專利名稱：來(lái)自tt病毒序列的肽和結(jié)合tt病毒的單特異性抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自TT病毒基因組序列的肽和結(jié)合TT病毒的單特異性抗體。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的肽或抗體分別用于藥物。含有本發(fā)明的肽作為診斷抗原的診斷試劑盒和含有本發(fā)明的抗體作為診斷抗原的診斷試劑盒也包括在本發(fā)明之中。本發(fā)明的肽可用來(lái)免疫非人哺乳動(dòng)物，以產(chǎn)生針對(duì)TT病毒的單特異性抗體。背景1997年從患有輸血后非甲-庚型肝炎的日本患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種新的人傳染源，命名為TT病毒(TTV)[1]。在47％暴發(fā)型非甲-庚型肝炎患者和46％未知病因的慢性肝病患者中檢出了TTV DNA[2]，表明TTV可能為一些自發(fā)性肝病的病因。TTV在全球范圍內(nèi)存在[3]，似乎在感染血液傳播病毒的高危人群中更為普遍[2]，如血友病病人和吸毒者中。然而，腸胃?jìng)鞑ニ坪跻彩强赡艿腫2]。
TTV為無(wú)包膜單鏈DNA病毒，基因組至少為3.7kb[4]。它具有廣泛的序列變異，可分為不同基因型和亞型[4]。在文獻(xiàn)[4]中已討論了它與細(xì)小病毒科的關(guān)系。隨后分析表明了TTV的嗜肝性[2]，在一些非甲-庚型輸血后肝炎和TTV DNA病毒血癥患者中，TTV DNA滴度與氨基轉(zhuǎn)移酶水平相關(guān)[1]。
然而，不能進(jìn)一步證實(shí)TTV感染和嚴(yán)重肝病的聯(lián)系[3，5，6]。TTV感染的流行病學(xué)、免疫學(xué)和臨床重要性仍不明確。而且，至今仍沒(méi)有TTV感染的血清學(xué)檢測(cè)，目前PCR是唯一的診斷工具。
能夠診斷TTV對(duì)人的感染并開(kāi)發(fā)基于免疫肽和/或抗TTV抗體的藥物是人們所希望的。
這樣，本發(fā)明針對(duì)具有氨基酸序列SEQ ID NO1TATTTTYAYPGTNRPPV的多肽，其中N-末端氨基酸TATTTT中的一到所有六個(gè)可以去除。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽具有氨基酸序列SEQ ID NO2YAYPGTNRPPV。
本發(fā)明也針對(duì)包含肽SEQ ID NO1(TATTTTYAYPGTNRPPV，其中N-末端氨基酸TATTTT中的一到所有六個(gè)可以去除)和至少一個(gè)在表4中列出的具有氨基酸序列SEQ ID NO3-11的其它肽的肽混合物。
本發(fā)明的肽和/或肽混合物中至少一個(gè)肽可以偶聯(lián)到載體和/或標(biāo)記上。載體的實(shí)例為塑料表面，如微量滴定板和珠子等；有機(jī)分子如生物素；蛋白如牛血清白蛋白；肽接頭或多肽。可使用的標(biāo)記實(shí)例(主要用于診斷目的)為放射性同位素、酶和熒光標(biāo)記等。
此外，本發(fā)明的肽和/或肽混合物中至少一個(gè)肽可以被固定到固相上，如玻璃或塑料表面，主要用于診斷目的或純化抗體。
本發(fā)明也涉及將本發(fā)明的肽或肽混合物可選地與其它生物活性或非活性成分偶聯(lián)或組合，用作藥物，如預(yù)防TT病毒感染的疫苗。
此外，本發(fā)明針對(duì)結(jié)合TT病毒的單特異性抗體。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，單特異性抗體結(jié)合選自氨基酸序列SEQID NO1-11的氨基酸序列。
此外，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的單特異性抗體可選地與其它生物活性或非活性成分偶聯(lián)或組合，用作藥物，如給已經(jīng)感染了TTV的患者施用的藥物。
本發(fā)明還針對(duì)含有根據(jù)本發(fā)明的肽或肽混合物作為診斷抗原的診斷試劑盒。該試劑盒可用于免疫學(xué)分析如EIA、RIA等，來(lái)檢測(cè)生物學(xué)體液(如血液或血漿)中抗TTV抗體的存在。
本發(fā)明還針對(duì)含有根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)單特異性抗體作為診斷抗體的診斷試劑盒。該試劑盒可用于免疫學(xué)分析如EIA、RIA等，來(lái)檢測(cè)生物學(xué)體液(如血液或血漿)中抗TTV抗體的存在。
該診斷試劑盒通常包含進(jìn)行免疫學(xué)分析的其它成分。這些其它成分將取決于使用的實(shí)際分析方法，通常包括陽(yáng)性和陰性標(biāo)準(zhǔn)血清樣品和使用說(shuō)明書。
此外，本發(fā)明針對(duì)根據(jù)本發(fā)明的肽在免疫非人哺乳動(dòng)物以產(chǎn)生針對(duì)TT病毒的單特異性抗體中的用途。
通過(guò)參考以下實(shí)驗(yàn)描述和本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明將被進(jìn)一步闡明。這些實(shí)驗(yàn)描述和具體實(shí)施方案不認(rèn)為是對(duì)權(quán)利要求書中定義的本
PCR擴(kuò)增檢測(cè)血清中的TTV DNA從50μl患者血清中通過(guò)酚/氯仿純化分離總DNA。所有患者DNA使用兩套不同引物通過(guò)(半)巢式PCR進(jìn)行分析。5μl患者DNA加入45μl含有1U taq聚合酶(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Norwalk，CO)，10×PCR緩沖液，200μmol MgCl2，dNTPs(125μmol/核苷酸)和20pmol每種引物的反應(yīng)混合物中。第一輪引物為5TTVout5(5’-ACA GAC AGA GGA GAAGGC AAC ATG-3’)和或者3TTVout(5’-CTG GCA TTT TAC CAT TTC CAA AGT T-3’)或者3TTXout(5’-TAC CAY TTA GCT CTC ATT CTW AT-3’)作為下游引物。DNA擴(kuò)增如下95℃4.5分鐘；然后95℃30秒，50℃30秒，72℃1分鐘，共33循環(huán)；最后72℃4分鐘。使用5μl第一輪PCR產(chǎn)物在相同條件下進(jìn)行第二輪PCR。第二輪內(nèi)引物為5TTVin(5’GGC AAC ATG YTR TGG ATA GACTGG-3’)或5TTVXin(5’-ACA GGA GAC HMA AAC ATA SA-3’)作為上游引物和3TTVout。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(3％)確定大約分別為275bp和140bp的正確大小。兩套引物均為陽(yáng)性或一套引物可重復(fù)出現(xiàn)陽(yáng)性的樣品判定為TTV陽(yáng)性。引物序列根據(jù)Genebank錄入號(hào)AB008394。
肽合成通過(guò)多肽合成儀使用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)方法[7](Syro，Synter，德國(guó))制備對(duì)應(yīng)于TTV的ORF1和ORF2(表1；Genebank錄入號(hào)AB008394)的重疊肽(18個(gè)氨基酸長(zhǎng)，8個(gè)氨基酸重疊)。
檢測(cè)血清中的人抗體EIAs主要按照以前的操作流程[8]。用含有10μg/ml合成肽的0.05M碳酸鈉緩沖液(pH9.6)包被微量滴定板(Nunc，丹麥)48小時(shí)。用含有1％牛血清白蛋白、2％山羊血清和0.05％Tween 20(稀釋緩沖液)的磷酸緩沖鹽水室溫封閉2小時(shí)后，用稀釋緩沖液1∶100稀釋的人血清孵育微量滴定板。用結(jié)合堿性磷酸酶的抗人IgG抗體(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)來(lái)指示結(jié)合的人IgG，通過(guò)加入二硝基苯二胺(Sigma)顯色，測(cè)定405nm處的光密度。
免疫和誘生TTV特異性抗體用在完全弗氏佐劑中1∶1乳化的100μg肽35(SEQ ID NO1)通過(guò)腹膜內(nèi)免疫多組Balb/c。四周后用不完全弗氏佐劑中的100μg劑量進(jìn)行加強(qiáng)。每星期采集靜脈血樣品，共6星期，并檢測(cè)對(duì)TTV肽35(SEQ ID NO1)的反應(yīng)性。
結(jié)果表2和3給出了對(duì)覆蓋ORF1和ORF2的97個(gè)肽的人反應(yīng)性。發(fā)現(xiàn)ORF1中的反應(yīng)性肽是肽10(SEQ ID NO3)、18(SEQ ID NO4)、29(SEQ ID NO5)、35(SEQ ID NO1)、42(SEQ ID NO6)、44(SEQ ID NO7)、50(SEQ IDNO8)、51(SEQ ID NO9)和69(SEQ ID NO10)(表2)。兩份被檢測(cè)的人血清與來(lái)源于ORF2的肽19(SEQ ID NO11)有反應(yīng)。所有反應(yīng)性肽列于表4。最常檢測(cè)到的肽為具有序列TATTTTYAYPGTNRPPV(SEQ ID NO1)的肽35。對(duì)肽35的反應(yīng)性依賴于血清樣品的稀釋度(表5)。微量滴定板上人血清對(duì)該肽的反應(yīng)性可被溶液中相同肽的加入所抑制，但不被非相關(guān)肽所抑制(未顯示數(shù)據(jù))。這表明該反應(yīng)性對(duì)具有序列TATTTTYAYPGTNRPPV(SEQ ID NO1)的肽35是特異的。
通過(guò)使用缺失和替換肽類似物進(jìn)一步表征肽TATTTTYAYPGTNRPPV的反應(yīng)性。分析表明識(shí)別區(qū)域含有序列YAYPGTNRPPV(SEQ ID NO2)(表6)。使用丙氨酸替換類似物發(fā)現(xiàn)Pro-Val序列為人抗體結(jié)合最為必需的序列(表6)。
表1.用于合成80個(gè)重疊肽的TTV ORFs1和2的完整氨基酸序列(Genebank錄入號(hào)AB008394)。ORF1MAYGWWRRRRRRWRRWRRRPWRRRWRTRRRRPARRRGRRRNVRRRRRGGRWRRRYRRWKRKGRRRKKAKIIIRQWQPNYRRRCNIVGYIPVLICGENTVSRNYATHSDDTNYPGPFGGGMTTDKFTLRILYDEYKRFMNYWTASNEDLDLCRYLGVNLYFFRHPDVDFIIKINTMPPFLDTELTAPSIHPGMLALDKRARWIPSLKSRPGKKHYIKIRVGAPRMFTDKWYPQTDLCDMVLLTVYATAADMQYPFGSPLTDSVVVNFQVLQSMYDKTISLLPDEKSQREILLNKIASYIPFYNTTQTLAQLKPFIDAGNVTSGATATTWASYINTTKFTTATTTTYAYPGTNRPPVTMLTCNDSWYRGTVYNTQIQQLPIKAAKLYLEATKTLLGNTFTNEDYTLEYHGGLYSSIWLSPGRSYFETTGAYTDIKYNPFTDRGEGNMLWIDWLSKKNMNYDKVQSKCLISDLPLWAAAYGYVEFCAKSTGDQNIHMNARLLIRSPFTDPQLLVHTDPTKGFVPYSLNFGNGKMPGGSSNVPIRMRAKWYPTLFHQQEVLEALAQSGPFAYHSDIKKVSLGMKYRFKWTWGGNPVRQQVVRNPCKETHSSGNRVPRSLQIVDPKYNSPELTFHTWDFRRGLFGPKAIQRMQQQPTTTDIFSAGRKRPRRDTEVYHSSQEGEQKESLLFPPVKLLRRVPPWEDSQQEESGSQSSEEETQTVSQQLKQQLQQQRILGVKLRLLFNQVQKIQQNQDINPTLLPRGGDLASLFQIAPORF2MAEFSTPVRSGEATEGDLRVPRAGAEGEFTHRSQGAIRARDWPGYGQGSEKSMFIGRHYRKKRALSLCAVRTTKKACKLLIVMWTPPRNDQHYLNWQWYSSILSSHAAMCGCPDAVAHFNHLASVLRAPQNPPPPGPQRNLPLRRLPALPAAPEAPGDRAPWPMAGGAEGEDGGAGGDADHGGAAGGPEDADLLDAVAAAE
表2.在EIA中分析對(duì)與TT病毒完整開(kāi)放讀碼框1(ORF1)對(duì)應(yīng)的重疊合成肽的人抗體反應(yīng)性。給出數(shù)值為405nm處的光密度。OD值大于0.500判定為陽(yáng)性，并用粗體標(biāo)出。

表3.在EIA中分析對(duì)與TT病毒完整開(kāi)放讀碼框2(ORF2)對(duì)應(yīng)的重疊合成肽的人抗體反應(yīng)性。給出數(shù)值為405nm處的光密度。OD值大于0.500判定為陽(yáng)性，并用粗體標(biāo)出。
表4.與人血清樣品反應(yīng)的TTV肽序列.ORF1肽編號(hào)肽序列10VLICGENTVSRNYATHSSEQ ID NO318KINTMPPFLDTELTAPSSEQ ID NO429PDEKSQREILLNKIASYSEQ ID NO535TATTTTYAYPGTNRPPVSEQ ID NO142GLYSSIWLSPGRSYFETSEQ ID NO644YTDIKYNPFTDRGEGNMSEQ ID NO750DQNIHMNARLLIRSPFTSEQ ID NO851LIRSPFTDPQLLVHTDPSEQ ID NO969QKESLLFPPVKLLRRVPSEQ ID NO10ORF2肽編號(hào) 肽序列19 EDGGAGGDADHGGAAGGP SEQ ID NO11
表5.分析系列稀釋的三份人血清樣品與TTV肽TATTTTYAYPGTNRPPV(SEQ ID NO1)的反應(yīng)性。給出值為405nm處OD和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。
表6.分析三份人血清樣品對(duì)TTV肽TATTTTYAYPGTNRPPV(SEQ ID NO1)的缺失和丙氨酸替換類似物的反應(yīng)性。給出值為405nm處OD。陽(yáng)性反應(yīng)(即大于50％初始肽反應(yīng)性)以粗體標(biāo)出。
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權(quán)利要求
1.具有氨基酸序列SEQ ID NO1Thr Ala Thr Thr Thr Thr Tyr Ala Tyr Pro Gly Thr Asn Arg Pro ProVal的肽，其中N-端氨基酸Thr Ala Thr Thr Thr Thr中的一到六個(gè)可以去除。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其具有氨基酸序列SEQ ID NO2Tyr Ala Tyr Pro Gly Thr Asn Arg Pro Pro Val。
3.肽混合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的肽和至少一個(gè)以下肽SEQ ID NO3Val Leu Ile Cys Gly Glu Asn Thr Val Ser Arg Asn Tyr Ala Thr HisSer，SEQ ID NO4Lys Ile Asn Thr Met Pro Pro Phe Leu Asp Thr Glu Leu Thr Ala ProSer，SEQ ID NO5Pro Asp Glu Lys Ser Gln Arg Glu Ile Leu Leu Asn Lys Ile Ala SerTyr，SEQ ID NO6Gly Leu Tyr Ser Ser Ile Trp Leu Ser Pro Gly Arg Ser Tyr Phe GluThr，SEQ ID NO7Tyr Thr Asp Ile Lys Tyr Asn Pro Phe Thr Asp Arg Gly Glu Gly AsnMet，SEQ ID NO8Asp Gln Asn Ile His Met Asn Ala Arg Leu Leu Ile Arg Ser Pro PheThr，SEQ ID NO9Leu Ile Arg Ser Pro Phe Thr Asp Pro Gln Leu Leu Val His Thr AspPro，SEQ ID NO10Gln Lys Glu Ser Leu Leu Phe Pro Pro Val Lys Leu Leu Arg Arg ValPro，和SEQ ID NO11Glu Asp Gly Gly Ala Gly Gly Asp Ala Asp His Gly Gly Ala Ala GlyGly Pro。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，或根據(jù)權(quán)利要求3的肽混合物，其中至少一個(gè)肽被偶聯(lián)到載體和/或標(biāo)記上。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，或根據(jù)權(quán)利要求3的肽混合物，其中至少一個(gè)肽被固定到固相上。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求之任何一項(xiàng)的肽或肽混合物，用于藥物。
7.結(jié)合TT病毒的單特異性抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的單特異性抗體，其結(jié)合選自氨基酸序列SEQ IDNO1-11的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的用于藥物的單特異性抗體。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求1-5之任一項(xiàng)的肽或肽混合物作為診斷抗原的診斷試劑盒。
11.包含一個(gè)或多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求7或8的單特異性抗體作為診斷抗體的診斷試劑盒。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任一項(xiàng)的肽或肽混合物在免疫非人哺乳動(dòng)物產(chǎn)生抗TT病毒的單特異性抗體中的用途。
全文摘要
描述了具有氨基酸序列SEQ ID No:1的肽,和可選地與一個(gè)或多個(gè)序列為SEQ ID No:13－11的肽混合的該肽。所有這些肽對(duì)應(yīng)于TT病毒基因組序列區(qū)域。還公開(kāi)了結(jié)合TT病毒的單特異性抗體。這些肽可偶聯(lián)到載體和/或標(biāo)記上,或固定到固相上。該肽或肽混合物,或單特異性抗體可用于藥物或診斷試劑盒中。該肽或肽混合物還可用于免疫非人哺乳動(dòng)物,以生產(chǎn)抗TT病毒的單特異性抗體。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1352649SQ00807153
公開(kāi)日2002年6月5日 申請(qǐng)日期2000年5月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月4日
發(fā)明者M·薩爾伯格 申請(qǐng)人:特里帕普股份公司