃度梯度的培養(yǎng)基，濃度梯度如下： 100uM、50uM、25uM、12. 5uM、6. 25uM、3. 12uM。
[0068] 2、測(cè)定基線。
[0069] 3、向E-plate中每孔再加入100ul細(xì)胞懸液（含5000個(gè)細(xì)胞），使得E-plate各 孔中 5-FU 的實(shí)際濃度梯度變?yōu)椋?0uM、25uM、12. 5uM、6. 25uM、3. 12uM、l. 56uM。
[0070] 4、啟動(dòng)儀器進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，并取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異最大的時(shí)間點(diǎn)作為計(jì)算IC50 的時(shí)間點(diǎn)，使用GraphPad Prism 5軟件繪制細(xì)胞存活率與5-FU濃度對(duì)數(shù)值的關(guān)系圖。
[0071] 結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過(guò)換算，測(cè)得HCT116-shCtrl組的IC5Q值為5. luM;而 HCT116-shMSKl 組的 IC5(I 值只有 2. 7uM。Caco2-Ctrl 組的 IC5(I 值為 2. 7uM ;而 Caco2-MSKl 組的IC5Q值高達(dá)11. 7uM。
[0072] 也即是說(shuō)，若要使細(xì)胞達(dá)到半數(shù)致死量，HCT116細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組所需的5-FU濃度更 低，即對(duì)5-FU較敏感。而Cac〇2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組達(dá)到半數(shù)致死量所需的5-FU濃度更高，即對(duì) 5-FU較不敏感。
[0073] HCT116細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（HCT116-shMSKl)是野生型HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)染入對(duì)MSK1蛋白表 達(dá)起降低作用的質(zhì)粒后穩(wěn)定篩選所得細(xì)胞株。即HCT116-shMSKl細(xì)胞為MSK1蛋白低表達(dá) 細(xì)胞株，對(duì)藥物5-FU更加敏感。
[0074] Caco2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組（Caco2_MSKl)是野生型Caco2細(xì)胞轉(zhuǎn)染入對(duì)MSK1蛋白表達(dá)起 增強(qiáng)作用的質(zhì)粒后穩(wěn)定篩選所得細(xì)胞株。即Cac 〇2-MSKl細(xì)胞為MSK1蛋白高表達(dá)細(xì)胞株， 對(duì)藥物5-FU較不敏感。
[0075] 綜上所述，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，MSK1低表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)于5-FU藥物的敏感 性較MSK1高表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞更好，通過(guò)測(cè)定用藥對(duì)象的MSK1表達(dá)量，可以作為判斷用 藥者對(duì)5-FU藥物敏感性的依據(jù)之一。
[0076] 降低細(xì)胞MSK1的表達(dá)可以提高其對(duì)5-FU藥物的敏感性。細(xì)胞過(guò)表達(dá)MSK1則降 低其對(duì)5-FU藥物的敏感性。通過(guò)抑制細(xì)胞MSK1蛋白的表達(dá)，有利于提高細(xì)胞對(duì)5-Fu藥物 的敏感性。
【權(quán)利要求】
1. MSK1檢測(cè)試劑或測(cè)試系統(tǒng)在制備5-FU藥物耐藥性/敏感性檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于制備癌癥患者對(duì)5-FU藥物的耐藥性/敏感性 檢測(cè)試劑。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌癥為結(jié)直腸癌。
4. 一種用于判斷癌癥患者對(duì)5-FU藥物耐藥性/敏感性的試劑盒，其特征在于含有 MSK1檢測(cè)試劑。 5. MSK1抑制劑在制備5-FU藥物增敏劑/耐藥逆轉(zhuǎn)劑方面的應(yīng)用。
6. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于制備癌癥患者對(duì)5-FU藥物的藥物增敏劑/耐 藥逆轉(zhuǎn)劑。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌癥為結(jié)直腸癌。
8. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的MSK1抑制劑為針對(duì)MSK1基因的shRNA 干擾片段或小分子化合物抑制劑。
9. 一種治療癌癥的藥物組合物，其特征在于含有5-FU藥物和MSK1抑制劑。
10. -種治療結(jié)腸癌的藥物組合物，其特征在于含有5-FU藥物和MSK1抑制劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104267188SQ201410431506
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】汪建平, 王磊, 傅新暉 申請(qǐng)人:汪建平, 王磊, 傅新暉