專利名稱：腎臟疾病和損傷的早期檢測(cè)方法
背景技術(shù)：
繼發(fā)于腎小管細(xì)胞損傷的急性腎衰竭(ARF)，所述損傷包括缺血性損傷或腎毒性損傷，在臨床醫(yī)學(xué)和腎病學(xué)上存在普遍和潛在破壞性問題，盡管支持療法取得顯著進(jìn)步，然而仍具有持續(xù)較高的發(fā)病率和死亡率。經(jīng)幾十年的先驅(qū)研究，表明持續(xù)的血管收縮、管閉塞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝改變以及炎癥反應(yīng)在ARF發(fā)病機(jī)理中所起的作用。這些研究已提出在動(dòng)物模型中可能的治療途徑，然而相應(yīng)在人類中取得的效果卻是令人失望的。其原因可能包括腎臟對(duì)缺血性損傷和腎毒性的多方面響應(yīng)，和ARF早期的生物標(biāo)記的缺乏導(dǎo)致延誤了開始治療的時(shí)機(jī)。
當(dāng)患者的血清肌酸酐的值或者(1)當(dāng)基線血清肌酸酐水平小于2.0mg/dL時(shí)增加至少0.5mg/dL；(2)當(dāng)基線血清肌酸酐水平大于或等于2.0mg/dL時(shí)增加至少1.5mg/dL；或者(3)暴露在放射照相性物質(zhì)下之后，不論基線血清肌酸酐水平如何，增加至少0.5mg/dL，該個(gè)體被認(rèn)為患有急性腎衰竭。
據(jù)信，在疾病進(jìn)程的早期采取治療能降低ARF的死亡率并且縮短治療各種類型腎小管細(xì)胞損傷的時(shí)間，所述損傷包括但不限于，缺血性和腎毒性腎臟損傷。對(duì)腎小管細(xì)胞損傷的可靠的、早期生物標(biāo)記的鑒定對(duì)促進(jìn)早期治療介入是有用的，并能通過提供腎毒性的指標(biāo)幫助指導(dǎo)藥物開發(fā)。
傳統(tǒng)的檢測(cè)腎臟疾病的實(shí)驗(yàn)室方法包括測(cè)定血清肌酸酐、血液尿素氮、肌酸酐清除率、尿液電解質(zhì)、尿沉淀物的顯微鏡檢查以及放射學(xué)研究。這些指標(biāo)非但不靈敏、無(wú)特異性，而且也不適用于該疾病的早期檢測(cè)。確實(shí)，血清肌酸酐的上升被廣泛認(rèn)為是檢測(cè)ARF的“最佳標(biāo)準(zhǔn)”，但現(xiàn)已明確，當(dāng)血清肌酸酐變化時(shí)，多達(dá)50％的腎功能已經(jīng)喪失。
早先已描述一些缺血性腎損傷的尿生物標(biāo)記，包括腎損傷分子-1(KIM-1)和富半胱氨酸蛋白(Cyr61)。KIM-1是關(guān)于腎臟恢復(fù)的一種推定的黏附分子。在大鼠的缺血-再灌注損傷模型中，在最初損傷后的24-48小時(shí)后發(fā)現(xiàn)KIM-1上調(diào)，表現(xiàn)出可靠但有些遲的腎小管細(xì)胞損傷的標(biāo)志。最近研究表明KIM-1可在患有缺血性急性腎小管壞死患者的腎活組織檢查和尿中檢測(cè)到。然而，該檢測(cè)是用于已確定患有并處于晚期的缺血性腎臟損傷的患者。早期ARF或亞臨床腎損傷的尿的KIM-1測(cè)量的應(yīng)用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未被驗(yàn)證。
Cyr61蛋白是分泌的富半胱氨酸蛋白，其可在動(dòng)物模型中缺血性腎損傷發(fā)生的3-6小時(shí)后檢測(cè)到。然而，該檢測(cè)要求生物親和的純化過程以及用肝素瓊脂糖珠的濃縮步驟，之后Western blotting實(shí)驗(yàn)。即使在當(dāng)生物親和的純化過程之后，也出現(xiàn)若干非特異性交叉反應(yīng)肽。因此，在尿液中檢測(cè)Cyr61因?yàn)槠涮禺愋院头爆嵉牟襟E成為問題。
因此，迫切需要鑒定針對(duì)早期缺血性和腎毒性腎損傷的改良生物標(biāo)記。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中腎小管細(xì)胞損傷的即時(shí)(immediate)或早發(fā)(early onset)檢測(cè)方法，其包括步驟1)從哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中獲取血清樣品；2)測(cè)定血清樣品中選自即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、和其混合物的生物標(biāo)記水平，和3)評(píng)價(jià)該受試對(duì)象腎小管細(xì)胞損傷情況。
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物中腎小管細(xì)胞損傷的即時(shí)或早發(fā)檢測(cè)方法，其包括步驟1)從哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中獲取血清樣品；2)將血清樣品與針對(duì)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記的抗體接觸，形成抗體和腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記的復(fù)合體，所述腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記包含NGAL；和3)檢測(cè)抗體-生物標(biāo)記復(fù)合體。
本發(fā)明還涉及監(jiān)測(cè)對(duì)腎小管細(xì)胞損傷的治療有效性的方法，包括步驟1)從患有腎小管細(xì)胞損傷的哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中獲取血清樣品；2)從血清樣品測(cè)定選自即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記和其混合物的生物標(biāo)記水平，和3)評(píng)價(jià)該受試對(duì)象腎小管細(xì)胞損傷情況。
本發(fā)明還涉及監(jiān)測(cè)對(duì)腎小管細(xì)胞損傷的治療有效性的方法，包括步驟1)對(duì)患有腎小管細(xì)胞損傷的哺乳動(dòng)物受試對(duì)象提供治療；2)從該受試對(duì)象中獲取至少一份治療后的血清樣品；和3)測(cè)定治療后的血清樣品中選自即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、和其混合物的腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記的存在狀況。
本發(fā)明涉及針對(duì)檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的即時(shí)或早發(fā)生物標(biāo)記的存在狀況的試劑盒(kit)，其包括1)獲取一些血清樣品的裝置；和2)用于檢測(cè)早發(fā)生物標(biāo)記的測(cè)定裝置(assay)。
本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的即時(shí)或早發(fā)生物標(biāo)記在受試對(duì)象血清中的存在狀況的試劑盒，其包括1)獲取一定量的血清樣品的裝置；2)附著俘獲抗體(capture antibody)的介質(zhì)，所述俘獲抗體能夠與選自即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、和其混合物的生物標(biāo)記復(fù)合；以及3)用于檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記和俘獲抗體的復(fù)合物的測(cè)定裝置。
本發(fā)明還涉及競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的試劑盒，用于測(cè)定哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中腎小管細(xì)胞損傷狀況，所述試劑盒包括對(duì)選自即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、和其混合物的生物標(biāo)記具有特異性的第一抗體，以測(cè)定其在受試對(duì)象血清樣品中的存在狀況。
本發(fā)明還涉及鑒定由事件導(dǎo)致的腎小管細(xì)胞損傷的程度的方法，包括1)從哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中獲取至少一份血清樣品；2)測(cè)定血清樣品中腎小管細(xì)胞損傷的早發(fā)生物標(biāo)記的存在狀況；和3)相對(duì)于事件發(fā)生時(shí)間，根據(jù)血清樣品中選自即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、和其混合物的生物標(biāo)記的開始出現(xiàn)的時(shí)間，測(cè)定腎小管細(xì)胞損傷程度。
本發(fā)明涉及檢測(cè)哺乳動(dòng)物受試對(duì)象腎小管細(xì)胞損傷的方法，包括步驟1)在疑似腎小管細(xì)胞損傷后從哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中獲取至多1毫升血清樣品；2)從血清樣品測(cè)定選自即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記和其混合物的生物標(biāo)記水平，和3)評(píng)價(jià)該受試對(duì)象腎小管細(xì)胞損傷情況。
本發(fā)明還涉及檢測(cè)哺乳動(dòng)物腎小管細(xì)胞損傷的方法，包括步驟1)從可能含有選自即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記、或其混合物的生物標(biāo)記的哺乳動(dòng)物中獲取1毫升血清樣品，以形成抗體和生物標(biāo)記的復(fù)合物；和3)測(cè)定抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物。
優(yōu)選的早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記為NGAL。優(yōu)選的即時(shí)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記為NGAL。


圖1顯示在CPB后所示的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從受試對(duì)象中獲取的樣品中尿NGAL的Western分析(左側(cè)帶)，該受試對(duì)象隨后發(fā)展為ARF，以及(右側(cè)帶)重組人NGAL標(biāo)準(zhǔn)。分子量以kDa列于左側(cè)。
圖2顯示最后發(fā)展成ARF(上方線，ARF)的患者與不發(fā)展成ARF(下方線，非ARF)的患者在CPB之后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的尿NGAL(ng/ml)。柱形(bar)表示檢測(cè)到的血清肌酸酐的首次上升的時(shí)間。
圖3顯示用尿肌酐排泄校正的圖2中的尿NGAL值圖4顯示經(jīng)ELISA測(cè)定，隨后發(fā)展成ARF(上方線，ARF)的患者與不發(fā)展成ARF(下方線，非ARF)的患者在CPB之后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的尿NGAL(ng/ml)。柱形表示檢測(cè)到的血清肌酸酐的首次上升的時(shí)間。
圖5顯示用尿肌酐排泄校正的圖4中的尿NGAL值圖6顯示CPB后兩小時(shí)所有尿NGAL測(cè)定的散點(diǎn)圖。50ng/ml處的陰影線表示將最終發(fā)展為ARF的患者的值與不發(fā)展成ARF的患者的值的間隔。
圖7顯示經(jīng)ELISA測(cè)定，隨后發(fā)展成ARF(上方線，ARF)的患者與不發(fā)展成ARF(下方線，非ARF)的患者在CPB之后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清NGAL(ng/ml)。柱形表示檢測(cè)到的血清肌酸酐的首次上升的時(shí)間。
圖8顯示最后發(fā)展成ARF和不發(fā)展成ARF的患者在CPB后兩小時(shí)所有血清NGAL測(cè)量結(jié)果的散點(diǎn)圖。
圖9顯示受試者操作特征(ROC)曲線，用CPB后兩小時(shí)的尿NGAL的ROC曲線確定用于早期診斷急性腎臟損傷的NGAL測(cè)定的區(qū)分能力，。
圖10顯示受試者操作特征(ROC)曲線，用CPB后兩小時(shí)的血清NGAL的ROC曲線確定用于急性腎臟損傷早期診斷的NGAL測(cè)定的區(qū)分能力。
發(fā)明詳述本文中“腎小管細(xì)胞損傷”的表述指腎或腎臟衰竭或機(jī)能障礙，無(wú)論是突然發(fā)生(急性的)或緩慢地在一段時(shí)間內(nèi)衰退(慢性的)，都可由許多疾病或病癥過程引發(fā)，所述疾病或病癥過程包括(但不限于)腎小管細(xì)胞損傷；缺血性腎臟損傷(IRI)，所述缺血性腎臟損傷包括急性缺血性損傷和慢性缺血性損傷；急性腎衰竭；急性腎毒性腎臟損傷(NRI)毒性，所述急性腎毒性腎臟損傷毒性(包括敗血病(感染)、休克、外傷、腎結(jié)石、腎感染、藥物毒性、毒藥或毒素、或注射碘化對(duì)比染料后(不良反應(yīng))；以及對(duì)于慢性腎毒性腎臟損傷長(zhǎng)期高血壓、糖尿病、充血性心力衰竭、狼瘡或鐮狀細(xì)胞性貧血。兩種腎衰竭形式都可導(dǎo)致威脅生命的代謝紊亂。
本文中“即時(shí)”的表述涉及一種腎小管細(xì)胞生物標(biāo)記，其是一種生物標(biāo)記蛋白，可在腎小管細(xì)胞損傷發(fā)生2小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)在血清中。
本文中的“早發(fā)”的表述涉及一種腎小管細(xì)胞生物標(biāo)記，其是一種生物標(biāo)記蛋白，可在腎小管細(xì)胞損傷發(fā)生后的最初24小時(shí)內(nèi)，更典型地在最初6小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)在血清中。
本發(fā)明提供一種方法和試劑盒用于分析處于早發(fā)腎小管細(xì)胞損傷的受試對(duì)象的血清中腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記的存在狀況。損傷發(fā)生的早期檢測(cè)可減少治療損傷的時(shí)間，并能降低發(fā)展成臨床上急性腎衰竭(ARF)的風(fēng)險(xiǎn)。
一個(gè)簡(jiǎn)單的應(yīng)急檢驗(yàn)(point-of-care)試劑盒采用與廣泛使用的血糖測(cè)試試劑盒相同的原理，用于在床邊快速檢測(cè)血清NGAL使臨床醫(yī)師快速診斷ARF，并迅速開始證明且有效治療和預(yù)防措施。試劑盒的使用可代表所有有可能發(fā)展為ARF患者的治療標(biāo)準(zhǔn)，包括用于心臟手術(shù)、腎移植、中風(fēng)、外傷、敗血癥、脫水和腎毒素(抗生素、抗炎劑、放射性對(duì)比劑和化學(xué)治療劑)。在目前的臨床實(shí)踐中，當(dāng)ARF在上述病癥發(fā)作時(shí)發(fā)生，診斷會(huì)被延誤，發(fā)病率和死亡率將高得不可接受。諷刺地，甚至是悲劇性地，有效的預(yù)防和治療措施很大程度上是有效的，但因?yàn)槿鄙貯RF的早期生物標(biāo)記，幾乎從來(lái)沒有被及時(shí)使用。預(yù)期，多種NGAL測(cè)量方法不僅對(duì)于診斷和量化初始腎臟損傷，而且對(duì)接下來(lái)的早期治療的應(yīng)答以及對(duì)長(zhǎng)期結(jié)果的預(yù)測(cè)，都是不可缺少的。
腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記(也稱為RTCI生物標(biāo)記)可以是即時(shí)RTCI生物標(biāo)記，例如NGAL，其在腎小管細(xì)胞損傷發(fā)生的2小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)在血清中。如果是NGAL，即時(shí)RTCI生物標(biāo)記可在腎小管細(xì)胞損傷發(fā)生后幾乎立刻在受試對(duì)象的血清中出現(xiàn)。RTCI生物標(biāo)記也可能為早發(fā)RTCI生物標(biāo)記，其在腎小管細(xì)胞損傷發(fā)生的最初24小時(shí)，更典型地在最初6小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)。同樣，NGAL也是早發(fā)RTCI生物標(biāo)記的一個(gè)例子。
有效的RTCI生物標(biāo)記典型地為分泌的蛋白，其可被腎臟分泌至尿液或被轉(zhuǎn)運(yùn)至血清中。有效的RTCI生物標(biāo)記也可典型地為抗蛋白酶的蛋白，例如NGAL。然而，RTCI生物標(biāo)記也可為蛋白酶敏感蛋白，只要該蛋白的穩(wěn)定片段可在尿或血清中被檢測(cè)出，例如通過下文中描述的NGAL的抗體。
RTCI生物標(biāo)記可以是缺血性腎臟損傷生物標(biāo)記(IRI生物標(biāo)記)、腎毒性腎臟損傷生物標(biāo)記(NRI生物標(biāo)記)，或其混合物。NGAL是IRI生物標(biāo)記和NRI生物標(biāo)記的例子。
本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的發(fā)病，并且監(jiān)控其對(duì)于各種事件的治療，所屬事件包括所有種類的腎臟供血減少、受損的心臟功能、手術(shù)過程、在重癥病房中的患者、和給予受試對(duì)象藥物、放射對(duì)比染料、或其他藥物物質(zhì)。腎小管細(xì)胞損傷可以是缺血性腎臟損傷、腎毒性腎臟損傷，或影響腎小管細(xì)胞的其他損傷。事件可包括給藥或攝取大量而廣泛種類的腎毒素，包括但不限于癌癥化療(順鉑、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、異膦酰胺(isosfamide)、甲氨蝶呤(isosfamide))、抗生素(慶大霉素(gentamicin)、萬(wàn)古霉素(vancomycin)、妥布霉素(tobramycin))、抗真菌劑(兩性霉素(amphotericin))、抗炎劑(NSAIDs)、免疫抑制劑(環(huán)孢霉素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus))和放射對(duì)比劑。該方法可用于評(píng)價(jià)新發(fā)現(xiàn)的和已知化合物的腎毒性。
本發(fā)明還提供基于損傷程度與受試對(duì)象血清中NGAL的量呈比例關(guān)系，評(píng)估腎臟損傷的程度的方法和試劑盒，該損傷程度可為從腎小管細(xì)胞損傷的發(fā)病至臨床上ARF。本發(fā)明為臨床醫(yī)師提供了在最初的評(píng)估中評(píng)價(jià)腎臟損傷的等級(jí)的裝置，并且通過檢測(cè)血清中NGAL的量監(jiān)控?fù)p傷狀況的變化(惡化、好轉(zhuǎn)或無(wú)變化)。
典型地，臨床醫(yī)師應(yīng)當(dāng)建立在經(jīng)選擇的時(shí)間間隔收集并分析從患者取樣得到的一定量新鮮血液樣品的方案。典型地，血液樣品在處方規(guī)定的時(shí)期內(nèi)間歇取樣。間歇取樣的時(shí)期可由受試對(duì)象的病癥決定，可從每24小時(shí)取一次樣至連續(xù)取樣，更典型地每4小時(shí)至每30分鐘。然后，典型地將血清樣品通過已知方法從血液樣品中分離。
使用本文描述的方法和技術(shù)，可分析并評(píng)估血清中出現(xiàn)的RTCI生物標(biāo)記的定性水平，也可分析并測(cè)量出血清中RTCI生物標(biāo)記的定量水平。臨床醫(yī)師可根據(jù)患者的狀態(tài)選自定性法、定量法或兩者。典型地，采集血清的量為小于1毫升，更典型地小于10μl。典型的樣品可為約1μl至約1ml。典型地，大量血清樣品(約1ml)用于定量分析。典型地，這些小量血清可輕易從易于發(fā)展ARF，或已經(jīng)發(fā)展為ARF的臨床受試對(duì)象中獲得。
一旦檢測(cè)到腎小管細(xì)胞損傷或急性腎衰竭的指標(biāo)，就開始對(duì)疾病或病癥的介入和治療，臨床醫(yī)師可采用本發(fā)明的方法或試劑盒來(lái)監(jiān)控治療或介入的過程。如果計(jì)劃進(jìn)行的治療或手術(shù)可能導(dǎo)致腎小管細(xì)胞損傷，臨床醫(yī)師可獲得治療前的血清樣品來(lái)測(cè)定個(gè)體的基線值。典型地，當(dāng)腎臟損傷發(fā)生且繼續(xù)，可收集一種或多種隨后的治療后血清樣品并分析RTCI生物標(biāo)記的存在狀況。如果獲得基線值，治療后的值可與基線值對(duì)比，以確定患者的相對(duì)狀態(tài)。治療一直持續(xù)直到在隨后的治療后血清樣品中不再檢測(cè)到RTCI生物標(biāo)記為止。當(dāng)治療或介入使病癥好轉(zhuǎn)，RTCI生物標(biāo)記的表達(dá)，及其在血清中的存在將相應(yīng)減少。好轉(zhuǎn)的程度表現(xiàn)為樣品中檢測(cè)到的相應(yīng)減少的RTCI生物標(biāo)記，例如NGAL的水平。當(dāng)腎臟損傷接近痊愈，該方法可用于檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記的完全不存在，標(biāo)志治療過程的完成。對(duì)缺血性和腎毒性損傷事件的動(dòng)物模型的研究表明，在事件發(fā)生的幾分鐘內(nèi)在腎小管細(xì)胞產(chǎn)生NGAL。如本發(fā)明實(shí)施例所示，腎小管細(xì)胞表達(dá)的NGAL迅速在血液中蓄積，能比目前指示腎臟細(xì)胞損傷的診斷測(cè)試更早地被檢測(cè)出。由于NGAL可在腎臟損傷或腎毒性處置的2小時(shí)內(nèi)在血清中輕易檢測(cè)出，本發(fā)明適合用于作為早發(fā)診斷。來(lái)自受試對(duì)象的血清樣品的NGAL測(cè)試可在疑似損傷的30分鐘內(nèi)開始，因?yàn)镹GAL開始時(shí)以低水平在血清中出現(xiàn)，之后持續(xù)升高。因此，在疑似損傷的2小時(shí)內(nèi)的任何時(shí)間開始測(cè)試也是很有價(jià)值的，因?yàn)镹GAL已明顯地出現(xiàn)在血清中。此外，在疑似損傷的最初24小時(shí)內(nèi)的其他任何時(shí)間測(cè)試也是有價(jià)值的，因?yàn)樵诳蓹z測(cè)的其他參數(shù)，例如肌酸酐，改變之前，NGAL是非?？煽坎⑶胰菀诇y(cè)量的損傷標(biāo)記。最優(yōu)選的NGAL測(cè)試過程是在整個(gè)治療過程中間隔地獲取樣品，監(jiān)控腎臟健康狀況的即時(shí)變化。
能結(jié)合RTCI生物標(biāo)記的單克隆和多克隆抗體對(duì)本發(fā)明的方法和試劑盒是有用的?？贵w可用本領(lǐng)域已知的方法制備。優(yōu)選的RTCI生物標(biāo)記，NGAL的單克隆抗體，在例如“Characterization of two ELISAs for NGAL，a newlydescribed lipocalin in human neutrophils”，Lars Kjeldsen等，(1996)Journal ofImmunological Methods，Vol.198，155-16中有所描述，在此處引為參考。NGAL的單克隆抗體的例子為HYB-211-01、HYB-211-02和NYB-211-05，可從Antibody Shop，Copenhagen，Denmark購(gòu)得。典型地，HYB-211-01和HYB-211-02可用于NGAL的還原和未還原形式。NGAL的多克隆抗體的例子在“An Iron Delivery Pathway Mediated by a Lipocalin”，Jun Yang等，Molecular Cell，(2002)，Vol.10，1045-1056中有所描述，在此處引入作為參考。將兔子用重組體凝膠過濾的NGAL蛋白免疫，來(lái)制備該多克隆抗體。將血清與GST-Sepharose 4B珠培養(yǎng)以除去污染物，得到含有多克隆抗體的血清，如申請(qǐng)人在Jun Yang等，Molecular Cell(2002)中的描述。
典型地，檢測(cè)俘獲抗體和RTCI生物標(biāo)記復(fù)合物的步驟包括使該復(fù)合物與用于檢測(cè)生物標(biāo)記的第二種抗體接觸。
檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記和第一抗體的復(fù)合物的方法包括下列步驟，從俘獲抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物中分離出血清樣品中任何未結(jié)合的物質(zhì)；將俘獲抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物與用于檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記的第二種抗體接觸，使RTCI生物標(biāo)記與第二種抗體形成復(fù)合物；從RTCI生物標(biāo)記-第二種抗體復(fù)合物中分離出任何未結(jié)合的第二種抗體；并且測(cè)定RTCI生物標(biāo)記-第二種抗體復(fù)合物中的第二種抗體。
本方法所用的試劑盒典型地包含附著俘獲抗體的介質(zhì)，由此血清樣品與該介質(zhì)接觸使俘獲抗體暴露在樣品中含有的NGAL中。試劑盒包含一個(gè)獲得裝置，所述裝置可包含器具，例如匙狀物(spatula)或簡(jiǎn)單的棍棒，其表面含有介質(zhì)。獲得裝置還可包含用于接收血清樣品的容器，該容器與血清接觸的表面包含介質(zhì)。在另一個(gè)典型的實(shí)施方式中，檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記和抗體的復(fù)合物的測(cè)定方法可包含ELISA，并可用于定量血清樣品中NGAL的量。在一個(gè)可選的實(shí)施方式中，獲得裝置可包括含有介質(zhì)的盒(cassette)的器具。
RTCI生物標(biāo)記的早期檢測(cè)可在短時(shí)間內(nèi)提供血清樣品中蛋白質(zhì)的存在標(biāo)示。通常，本發(fā)明的方法和試劑盒可在腎小管細(xì)胞損傷后的4小時(shí)內(nèi)，更典型地2小時(shí)內(nèi)，最典型地1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)血清樣品中的RTCI生物標(biāo)記。優(yōu)選地，RTCI生物標(biāo)記可在腎小管細(xì)胞損傷約30分鐘內(nèi)檢測(cè)。
本發(fā)明用于測(cè)定RTCI生物標(biāo)記的方法和試劑盒，可通過修改本領(lǐng)域已知的在生物學(xué)樣品中快速檢測(cè)其他蛋白和配體的方法或試劑盒而制備。可改造為本發(fā)明的方法和試劑盒的例子描述在美國(guó)專利5,656,503，May等人，August 12，1997、美國(guó)專利6,500,627，O’Conner等人，December 31，2002、美國(guó)專利4,870,007，Smith-Lewis，September 26，1989、美國(guó)專利5,273,743，Ahlem等人，December 28，1993和美國(guó)專利4,632,901，Valkers等人，December 30，1986，引入上述所有文獻(xiàn)作為參考。
檢測(cè)RTCI生物標(biāo)記的快速的一步法可減少檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷的時(shí)間。典型的方法可包含下列步驟獲取疑似含有RTCI生物標(biāo)記的血清樣品；將一部分樣品與特異性結(jié)合RTCI生物標(biāo)記的檢測(cè)抗體混合，使檢測(cè)抗體與樣品中的RTCI生物標(biāo)記開始結(jié)合；將樣品和檢測(cè)抗體的混合物與固定的俘獲抗體接觸，該俘獲抗體特異性地結(jié)合RTCI生物標(biāo)記，并且不和檢測(cè)抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，使檢測(cè)抗體結(jié)合RTCI生物標(biāo)記，并且RTCI生物標(biāo)記結(jié)合俘獲抗體，以形成可檢測(cè)的復(fù)合物；從復(fù)合物中除去未結(jié)合的檢測(cè)抗體和任何未結(jié)合的樣品，測(cè)定復(fù)合物的檢測(cè)抗體。可檢測(cè)抗體可用可檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，例如本領(lǐng)域熟知的放射活性標(biāo)記、酶、生物染料、磁珠、或生物素?？蓹z測(cè)抗體可連接在支持材料上，例如薄膜、塑料帶、塑料的實(shí)驗(yàn)室平板例如用于ELISA或其他高流通量分析所用的那些，或任何其他支持材料，例如那些本領(lǐng)域熟知的用于其他診斷試劑盒的材料。
為了鑒定可能伴隨或標(biāo)志腎小管細(xì)胞損傷，例如缺血性和腎毒性腎臟損傷的最早期發(fā)作的潛在基因及其蛋白，可使用cDNA微點(diǎn)陣分析檢測(cè)大量潛在基因靶點(diǎn)中哪一個(gè)為顯著上調(diào)。使用該篩選方法，嗜中性白細(xì)胞明膠酶相關(guān)的脂籠蛋白(lipocalin)(NGAL)被確認(rèn)為，在小鼠模型中缺血性腎損傷發(fā)生后的最初幾小時(shí)內(nèi)，其基因表達(dá)上調(diào)超過10倍。
NGAL屬于超過20個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的分泌的蛋白的脂籠蛋白超家族，所述分泌的蛋白被認(rèn)為在β-折疊桶形萼狀結(jié)構(gòu)(β-barreled calyx)中轉(zhuǎn)運(yùn)各種配基。人NGAL最初被鑒定為一種與來(lái)自人嗜中性白細(xì)胞的明膠酶共價(jià)結(jié)合的25kDa蛋白，其中它代表嗜中性白細(xì)胞第二顆粒蛋白質(zhì)(secondary granule protiens)中的一種。分子克隆研究揭示，人NGAL與小鼠24p3基因相似，所述小鼠24p3基因在被誘導(dǎo)增殖的小鼠腎的原代培養(yǎng)物中首次得到鑒定。NGAL在其它人組織中，包括腎、氣管、肺、胃和結(jié)腸中以非常低的水平表達(dá)。NGAL表達(dá)在受刺激的上皮中被顯著地誘導(dǎo)。例如，它在結(jié)腸上皮細(xì)胞的炎癥或瘤形成區(qū)域中上調(diào)，但是在未進(jìn)行干預(yù)的區(qū)域(intervening uninvolved areas)或在轉(zhuǎn)移性病灶中不存在。NGAL濃度在患有急性細(xì)菌感染的患者的血清中，在患有哮喘或慢性阻塞性肺病的受試對(duì)象的痰中、及來(lái)自肺氣腫肺的支氣管流體(bronchial fluid)中上升。在所有這些病例中，假定NGAL誘導(dǎo)是炎癥細(xì)胞和上皮層之間的相互作用的結(jié)果，而在嗜中性白細(xì)胞和上皮中NGAL表達(dá)的上調(diào)都是顯而易見的。
據(jù)信，檢測(cè)到的NGAL誘導(dǎo)代表腎近端小管細(xì)胞對(duì)于腎小管細(xì)胞損傷內(nèi)在的應(yīng)答，所述損傷包括缺血性和腎毒性損傷的新的，而且并不僅僅源自激活的嗜中性白細(xì)胞。首先，所述的應(yīng)答是快速的，NGAL出現(xiàn)在腎動(dòng)脈阻塞之后損傷的2小時(shí)之內(nèi)的血清中，而在此缺血性ARF的模型中腎嗜中性白細(xì)胞的蓄積通常在損傷后的4小時(shí)首次顯著。第二，NGAL誘導(dǎo)和嗜中性白細(xì)胞蓄積的時(shí)間圖型是離散(divergent)的。NGAL mRNA和蛋白表達(dá)在回流的12小時(shí)是最顯著的，然而嗜中性白細(xì)胞蓄積在24小時(shí)達(dá)到峰值，而此時(shí)NGAL表達(dá)已經(jīng)顯著地降低。第三，在待測(cè)的腎樣品中通過免疫熒光沒有檢測(cè)到表達(dá)NGAL的嗜中性白細(xì)胞。第四，證明體外缺血后，NGAL mRNA和蛋白誘導(dǎo)在培養(yǎng)的人近端小管細(xì)胞中出現(xiàn)，在完全不存在嗜中性白細(xì)胞的體系中，NGAL在ATP消耗的1小時(shí)以內(nèi)分泌到培養(yǎng)基中。然而，浸潤(rùn)嗜中性白細(xì)胞對(duì)于觀察到的NGAL上調(diào)起作用。腎小管細(xì)胞中NGAL的上調(diào)，可以通過局部釋放細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)，所述細(xì)胞因子來(lái)自缺血性損傷后早期在微循環(huán)內(nèi)捕獲的嗜中性白細(xì)胞。
NGAL的舊稱為HNL?，F(xiàn)有技術(shù)專利6,136,526教導(dǎo)了一種檢測(cè)HNL用于分辨細(xì)菌感染和病毒感染的方法。以通過吸引嗜中性白細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞至感染的部位的免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)的經(jīng)典的方式，感染導(dǎo)致炎癥，。當(dāng)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)被感染區(qū)域，組胺和一系列致炎細(xì)胞因子釋放入細(xì)胞內(nèi)間隙，誘導(dǎo)對(duì)生物體的吞噬和殺滅。有活性的嗜中性白細(xì)胞還分泌出NGAL以應(yīng)答細(xì)菌感染但不是病毒感染。該區(qū)別應(yīng)答很可能是因?yàn)樵诩?xì)菌表面部分的脂多糖(LPS)部分，而NGAL易于結(jié)合LPS。然后NGAL將分散到受感染部位附近的毛細(xì)血管，并且當(dāng)達(dá)到充分的水平，可在血清或血漿中檢測(cè)到。嗜中性白細(xì)胞何時(shí)開始分泌NGAL以應(yīng)答細(xì)菌感染，或需要多長(zhǎng)時(shí)間從嗜中性白細(xì)胞釋放的NGAL在血清中達(dá)到能被檢測(cè)的水平還不清楚。
這與本發(fā)明在幾個(gè)方面上相反。首先，缺血性或腎毒性損傷的早期幾乎不涉及或根本不涉及嗜中性白細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞。第二，缺血性或腎毒性損傷誘導(dǎo)受感染組織的細(xì)胞中NGAL的早期和快速表達(dá)，所述受感染組織例如排列各種腎單位節(jié)段(nephron segments)的那些。第三，腎臟受損細(xì)胞將NGAL即時(shí)釋放到尿液中，其在損傷后的幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)在尿液中。第四，缺血性或腎毒性損傷后6-12小時(shí)發(fā)生的典型炎癥與感染導(dǎo)致的炎癥明顯不同。缺血性或腎毒性損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡誘發(fā)主要包括巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)(infiltrates)，所述巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子以促進(jìn)受損組織中細(xì)胞碎片的吞噬作用。第五，盡管在缺血性腎臟損傷的動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)一些嗜中性白細(xì)胞的蓄積作用，其僅在損傷后約4小時(shí)發(fā)生，在損傷后約24小時(shí)達(dá)到峰值。相反，尿液NGAL的峰值在損傷后的2-4小時(shí)出現(xiàn)，并在24小時(shí)內(nèi)顯著減少(1-3)。因此，尿的NGAL排泄和嗜中性白細(xì)胞蓄積作用的不同的時(shí)程，證明缺血性損傷后的尿和血清NGAL不是來(lái)源于炎癥。第六，盡管在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)有嗜中性白細(xì)胞的蓄積作用，但從來(lái)未在人類急性腎衰竭中發(fā)現(xiàn)或被證實(shí)。第七，我們已證明在嗜中性白細(xì)胞完全不存在的體系中，缺血性損傷之后的體外培養(yǎng)的腎小管細(xì)胞中的NGAL的蓄積作用。參見Rabb H和Star R.Acute Renal Failure，Molitoris BA和Finn WF(編者)，WB Saunders，Philadelphia，2001，pp89-100；Chiao等人J Clin Invest 1997；991165-1172；和Rabb H等人Am J Physiol 1996；271 F408-F413。
還缺乏對(duì)于通過刺激上皮細(xì)胞誘導(dǎo)NGAL的適當(dāng)?shù)慕忉專胰匀徊磺宄﨨GAL對(duì)于損傷是否是保護(hù)性的或緊密聯(lián)系的(proximate)，或者甚至是一種無(wú)作用的相關(guān)者。近期的證據(jù)顯示，至少在細(xì)胞類型的一種亞類中，NGAL可代表前-細(xì)胞凋亡分子。在小鼠前-B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞系中，撤除細(xì)胞因子導(dǎo)致顯著的NGAL誘導(dǎo)以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。純化的NGAL產(chǎn)生與缺失細(xì)胞因子同樣的前-細(xì)胞凋亡應(yīng)答，包括Bax的激活，這顯示出，NGAL與程序性細(xì)胞死亡相關(guān)。NGAL也與生殖組織中的細(xì)胞凋亡相關(guān)。內(nèi)卷的(involuting)乳腺和子宮的上皮細(xì)胞表達(dá)高水平的NGAL，時(shí)間上與最大細(xì)胞凋亡期一致。很可能NGAL通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡調(diào)控細(xì)胞群的亞類。受刺激的上皮細(xì)胞可以上調(diào)NGAL以誘導(dǎo)浸潤(rùn)的嗜中性白細(xì)胞的凋亡，由此使定居細(xì)胞(resident cell)幸免于炎癥反應(yīng)的破壞?；蛘?，上皮細(xì)胞可應(yīng)用此機(jī)理調(diào)控它們自身的死亡。然而，有趣的是注意到，腎缺血-再灌注損傷之后的NGAL誘導(dǎo)主要發(fā)生在近端小管細(xì)胞中，而同樣情況下的細(xì)胞凋亡則主要為遠(yuǎn)端小管細(xì)胞現(xiàn)象。
其它的近期研究已經(jīng)揭示，NGAL增強(qiáng)了上皮的表型。NGAL通過穿透大鼠輸尿管芽表達(dá)，并且通過刺激間質(zhì)細(xì)胞向腎上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來(lái)引發(fā)腎發(fā)生。已經(jīng)顯示另一種脂籠蛋白，生殖糖蛋白，當(dāng)其在人乳癌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的表型。這些發(fā)現(xiàn)尤其適合于成熟的腎，其中對(duì)于缺血性損傷已充分證明的應(yīng)答之一是明顯出現(xiàn)沿近端小管排列的去分化的(dedifferentiated)上皮細(xì)胞。缺血性損傷后，腎再生和修復(fù)的一個(gè)重要方面包括重新獲得上皮細(xì)胞表型，此過程概括了正常發(fā)育的幾個(gè)方面。這說明，NGAL可以由損傷的小管表達(dá)以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞再生化。對(duì)此觀點(diǎn)的支持源自近期將NGAL鑒定為一種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在腎發(fā)生的過程中與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)互補(bǔ)。已知向細(xì)胞遞送鐵對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育是極其重要的，而且這可能對(duì)于缺血后的腎再生，正如它在個(gè)體發(fā)育過程中那樣，是非常關(guān)鍵的。由于NGAL看來(lái)結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)鐵，NGAL也很可能作為從損傷的近端小管上皮細(xì)胞流出的鐵庫(kù)(sink)。因?yàn)橐延^察到NGAL可被近端小管胞吞，該蛋白可能將鐵循環(huán)進(jìn)入活細(xì)胞。這可刺激生長(zhǎng)和發(fā)育，以及從組織損傷的部位去除反應(yīng)分子-鐵，由此限制鐵-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
NGAL是順鉑誘導(dǎo)的腎毒性腎損傷的新型的血清生物標(biāo)記，它比以前描述的生物標(biāo)記更加敏感。一個(gè)實(shí)例是腎損傷分子-1或KIM-1，一個(gè)推定的涉及腎再生的粘附分子。在順鉑腎毒性的大鼠模型中，KIM-1在初始損傷后的24-48小時(shí)是可以定量檢測(cè)的，使其成為腎小管細(xì)胞損傷的一種有些晚期的標(biāo)記物。據(jù)信在順鉑以已知導(dǎo)致腎衰竭的劑量給藥后3小時(shí)內(nèi)，方便而定量地檢測(cè)到NGAL。此外，尿和血清NGAL檢測(cè)先于尿中其它標(biāo)記物如NAG的出現(xiàn)。NGAL在尿和血清中的出現(xiàn)也先于血清肌酸酐的增加，所述血清肌酸酐的增加已廣泛地用于診斷腎毒性腎衰竭。
據(jù)信，甚至在輕微的“臨床癥狀不明顯的”順鉑劑量之后，尿NGAL是明顯的，盡管血清肌酸酐仍為正常水平。因此，本發(fā)明對(duì)于經(jīng)受順鉑治療的患者的臨床管理具有重要的含義。順鉑的有效性是劑量依賴性的，但腎毒性的發(fā)生經(jīng)常阻礙應(yīng)用更高劑量以使其抗腫瘤的潛力最大化。順鉑治療后的腎毒性是常見的，并且可在單次劑量后出現(xiàn)急性腎衰竭。雖然已經(jīng)證明幾種治療方案在動(dòng)物體內(nèi)順鉑誘導(dǎo)的腎毒性的治療中是有效的，但是成功的人體實(shí)驗(yàn)很大程度上仍然是軼事奇聞。其中一個(gè)原因可能是缺乏腎毒性急性腎衰竭的早期標(biāo)記物，而因此延遲治療的開始。在目前的臨床實(shí)踐中，急性腎損傷通常是通過測(cè)定血清肌酸酐進(jìn)行診斷的。然而，眾所周知，肌酸酐在腎功能急性變化的過程中，是一種不可靠而且延遲的指標(biāo)。首先，血清肌酸酐濃度不會(huì)變化，直到大約50％的腎功能已經(jīng)喪失。第二，血清肌酸酐不能準(zhǔn)確地描述腎功能，直到可能需要幾天的時(shí)間以達(dá)到一種穩(wěn)態(tài)。因此，血清肌酸酐測(cè)定的應(yīng)用削弱檢測(cè)和定量在腎損傷的早期過程中腎損傷的能力。然而，動(dòng)物研究表明，雖然腎毒性急性腎衰竭可以預(yù)防和/或治療，但是只有狹窄的“機(jī)會(huì)窗口”實(shí)現(xiàn)它，而且治療必須在初始損傷后非常早就開始。腎損傷的早期生物標(biāo)記物的缺乏削弱了臨床醫(yī)生以及時(shí)的方式開始可能的有效治療的能力。在實(shí)驗(yàn)體系中，應(yīng)用NGAL對(duì)于檢測(cè)已經(jīng)存在或形成的治療干預(yù)或預(yù)防干預(yù)，以及對(duì)于其它藥物的潛在腎毒性的早期評(píng)價(jià)也有價(jià)值。NGAL檢測(cè)對(duì)于順鉑誘導(dǎo)的腎損傷是新型的、非侵入性的、早期血清生物標(biāo)記物。早期檢測(cè)能夠使臨床醫(yī)生給予及時(shí)的治療干預(yù)，并建立防止發(fā)展成明顯的腎毒性腎衰竭的方案。
NGAL的上調(diào)和血清轉(zhuǎn)運(yùn)可說明腎小管細(xì)胞對(duì)于各種損傷的快速應(yīng)答，而NGAL在血清中的檢測(cè)可提供一種廣泛應(yīng)用的非侵性的臨床工具，用于小管細(xì)胞損傷的早期診斷。
NGAL是一種敏感的、非侵入性的、腎小管細(xì)胞損傷的血清生物標(biāo)記物，所述的損傷包括腎缺血和腎毒性。檢測(cè)在患有急性、輕微和早期形式的腎小管細(xì)胞損傷的患者的血清中NGAL的表達(dá)，應(yīng)用本發(fā)明的快速而簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法和試劑盒，能夠提醒并使臨床醫(yī)生在患有急性腎衰竭的患者中及時(shí)地開始干預(yù)努力，并提醒臨床醫(yī)生實(shí)施一些方法，旨在防止患有輕微的臨床癥狀不明顯的腎小管細(xì)胞損傷(如腎毒素、腎移植、血管外科和心血管的事件)的患者發(fā)展成明顯的ARF。
單在美國(guó)，每年就進(jìn)行大約16,000例腎移植。這個(gè)數(shù)字還在逐年穩(wěn)定上升。其中大約10,000例是尸體的腎移植，并有ARF的風(fēng)險(xiǎn)。這些患者中的每個(gè)人會(huì)極大地受益于系列的NGAL檢測(cè)，其可代表日常護(hù)理(routinecare)。
缺血性腎損傷也與開放性心臟手術(shù)有關(guān)，原因在于此過程中固有的血流的短暫中斷?？梢怨烙?jì)每年進(jìn)行的開放性心臟手術(shù)的數(shù)目。在任何中度繁忙的成人醫(yī)院中，每年大約進(jìn)行500例這樣的手術(shù)。假定單在美國(guó)有至少400所這樣的中度繁忙的醫(yī)院，可保守地估計(jì)出每年進(jìn)行200,000例開放性心臟手術(shù)。這些患者的系列NGAL測(cè)定將是價(jià)值無(wú)法衡量的，并可代表護(hù)理的標(biāo)準(zhǔn)。
發(fā)明實(shí)施例在本發(fā)明下面的實(shí)施例中，對(duì)71個(gè)進(jìn)行CPB兒童作研究。通過Western印跡和ELISA分析系列的尿樣和血樣中NGAL的表達(dá)。原始結(jié)果變量為急性腎損傷，將其定義為血清肌酸酐相對(duì)基線水平增長(zhǎng)了50％。20個(gè)患者(28％)出現(xiàn)了急性腎損傷，但是使用血清肌酸酐只可能在CPB后的1至3天診斷。與此相比，尿NGAL在CPB后的兩小時(shí)從基線的1.6±0.3ng/ml上升至147±23ng/ml。血清的NGAL在CPB后的兩小時(shí)從基線的3.2±0.5ng/ml上升至61±10ng/ml。單變量分析顯示急性腎損傷和下列顯著相關(guān)2小時(shí)尿NGAL，2小時(shí)血清NGAL和CPB時(shí)間。通過多變量分析，認(rèn)為CPB后2小時(shí)的尿NGAL值是急性腎損傷最有效的獨(dú)立預(yù)測(cè)變量(independent predictor)。2小時(shí)尿NGAL的ROC曲線顯示，對(duì)于50ng/ml的截?cái)嘀?cutoff value)，0.998的曲線下面積，和1.00的敏感性以及0.98的特異性。對(duì)于心臟手術(shù)后急性腎損傷，尿NGAL和血清NGAL是新穎的，敏感的，特異的，高預(yù)測(cè)性的早期生物標(biāo)記。
研究方案研究經(jīng)過Institutional Review B oard of the CincinnatiChildren’s Hospital Medical Center的批準(zhǔn)。書面知情同意書(informed consent)在每個(gè)患者登記之前從其法定監(jiān)護(hù)人處得到。對(duì)在2004年1月至11月之間，所有接受心肺旁路(CPB)手術(shù)治療先天性心臟病的患者進(jìn)行預(yù)登記。排除的條件包括預(yù)成的腎機(jī)能不全，糖尿病(diabetes mellitus)，外周血管病，和在研究期之前或期間使用了腎毒性的藥物。因此，我們研究同類的患者群，他們極其相似地不具有主要的混雜變量(confounding variable)，僅有的明顯腎損傷就是CPB后局部缺血-再灌注損傷的結(jié)果。為了使術(shù)后血容不足降到最低，所有患者在術(shù)后最初24小時(shí)內(nèi)接受至少80％的維持流體需要量，隨后是100％的維持量。在CPB后的五天內(nèi)在基線并以規(guī)率的間隔采集少量的(spot)尿樣和血樣。尿樣在最初的12小時(shí)內(nèi)每?jī)尚r(shí)取一次，隨后為每12小時(shí)取一次。血樣在進(jìn)行CPB后2小時(shí)采集，在第一天中每12小時(shí)取一次，然后五天每天一次取。當(dāng)CPB時(shí)間超過2小時(shí)，第一個(gè)術(shù)后尿樣和血樣在CPB結(jié)束時(shí)取得，并且此樣品被看作是2小時(shí)采集品。同樣從健康的成人志愿者處取得尿樣和血樣，以確立正常的NGAL值。樣品在2000g下離心5分鐘，并將上層清液于-80℃分量(aliquot)貯藏。血清肌酸酐在基線處測(cè)量，并對(duì)那些病危兒童(critically ill)在剛剛手術(shù)后的時(shí)期常規(guī)監(jiān)測(cè)至少一天兩次，并在術(shù)后三天后至少每天一次。
統(tǒng)計(jì)方法所有結(jié)果表示為平均值±SE。使用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。使用雙樣品t-檢驗(yàn)或Mann-Whitney Rank Sum Test比較連續(xù)變量，并使用所述的卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)或費(fèi)歇爾精確檢驗(yàn)(Fisher’s exact test)比較分類(categorical)變量。用CPB后2小時(shí)和4小時(shí)的尿NGAL和CPB后2小時(shí)的血清NGAL，生成常規(guī)的接收操作特性(receiver operating characteristic，ROC)曲線。這些被用于測(cè)量尿NGAL和血清NGAL不同截?cái)嗨降拿舾行院吞禺愋?。?jì)算曲線下的區(qū)域以確定NGAL為生物標(biāo)記的性質(zhì)。0.5的面積近似表示偶然期望的生物標(biāo)記，而1.0的值意味著完美的生物標(biāo)記。進(jìn)行單變量和多變量的逐步回歸分析，以評(píng)估急性腎損傷的預(yù)測(cè)變量。潛在的獨(dú)立預(yù)測(cè)變量包括年齡，性別，種族，CPB時(shí)間，在先心臟手術(shù)，排尿量，CPB后2小時(shí)的尿NGAL，和CPB后2小時(shí)的血清NGAL。認(rèn)為小于0.05的p值是有意義的。
患者特征100個(gè)患者的監(jiān)護(hù)人提供了他們的孩子參與到此次研究的知情書面同意。排除了29個(gè)患者，全都是因?yàn)樵谑中g(shù)前或手術(shù)后不久使用了腎毒素(布洛芬，ACE抑制劑，慶大霉素，萬(wàn)古霉素)。因此，本研究包括71個(gè)患者，他們的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征、診斷和結(jié)果變量如下面的表1所示。所有受試對(duì)象開始都具有正常的腎功能，且在尿和血清中具有基本無(wú)法檢測(cè)水平的NGAL，與健康對(duì)照者類似。此研究方案需要考慮測(cè)定CPB后在尿液和血清中出現(xiàn)NGAL的準(zhǔn)確時(shí)間。結(jié)果顯示，NGAL不僅是有效的用于急性腎損傷的即時(shí)早期生物標(biāo)記，比血清肌酸酐的任何增長(zhǎng)要提前1至3天，而且是在整個(gè)研究過程中的有效區(qū)別標(biāo)記。
表1表1.患者特征和臨床結(jié)果.*p＜0.05，和對(duì)照相比.


*p＜0.05，與對(duì)照相比.
這個(gè)研究主要長(zhǎng)處是預(yù)先募集同類的兒童，這些兒童在先天性心臟病的外科修復(fù)手術(shù)期間出現(xiàn)了腎缺血再灌注損傷。這些實(shí)施例中的患者都沒有相同的共病變量(co-morbid variables)，例如動(dòng)脈粥樣硬化病，糖尿病，以及使用腎毒素，所有這些變量都會(huì)混淆并破壞用早期生物標(biāo)記來(lái)鑒定缺血急性腎損傷。
臨床結(jié)果原始結(jié)果，急性腎損傷，定義為血清肌酸酐從基線有50％或更多的增長(zhǎng)，在3天內(nèi)在71個(gè)患者中的20人中出現(xiàn)，發(fā)病率是28％。除了這些患者，8個(gè)患者在CPB后的24至48小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)了血清肌酸酐的增長(zhǎng)，但是另外12個(gè)患者，增長(zhǎng)進(jìn)一步推遲到CPB后的48至72小時(shí)。因此，使用現(xiàn)有的臨床操作只能在刺激事件發(fā)生后數(shù)天，診斷出急性腎損傷。
根據(jù)原始結(jié)果，把試驗(yàn)受試對(duì)象分為“對(duì)照”或“急性腎損傷”兩組。兩組在性別，種族，或排尿量上沒有不同。采集的其它變量包括年齡，CPB時(shí)間，在先心臟手術(shù)，排尿量，和尿肌酸酐。如上面的表1所示，發(fā)生急性腎損傷的兒童趨向于具有更小的年齡以及更長(zhǎng)的CPB時(shí)間。急性腎損傷更多的發(fā)生在具有左心發(fā)育不良，法樂四聯(lián)癥，和AV canal病癥的潛在診斷的患者身上，而較少發(fā)生或不發(fā)生在患有心房中隔缺損，心室中隔缺損，或瓣膜性心臟病的患者身上。原始結(jié)果變量為急性腎損傷的發(fā)生，定義為血清肌酸酐相對(duì)基線有50％或更多的增長(zhǎng)。
實(shí)施例1用作NGAL表達(dá)和定量的Western分析法各尿樣的等份(30μl)在變性緩沖劑中煮沸10分鐘，并且用抗人NGAL的親合純化山羊多克隆抗體(F-19，Santa Cruz Biotechnology)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Western印跡分析。如以前Mishra等人在Am J Nephrol 2004；24307-315中所述，用已知量的重組人NGAL作為定量尿NGAL的標(biāo)準(zhǔn)，在相同轉(zhuǎn)移和接觸的條件下進(jìn)行同時(shí)印跡。實(shí)驗(yàn)室研究人員直到研究結(jié)束都無(wú)法得知樣品來(lái)源和臨床結(jié)果。
尿NGAL測(cè)量-Western分析法事實(shí)上，在手術(shù)前的所有患者以及健康的志愿者(n＝10)的尿中NGAL都是無(wú)法檢測(cè)的。圖1顯示了進(jìn)行CPB的患者的此類情況的典型Western印跡。NGAL在CPB 0小時(shí)或之前檢測(cè)不到，但是在2小時(shí)或更短的時(shí)間迅速出現(xiàn)，并且保持Western印跡可檢測(cè)至少12小時(shí)。
用作NGAL定量的ELISA針對(duì)NGAL的敏感和可重現(xiàn)的ELISA是提供樣品的準(zhǔn)確定量并證實(shí)Western分析法所得數(shù)據(jù)的方法的實(shí)例。當(dāng)然，ELISA結(jié)果與Western分析法獲得的結(jié)果接近平行，只有少于20％的差別。用于急性腎損傷生物標(biāo)記的快速檢測(cè)的基于免疫印跡技術(shù)的臨床應(yīng)用，受到時(shí)間因素和試驗(yàn)條件變更的限制。我們修改了在前出版的用于檢測(cè)嗜中性白細(xì)胞來(lái)源的NGAL的操作規(guī)程，所述操作規(guī)程如Kjeldsen等人在J ImmunolMethods 1996；198155-164中所述。簡(jiǎn)而言之，用抗人NGAL的小鼠單克隆抗體(#HYB211-05，Antibody Shop)在4℃包被微滴板過夜。隨后的所有的步驟都在室溫下進(jìn)行。所述板用含1％BSA的緩沖液封閉，用100μl的樣品(尿或血清)或標(biāo)準(zhǔn)品(NGAL濃度在1-1000ng/ml的范圍)包被，并與生物素化的抗人NGAL的單克隆抗體(#HYB211-01B，Antibody Shop)溫育，然后與親和素偶聯(lián)的HR(Dako)溫育。添加TMB底物(BD Biosciences)來(lái)顯色，在30分鐘后用微滴板讀出器(Benchmark Plus，BioRad)在450納米讀取數(shù)據(jù)。所有測(cè)定一式三份，，并以盲形式(blinded fashion)進(jìn)行。
實(shí)施例2在那些從沒有發(fā)生過急性腎損傷的患者中，CPB后兩小時(shí)或CPB后第一個(gè)可用樣品的尿NGAL具有小量但有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的增加(4.9±1.5ng/ml比基線的0.9±0.3ng/ml，p＜0.05)以及CPB后4小時(shí)的尿NGAL具有小量但有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的增加(4.9±1.2ng/ml，與基線相比，p＜0.05)。與此形成顯著對(duì)比，如圖2所示，隨后發(fā)展為急性腎損傷的患者的尿NGAL，在所有的測(cè)試時(shí)間點(diǎn)上都顯示出顯著的增加。尿NGAL分泌圖的特征在于其在促發(fā)事件(precipitating event)后(CPB后2-6小時(shí))很早出現(xiàn)的峰，緊接著在研究的全過程中是較小但是持續(xù)的增加。當(dāng)尿NGAL濃度因?yàn)槟蚣∷狒置诙鴺?biāo)準(zhǔn)化時(shí)，整體的圖形保持不變(圖3)。
實(shí)施例3在健康志愿者體內(nèi)尿NGAL水平始終低(2.2±0.5ng/ml，n＝10)，并且在所有受試者中位于基線(1.6±0.3ng/ml，n＝71)。在那些從沒有發(fā)生過急性腎損傷的患者中，CPB后兩小時(shí)的尿NGAL具有小量但有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的增加(5.9±1.4ng/ml，與基線相比，p＜0.05)，以及CPB后4小時(shí)的尿NGAL具有小量但有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的增加(5.6±1.2ng/ml，與基線相比，p＜0.05)。如圖4所示，隨后發(fā)生急性腎損傷的患者的尿NGAL，在所有的測(cè)試時(shí)間點(diǎn)上都顯示出明顯的增加。尿NGAL分泌在CPB后很快達(dá)到峰值，緊接著在整個(gè)研究過程中保持較小但持續(xù)的增加。急性腎損傷組中的尿NGAL水平在CPB后2小時(shí)或第一個(gè)可得樣品中為147±23ng/ml，在CPB后4小時(shí)為179±30ng/ml，在CPB后6小時(shí)為150±30ng/ml。當(dāng)尿NGAL濃度用尿肌酸酐分泌標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，整體的圖形保持一致，也就是尿NGAL比肌酸酐在CPB后2小時(shí)為138±28ng/mg，在CPB后4小時(shí)為155±40ng/mg，在CPB后6小時(shí)為123±35ng/mg(圖5)。首次可用的手術(shù)后尿NGAL測(cè)定的散點(diǎn)圖顯示，所有20個(gè)隨后發(fā)生急性腎損傷的患者顯示了超出50ng/ml的任意截?cái)嘀?arbitrarycutoff value)的水平，然而，對(duì)照組的51個(gè)患者中只有1個(gè)患者顯示了超過該任意截?cái)嘀档哪騈GAL值(圖6)。
實(shí)施例4血清NGAL測(cè)定-ELISA血清NGAL是缺血腎損傷的新型早期生物標(biāo)記，類似于心肌缺血中的肌鈣蛋白，而血清NGAL的檢測(cè)是本發(fā)明的實(shí)例。正常健康志愿者(2.5±0.8，n＝6)和手術(shù)前所有研究受試對(duì)象(3.2±0.5ng/ml，n＝71)的血清NGAL水平始終低。在那些從沒有發(fā)生過急性腎損傷的患者中，CPB后兩小時(shí)或CPB后第一個(gè)可用樣品中的血清的NGAL有小量但有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的增加(7.0±1.1ng/ml，與基線相比，p＜0.05)，以及CPB后12小時(shí)的血清的NGAL有小量但有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的增加(5.2±0.8ng/ml，與基線相比，p＜0.05)。如圖7所示，隨后發(fā)生急性腎損傷的患者顯示，血清NGAL在所有的測(cè)試時(shí)間點(diǎn)上都顯示出驚人的增加。類似于尿NGAL，血清的NGAL在CPB后很快達(dá)到峰值，緊接著在整個(gè)研究過程中保持較小但持續(xù)的增加。急性腎損傷組中的血清NGAL水平在CPB后2小時(shí)為61±10ng/ml，在CPB后12小時(shí)為54.7±7.9ng/ml，在CPB后24小時(shí)為47.4±7.9ng/ml。所有的最早血清NGAL測(cè)定值(CPB后2小時(shí))的散點(diǎn)圖顯示，對(duì)照組的所有51個(gè)患者都沒有超出50ng/ml的任意截?cái)嘀档乃?，然而，發(fā)生急性腎損傷的大多數(shù)患者顯示了超過該截?cái)嘀档难錘GAL值(圖8)。本發(fā)明所述的ELISA是針對(duì)NGAL的應(yīng)急檢驗(yàn)診斷試劑盒的一個(gè)實(shí)例。
實(shí)施例5用于急性腎損傷預(yù)測(cè)的NGAL數(shù)據(jù)的單變量分析法揭示，下面的結(jié)果并不是急性腎損傷的前兆年齡，性別，種族，在先手術(shù)，和排尿量。急性腎損傷(血清肌酸酐有50％或更多)與下述值具有顯著的相關(guān)CPB后2小時(shí)或第一個(gè)可用樣品的尿NGAL(R＝0.79，p＜0.001)，CPB后2小時(shí)或第一個(gè)可用樣品的血清NGAL(R＝0.64，p＜0.001)， 以及CPB持續(xù)期間(R＝0.49，p＜0.001)。但是，通過多元(multiple)逐步回歸分析法，顯示出在這些數(shù)值(cohort)中只有在CPB后2小時(shí)的尿NGAL是對(duì)于急性腎損傷最有力的獨(dú)立預(yù)測(cè)變量(R＝0.76，p＜0.001)。
制作R0C曲線以確定測(cè)定尿NGAL和血清NGAL對(duì)于急性腎損傷早期診斷的區(qū)別作用。對(duì)于尿NGAL，曲線下的面積在CPB后2小時(shí)為0.998(圖9)，在CPB后4小時(shí)為1.000(未示出)。對(duì)于血清NGAL，曲線下的面積在CPB后2小時(shí)為0.906(圖10)。這些值表明，尿NGAL和血清NGAL對(duì)于急性腎損傷的早期診斷是優(yōu)良的檢驗(yàn)。在不同截?cái)嗨降玫降拿舾行裕禺愋?，和預(yù)測(cè)值列于表2。對(duì)于尿NGAL，25或50ng/ml的截?cái)嘀翟贑PB后2小時(shí)和4小時(shí)可以產(chǎn)生突出的敏感性和特異性。對(duì)于CPB后2小時(shí)的血清NGAL，敏感性和特異性在25ng/ml的截?cái)嘀档臅r(shí)候是最佳的。
表2.不同截?cái)嘀档腘GAL檢驗(yàn)特征

通常，NGAL在幾種人組織中以很低的水平表達(dá)，所述組織包括腎，氣管，肺，胃，和結(jié)腸(Cowland等人，Genomics 1997；4517-23.)。在受損的上皮細(xì)胞中明顯誘導(dǎo)NGAL的表達(dá)。例如，NGAL的濃度在患有急性細(xì)菌感染的患者血清中，在患哮喘或慢性阻塞肺病的受試對(duì)象的痰液中，以及在氣腫性肺的支氣管流體中升高(Xu等人，Biochim Biophys Acta2000；1482298-307)。文中所述的本發(fā)明來(lái)自于對(duì)動(dòng)物模型的觀察，其中NGAL是缺血損傷后腎臟中最早和最有力的誘導(dǎo)基因和蛋白質(zhì)之一，而且NGAL可以在缺血后不久輕易地從尿中檢測(cè)出來(lái)。見Supavekin等人，KidneyInt 2003；631714-1724；Mishra等人，J Am Soc Nephrol 2003；42534-2543；和Devaraian等人，Mol Genet Metab 2003；80365-376。在缺血后的腎臟中，NGAL在一些腎單位節(jié)段(segment)中顯著上調(diào)，而且該蛋白質(zhì)主要蓄積在它與增殖上皮細(xì)胞共定位(co-localizes)的近端小管內(nèi)。這些發(fā)現(xiàn)提示損傷的小管可以表達(dá)NGAL，以誘導(dǎo)表皮細(xì)胞再生。最近鑒定NGAL為培養(yǎng)腎小管細(xì)胞中的上皮形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)物和為腎發(fā)生過程中的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Gwira等人，J Biol Chem 2005，和Yang等人，Mol Cell 2002；101045-1056)可支持該假設(shè)。眾所周知的，鐵傳遞到細(xì)胞中對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育是很重要的，而這大概對(duì)于缺血損傷后的腎再生同樣重要。的確，最近的發(fā)現(xiàn)表明，通過使小管細(xì)胞命運(yùn)的平衡向存活傾斜，外源施用NGAL改善小鼠的缺血急性腎損傷(Mishra等人，J Am Soc Nephrol 2004；153073-3082)。因此，NGAL在ARF領(lǐng)域起中樞階段(center-stage)的作用，不僅作為新型的生物標(biāo)記，還作為一種新穎的治療方法。
雖然尿診斷具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括樣品采集的非侵入性和相對(duì)少的干擾蛋白，但其同樣存在一些缺點(diǎn)。這包括很難從嚴(yán)重的少尿患者取得尿樣品，所有流體狀態(tài)和利尿劑療法誘導(dǎo)的尿生物標(biāo)記濃度的潛在變化，以及一些尿生物標(biāo)記過去表現(xiàn)出的敏感性或特異性不足的事實(shí)(Rabb H.Am J Kidney Dis2003；42599-600)?；谘宓脑\斷已經(jīng)徹底改變了重癥監(jiān)護(hù)藥物。最近的實(shí)例包括用于急性心肌梗塞的早期診斷和及時(shí)介入的肌鈣蛋白的測(cè)定，和急性冠狀綜合癥患者體內(nèi)B-型尿鈉排泄肽的預(yù)后值的測(cè)定(Hamm等人，N Eng JMed 1997；3371648-1653；和De Lemos等人，N Engl J Med2001；3451014-1021)。據(jù)我們所知，NGAL是唯一的在血清和尿中都能測(cè)定用于缺血腎損傷的早期診斷的生物標(biāo)記。
本發(fā)明的方法和用途優(yōu)于或超過了幾種針對(duì)缺血腎損傷的其它生物標(biāo)記的有用性，所述其它的生物標(biāo)記例如那些在Hewitt等人，J Am Soc Nephrol2004；151677-1689；Herget-Rosenthal等人，Kidney Int 2004；661115-1122；和Rabb，Am J Kidney Dis 2003；42599-600中所討論的生物標(biāo)記。已經(jīng)回顧了迄今為止的大多數(shù)研究報(bào)告，已經(jīng)在ARF確定階段檢驗(yàn)了生物標(biāo)記，并且已被限制到只是尿以及僅僅一種檢測(cè)方法。已經(jīng)在尿中測(cè)定了幾種小管蛋白，具有矛盾和不令人滿意的結(jié)果(Westhuyzen等人，Nephrol Dial Transplant2003；18543-551；Herget-Rosenthal等人，Clin Chem 2004；50552-558；Han等人，Kidney Int 2002；62237-244)。腎損傷分子-1(KIM-1)，一種新穎的腎特異性粘附分子，可以在診斷有急性小管壞死的患者的尿中通過ELISA進(jìn)行檢測(cè)。同樣的，Western印跡所示的鈉氫交換體同工型(isoform)3(NHE3)在確定ARF的受試對(duì)象的尿的膜級(jí)分中增加(du Cheyron等人，Am J Kidney Dis2003；42497-506)。但是，沒有報(bào)道用于腎損傷檢測(cè)的這些生物標(biāo)記的敏感性和特異性。在那些做過尸體腎臟移植(35，36)具有遲發(fā)性移植功能的患者體中，已經(jīng)證實(shí)，在ARF相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子中，尿IL-6，IL-8和IL-18的水平提高。除了NGAL以外，沒有在缺血ARF的進(jìn)展過程中從尿中預(yù)測(cè)檢驗(yàn)出來(lái)的生物標(biāo)記。最近的預(yù)測(cè)研究表明，在那些已選擇處于發(fā)生ARF的高風(fēng)險(xiǎn)的患者群中，血清抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C的增加早于血清肌酸酐的增加(Herget-Rosenthal等人，Kidney Int 2004；661115-1122)。但是，由于局部缺血，腎前(prerenal)，腎毒和膿毒性病因的組合，這些受試對(duì)象發(fā)生ARF是多因素性的。此外，由于抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C主要是腎小球過濾速率(GFR)的標(biāo)記，因此可以推斷出血清抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C水平的上升只能在GFR開始下降之后。另一方面，NGAL在腎小管細(xì)胞中應(yīng)缺血損傷而被快速誘導(dǎo)，并且它在尿和血清中的較早出現(xiàn)并不依賴于GFR，而是可能在幾天之后發(fā)生的GFR減少的預(yù)測(cè)指標(biāo)。沒有發(fā)生ARF的患者的尿NGAL和血清NGAL有小的瞬時(shí)增加，這與之前的觀察一致，心肺旁路手術(shù)導(dǎo)致NGAL釋放到循環(huán)中，這可能繼發(fā)于通過體外循環(huán)引發(fā)白細(xì)胞的炎性激活(Herget-Rosenthal等人，Kidney Int 2004；661115-1122)。
盡管已結(jié)合優(yōu)選的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀了前述的說明書之后，能夠?qū)υ谶@里列出的主題作各種改變，等同替代和更改。因此，本發(fā)明可以通過在此具體描述的方式之外的方式實(shí)施。因此，此處的保護(hù)僅受附加的權(quán)利要求和其等同內(nèi)容所限。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)哺乳動(dòng)物腎小管細(xì)胞損傷的方法，所述損傷包括缺血性腎臟損傷和腎毒性損傷，所述方法包含下列步驟1)從哺乳動(dòng)物受試對(duì)象獲得血清樣品；2)將血清樣品與針對(duì)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記的抗體接觸，以形成抗體和生物標(biāo)記的復(fù)合物，該生物標(biāo)記包含NGAL，和3)檢測(cè)抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中間歇地，優(yōu)選連續(xù)地從受試對(duì)象中獲取多份血清樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中檢測(cè)抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物的步驟包括將所述復(fù)合物與用于測(cè)定生物標(biāo)記的第二抗體接觸。
4.一種監(jiān)控腎小管細(xì)胞損傷治療有效性的方法，包括下列步驟1)向患有腎小管細(xì)胞損傷的哺乳動(dòng)物受試對(duì)象提供治療；2)從受試對(duì)象獲得至少一份治療后的血清樣品；和3)在治療后的血清樣品中檢測(cè)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記的存在狀況，所述生物標(biāo)記包含NGAL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，還包括獲得一份或多份隨后的治療后血清樣品步驟，其中提供治療的步驟一直持續(xù)到隨后的治療后的血清樣品中檢測(cè)不到生物標(biāo)記為止，并且優(yōu)選其中檢測(cè)步驟包括下列步驟i)將血清樣品與針對(duì)生物標(biāo)記的俘獲抗體接觸，以形成抗體和生物標(biāo)記的復(fù)合物；和ii)檢測(cè)所述抗體-生物標(biāo)記的復(fù)合物，優(yōu)選包括下列步驟(1)將血清樣品中任何未結(jié)合的物質(zhì)與俘獲抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物分離；(2)將俘獲抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物與用于檢測(cè)生物標(biāo)記的第二抗體接觸，使得在生物標(biāo)記和第二抗體間形成復(fù)合物；(3)將任何未結(jié)合的第二抗體與生物標(biāo)記-第二抗體復(fù)合物分離；和(4)檢測(cè)生物標(biāo)記-第二抗體復(fù)合物中的第二抗體。
6.試劑盒，優(yōu)選應(yīng)急檢驗(yàn)試劑盒，用于檢測(cè)受試對(duì)象血清中腎小管細(xì)胞損傷的即時(shí)或早發(fā)生物標(biāo)記的存在狀況，所述損傷包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷，包含1)獲得一定量血清樣品的裝置，所述量?jī)?yōu)選小于1ml，更優(yōu)選小于10微升；2)附著有俘獲抗體的介質(zhì)，所述俘獲抗體能夠與腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)記復(fù)合，所述生物標(biāo)記包括NGAL；和3)測(cè)定裝置，優(yōu)選ELISA，用于測(cè)定生物標(biāo)記和俘獲抗體的復(fù)合物，其中優(yōu)選所述獲得裝置選自i)含有表面的器具，所述表面含有所述介質(zhì)；ii)用于接收血清樣品的容器，其中與血清接觸的容器表面包含所述介質(zhì)；iii)包含盒的器具，所述盒含有所述介質(zhì)；和iv)包含標(biāo)尺的器具，所述標(biāo)尺表面包含所述介質(zhì)，其中測(cè)定裝置優(yōu)選包含比色標(biāo)尺的測(cè)定裝置。
7.用于測(cè)定哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中腎小管細(xì)胞損傷狀況的競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)試劑盒，所述損傷包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷，所述試劑盒包含對(duì)NGAL特異的第一抗體，用于測(cè)定其在受試對(duì)象血清樣品中的存在狀況，所述血清樣品優(yōu)選的流體量約為1毫升或更小。
8.一種鑒定腎小管細(xì)胞損傷程度的方法，所述損傷包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷，其由事件引起，所述方法包括下列步驟1)從哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中獲得至少一份血清樣品；2)在血清樣品中測(cè)定腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記的存在狀況，所述生物標(biāo)記包含NGAL；和3)相對(duì)于事件發(fā)生時(shí)間，根據(jù)血清樣品中生物標(biāo)記開始出現(xiàn)的時(shí)間，測(cè)定腎小管細(xì)胞損傷的程度，其中所述事件優(yōu)選選自手術(shù)過程、腎臟供血減少、受損的心臟功能、多個(gè)手術(shù)過程、在重癥監(jiān)護(hù)病房中的患者、和給予受試對(duì)象藥物、放射性對(duì)比染料、或其他藥物物質(zhì)。
9.一種測(cè)定哺乳動(dòng)物中腎小管細(xì)胞損傷的方法，所述損傷包括缺血性腎損傷和腎毒性損傷，所述方法包括下列步驟1)從哺乳動(dòng)物受試對(duì)象中得到包含至多1毫升血清的血清樣品；2)將血清樣品與針對(duì)腎小管細(xì)胞損傷生物標(biāo)記的抗體接觸，形成抗體和生物標(biāo)記的復(fù)合物，所述生物標(biāo)記包括NGAL；和3)測(cè)定抗體-生物標(biāo)記復(fù)合物。
全文摘要
一種用于測(cè)定早發(fā)腎臟疾病和損傷的方法和試劑盒，所述損傷包括腎小管損傷，其中使用NGAL作為早期血清生物標(biāo)記。NGAL是小型的分泌多肽，其抗蛋白酶并因此容易在腎小管細(xì)胞損傷后在血清中檢測(cè)。分泌性蛋白的具點(diǎn)細(xì)胞質(zhì)分布表明，在近端小管細(xì)胞，NGAL蛋白表達(dá)大部分被檢測(cè)到。NGAL在血清中出現(xiàn)與腎缺血和腎毒性的劑量和持續(xù)時(shí)間有關(guān)，并且可診斷腎小管細(xì)胞損傷和腎衰竭。NGAL測(cè)定也是監(jiān)測(cè)藥物或其他治療劑的腎毒性副作用的有用的指標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101027556SQ200580026786
公開日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2005年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月7日
發(fā)明者普拉薩德·德瓦雷詹, 喬納森·M·巴拉什 申請(qǐng)人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心, 哥倫比亞大學(xué)受托人