專利名稱：血氨含量測定方法及血氨診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測定血氨含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及血氨診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氨測定的方法有微量擴(kuò)散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應(yīng)用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。
擴(kuò)散法是標(biāo)本堿化后，釋放出NH3，用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應(yīng)形成棕黃色碘化雙汞胺進(jìn)行比色。這些方法需要堿化，內(nèi)源性的氨形成造成影響，使其準(zhǔn)確性和精密度受到影響，目前已很少應(yīng)用；離子交換法比擴(kuò)散法更準(zhǔn)確，CV為8％--13％；離子選擇電極法是利用NH3擴(kuò)散到電極表面，引起電極的PH發(fā)生變化進(jìn)行測定，該方法的CV為3.5％--4.8％，回收率高。結(jié)合我國的具體實(shí)際，應(yīng)以酶法測定為實(shí)用。
檢索中國專利，僅查出87105593.7號專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種可以克服以上現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的血氨含量的測定方法，同時(shí)給出用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的血氨診斷試劑盒。采用該試劑盒中的試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行血氨含量測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明測定血氨含量的步驟如下
1)、將樣品與主要由腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下原理的反應(yīng)氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出血氨的含量。
通常步驟2)將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出血氨的含量。
以上樣品與試劑的混合比例為按體積1/10到1/250，以上過程的測定溫度控制在常規(guī)的20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在常規(guī)的2-30分鐘。
本發(fā)明應(yīng)用谷氨酰胺合成酶偶聯(lián)偶聯(lián)丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶反應(yīng)比色法。谷氨酰胺合成酶利用氨、谷氨酸、腺苷三磷酸合成谷氨酰胺，反應(yīng)的副產(chǎn)物磷酸根再和丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成二氧化碳，然后和磷酸烯醇式丙酮酸及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用最后產(chǎn)生草酰乙酸，再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，氧化NAD(P)H成為NAD(P)+，從而得以測定NAD(P)H在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨含量的多少。雖然磷酸單鹽在系統(tǒng)中被重復(fù)使用，但是最終的反應(yīng)速率還是取決于最初的氨含量的大小所產(chǎn)生的初始磷酸單鹽濃度決定。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的血氨診斷試劑盒可以是單劑，包括緩沖液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--60000U/l丙酮酸氧化酶1000--60000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000--60000U/l蘋果酸脫氫酶2000--80000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)也可以將以上單劑配成如下雙劑試劑I緩沖液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l
丙酮酸氧化酶1000--60000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000--60000U/l蘋果酸脫氫酶2000--80000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑II緩沖液 40--200mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--60000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)雙劑的配方不僅限于上述配方，其中的試劑I的成分，腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等可以放在試劑II，試劑II其中的成分，谷氨酰胺合成酶也可以放在試劑I，如此可以形成多種配方，不一一詳述。
還可以將試劑配成如下三試劑試劑I緩沖液 40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑II緩沖液 40--200mmol/l丙酮酸氧化酶1000--60000U/l
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000--60000U/l蘋果酸脫氫酶2000--80000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)試劑III緩沖液 40--200mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--60000U/l穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)三劑的配方不僅限于上述配方；其中的試劑I的成分，腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在試劑II或試劑III中。試劑II其中的成分，丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶等也可以放在試劑I或試劑III中。試劑III中的成分，谷氨酰胺合成酶也可以放在試劑I或試劑II中。如此可以形成多種配方，不一一詳述。
緩沖劑可以是三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖液、磷酸鹽(Phosphate)緩沖液、三乙醇胺(Triethanolamine)緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)緩沖液或雙甘氨肽(Glycylglycine)緩沖液等。
以上還原型輔酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等還原型煙酰胺輔酶或其衍生物。
此外，為了減少各試劑成分之間的交叉影響、保持試劑的穩(wěn)定性，以便長期儲(chǔ)存，以上單劑、雙劑的試劑I、試劑II或三劑的試劑I、試劑II、試劑III中通常加入穩(wěn)定劑10-80％或者10-50mmol/l，穩(wěn)定劑可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或鹽等中的一種或一種以上。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下配方成分關(guān)系的本發(fā)明血氨診斷試劑盒較為理想緩沖液 80--120mmol/l腺苷三磷酸 2--12mmol/l谷氨酸 6--10mmol/l丙酮酸 5--15mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸2--8mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶 6000--12000U/l丙酮酸氧化酶6000--12000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 4000--10000U/l蘋果酸脫氫酶8000--16000U/l穩(wěn)定劑 20--50％(總體積)由于本發(fā)明是完全利用酶學(xué)方法，酶解反應(yīng)具有特異性高的特點(diǎn)。酶法方法簡便、易于操作。酶解反應(yīng)的特異性促使測試結(jié)果精確。酶解反應(yīng)都是在緩沖液條件下進(jìn)行，沒有污染環(huán)境問題。酶法方法不需要特殊、額外的儀器，測試成本低廉。因此可以保證具有較高的測試準(zhǔn)確性，更便于推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一(單劑)本實(shí)施例的血氨診斷試劑盒包括緩沖液 80mmol/l腺苷三磷酸 2mmol/l谷氨酸 6mmol/l
丙酮酸 5mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸2mmol/l還原型輔酶 0.2mmol/l谷氨酰胺合成酶 6000U/l丙酮酸氧化酶6000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 4000U/l蘋果酸脫氫酶8000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出血氨的含量。
本實(shí)施例應(yīng)用谷氨酰胺合成酶偶聯(lián)偶聯(lián)丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶反應(yīng)比色法。谷氨酰胺合成酶利用氨、谷氨酸、腺苷三磷酸合成谷氨酰胺，反應(yīng)的副產(chǎn)物磷酸根再和丙酮酸在丙酮酸氧化酶作用下生成二氧化碳，然后和磷酸烯醇式丙酮酸及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶再作用最后產(chǎn)生草酰乙酸，再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用，氧化NAD(P)H成為NAD(P)+，從而得以測定NAD(P)H在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨含量的多少。雖然磷酸單鹽在系統(tǒng)中被重復(fù)使用，但是最終的反應(yīng)速率還是取決于最初的氨含量的大小所產(chǎn)生的初始磷酸單鹽濃度決定。
實(shí)施例二(雙劑)本實(shí)施例的血氨診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l腺苷三磷酸 7mmol/l谷氨酸 8mmol/l丙酮酸 10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸5mmol/l還原型輔酶 0.25mmol/l丙酮酸氧化酶9000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 7000U/l蘋果酸脫氫酶12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑II緩沖液 100mmol/l谷氨酰胺合成酶 9000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)測定血氨含量時(shí)，溫度控制在30℃，反應(yīng)時(shí)間15分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
具體測定步驟為氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出血氨的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在15分鐘。
實(shí)施例三(三劑)本實(shí)施例的血氨診斷試劑為三劑，有試劑I緩沖液 120mmol/l腺苷三磷酸 12mmol/l谷氨酸 10mmol/l丙酮酸 15mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸8mmol/l還原型輔酶 0.3mmol/l穩(wěn)定劑 20mmol/l試劑II
緩沖液 120mmol/l丙酮酸氧化酶12000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 10000U/l蘋果酸脫氫酶16000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)試劑III緩沖液 120mmol/l谷氨酰胺合成酶 12000U/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度25℃，反應(yīng)時(shí)間20分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
具體測定步驟為氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出血氨的含量。
各反應(yīng)步驟的反應(yīng)時(shí)間控制在20分鐘。
實(shí)施例四本實(shí)施例的血氨診斷試劑有試劑I緩沖液 100mmol/l腺苷三磷酸 4mmol/l谷氨酸 5mmol/l丙酮酸 6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸4mmol/l還原型輔酶 0.3mmol/l穩(wěn)定劑 30mmol/l試劑II緩沖液 100mmol/l腺苷三磷酸 4mmol/l谷氨酸 5mmol/l丙酮酸 6mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸4mmol/l還原型輔酶 0.3mmol/l穩(wěn)定劑 50％(總體積)在生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm以上，被測血氨樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)。
加入樣品和試劑后，使之混合，發(fā)生以下反應(yīng)氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶將最終反應(yīng)物置于生化分析儀器下，檢測主波長340nm吸光度下降的幅度，從而測算出血氨的含量。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好。
權(quán)利要求
1.一種測定血氨含量的方法，步驟如下1)、將樣品與主要由腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成的試劑混合，使之發(fā)生如下反應(yīng)氨+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成盒酶谷氨酰胺+腺苷二磷酸+磷酸根磷酸根+丙酮酸+氧+水丙酮酸氧化酶乙酰磷酸+二氧化碳+過氧化氫二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶草酰乙酸+磷酸根草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶蘋果酸+氧化型輔酶2)、檢測最終反應(yīng)物在主波長340nm吸光度下降的速度，測算出血氨的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定血氨含量的方法，其特征在于所述步驟2)為將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或者半、全自動(dòng)生化分析儀下，測試主波長340nm吸光度下降的幅度，測算出血氨的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測定血氨含量的方法，其特征在于溫度控制在20℃到50℃范圍，反應(yīng)時(shí)間控制在2-30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述測定血氨含量的方法，其特征在于被測血氨樣品與試劑的比例控制在1/10到1/100。
5.一種血氨診斷試劑盒，由以下成分組成緩沖液40--200mmol/l腺苷三磷酸 1--20mmol/l谷氨酸 1--20mmol/l丙酮酸 1--20mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--20mmol/l還原型輔酶 0.2--0.3mmol/l谷氨酰胺合成酶 1000--60000U/l丙酮酸氧化酶 1000--60000U/l磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 1000--60000U/l蘋果酸脫氫酶 2000--80000U/1穩(wěn)定劑 10--80％(總體積)
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述試劑配成單劑、雙劑或三劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定劑為乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸銨或鹽中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述緩沖劑為三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、三乙醇胺緩沖液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇緩沖液或雙甘氨肽緩沖液中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述血氨診斷試劑盒，其特征在于所述還原型輔酶為NADPH、NADH、thio-NADH還原型煙酰胺輔酶或其衍生物中的一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種測定血氨含量的方法，同時(shí)本發(fā)明還涉及血氨診斷試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括緩沖液、腺苷三磷酸、谷氨酸、丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸、還原型輔酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸氧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、穩(wěn)定劑，通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生酶偶聯(lián)反應(yīng)，再將最終反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長吸光度變化的情況(速度)，從而測算出血氨的含量。采用本發(fā)明完全可以通過生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)的污染，便于推廣應(yīng)用。
文檔編號G01N21/33GK1749754SQ20041004196
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月14日
發(fā)明者王爾中 申請人:王爾中