專利名稱:肽定序的方法
本發(fā)明涉及到一種對肽及蛋白質(zhì)進行化學(xué)定序的方法，其目的是確定組成肽及蛋白質(zhì)的各個氨基酸的種類及位置。更具體地說，本發(fā)明涉及到超過經(jīng)典的Edman降解系統(tǒng)的一種改進的方法。
天然存在的及近代由合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和多肽都是由氨基酸長鏈組成的化合物。在所有的生命體中都發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)并在生命體中具有激素、結(jié)構(gòu)基本成份、酶、免疫球蛋白及生命物質(zhì)的其他組份的功能。關(guān)于蛋白質(zhì)的功能及結(jié)構(gòu)的研究，經(jīng)常需要確定蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序(一級結(jié)構(gòu))。為了用化學(xué)方法或應(yīng)用重組體DNA技術(shù)來合成蛋白質(zhì)或部份蛋白質(zhì)(如生長激素抑制素、胰鳥素、內(nèi)啡肽等)，在嘗試進行合成之前通常必須確定該種蛋白質(zhì)所含的氨基酸順序。在包括蛋白質(zhì)(如免疫球蛋白、酶、病毒外殼蛋白及細(xì)胞表面蛋白)功能的探索中，在試圖闡明蛋白質(zhì)作用的機理時，必須確定蛋白質(zhì)或多肽的一級結(jié)構(gòu)。在重組體DNA方法研究中，必須確定一級結(jié)構(gòu)以闡明為該一級結(jié)構(gòu)編碼的相應(yīng)的DNA或RNA結(jié)構(gòu)。
在測定蛋白質(zhì)或多肽中氨基酸的基本順序時，通常是用一種逐步降解法，在該方法中，將單個的氨基酸逐個地從多肽末端除下以便進行鑒定。Edman降解作用是較好的方法，但是也發(fā)展了一些其他的方法并可在某些情況下應(yīng)用。在Edman降解作用中，是使N-末端氨基酸殘基與一種能有選擇性地從蛋白質(zhì)上除下該氨基酸殘基的試劑來進行反應(yīng)以從蛋白質(zhì)的末端除下氨基酸。所除下的氨基酸衍生物可轉(zhuǎn)變成一種穩(wěn)定的化合物，用化學(xué)方法可將該化合物從反應(yīng)混合物中分離出來并進行鑒定。
在五十年代由Edman提出的逐步降解蛋白質(zhì)及肽的方法〔Edman，P.，斯堪的納維亞化學(xué)學(xué)報，4，283(1950)〕在過去35年中幾乎沒有什么改變，如圖1所示，該三步的反應(yīng)過程包括在堿性或無水條件下，在一種溶劑中，使含有N氨基酸的一種肽的N-末端氨基酸偶合到異硫氰酸苯酯(PITC)上(圖1A)。用液-液萃取法(通常用重復(fù)的步驟)除去過量的試劑(過量500至10，000倍克分子)并在真空中除去溶劑。然后用無水酸使N-末端氨基酸裂解以形成氨基-末端氨基酸的一種苯胺基噻唑啉酮(ATZ)衍生物以及N-1長度的氨基酸的一種游離肽的鹽，此種肽是除去了末端氨基酸的原本的肽。圖1B。在真空中除去裂解的酸并從留在液相中的殘余肽中萃取氨基酸的ATZ衍生物。然后，接著就使這種及不穩(wěn)定的ATZ氨基酸與酸的水溶液反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成一種較穩(wěn)定苯乙內(nèi)酰硫脲(PTH)氨基酸。圖1C。然后將此縮短了的殘余肽(N-1氨基酸)用PITC處理以引發(fā)另一次降解循環(huán)。然后用色譜法鑒定所得到的PTH氨基酸。對于肽中的每個末端氨基酸，用重覆上述的步驟處理。
液相手動的EDMAN技術(shù)在發(fā)展的早期，Edman降解技術(shù)是用手動來進行的。反應(yīng)室是一支試管或相似的容器，有時使用一種特殊的罩子，使試劑的添加及除去可在一種惰性氣氛中進行。用注射器或移液管來加入試劑而試劑的清除則用真空操作或?qū)⑵淙芙饣蜉腿∪胍环N溶劑中。在偶合的過程中，將蛋白質(zhì)或肽溶解于一種堿性偶合緩沖液中。這種方法對于大的蛋白質(zhì)分子是無效的，因為它們相對地不溶于這種堿性介質(zhì)中。
在偶合之后，在除去偶合緩沖液及不需要的付產(chǎn)物時出現(xiàn)了許多問題。在這種技術(shù)中的一個難題是所留下的肽衍生物可能干燥成為一種膠質(zhì)薄膜，而難以從其中除去反應(yīng)的付產(chǎn)物。應(yīng)用冷凍-干燥的一些方法試圖減輕這一難題。另一個非常大的難題是除去非揮發(fā)性物質(zhì)，因為在將這類物質(zhì)除去時，肽的PITC衍生物也易溶于同一溶劑中，因而要未留下過量的PITC要未就是使樣品損失。有一種方法是將揮發(fā)的試劑除去而留下干的PITC-衍生物及不揮發(fā)的付產(chǎn)物。然后選擇一種或幾種易于溶解不需要的物質(zhì)而較難溶解PITC-肽的溶劑來洗滌該剩余物。然而那些需要除去的物質(zhì)易于被截留在不溶的PITC-肽的基體中。另一方法是將PITC-肽及其他物質(zhì)溶于一種含有非極性溶劑的偶合緩沖液中并攪拌之，而非極性溶劑與偶合緩沖液是不相混的。這些其他物質(zhì)在非極性溶劑中的溶解度很大故可用此種溶劑萃取，而留下極性較強的PITC-肽則溶于極性的緩沖液中。溶有可溶解物質(zhì)的非極性溶劑可形成一個分離層，而此分離層可用移液管將之除去。但是此步驟似乎將某些PITC-肽萃取到非極性溶劑中。要除去萃取溶劑而不同時除去一定數(shù)量的PITC-肽和極性溶劑而且也不讓氧氣進到容器中是極難辦到的。
由于上述PITC-肽偶合的過程是在液相中進行的，所以不能選擇具有最佳偶合特性效果的偶合緩沖液。強堿能最有效地促進偶合作用。但是，由于在液相偶合介質(zhì)中存在著大量的水，必須將pH值的水平限制在低于肽及試劑發(fā)生水解作用的數(shù)值。因此，選擇介質(zhì)的pH值水平約為9作為促進偶合所需要的高pH值與限制水解裂解及試劑降解所需要的低pH值之間的折衷數(shù)值。
將一種無水裂解酸加到PITC-肽中以進行裂解的步驟并隨后將它清除。所應(yīng)用的酸是揮發(fā)性的，在裂解反應(yīng)完成后可用蒸發(fā)將其清除之。此后，用一種萃取溶劑將ATZ-氨基酸取出而留下殘余的肽。
通常這些萃取過程必須以少量的物質(zhì)如25微升來進行。如上所述，在萃取過程中常常導(dǎo)致物質(zhì)非特定數(shù)量的損失。而且，手工操作的定序過程必然要求有很熟練的技術(shù)及實際的經(jīng)驗。為了克服這些難題，可將肽固定在一種高分子量的聚合物〔消化己二甲胺(Polybrene)〕上或者以共價鍵連接到一種不溶的基質(zhì)上并使之經(jīng)受如下所述的自動化降解作用。雖然自動化解除了許多所遭遇到的困難，但是它昂貴而緩慢(每小時最多一個氨基酸)。
固相手工操作的EDMAN方法在Schroeder，W.A.，酶學(xué)的方法11，445(1967)及Jentsch，關(guān)于蛋白質(zhì)順序分析方法的第一次國際會議會刊雜志，193(1975)。中敘述了對上述液相Edman方法的改進方法。在此法中，蛋白質(zhì)或肽是以非化學(xué)方法淀積在一種紙條上，而在定序過程中它始終淀積在此紙條上。固相方法與上述液相方法的主要的區(qū)別在于偶合用的堿及裂解用的酸是由在一個封閉的容器中，將紙條暴露在一種氣相的酸或堿的固定氣氛中來供應(yīng)的。
上述方法適用于大的蛋白質(zhì)及肽的降解作用。因為這種方法不需要為了反應(yīng)而將樣品溶解，而是將肽以高稀釋高分布在紙帶上以形成覆蓋在一個大的表面積上的薄膜。上述系統(tǒng)需要非常長的一段時間來進行一次降解循環(huán)。促成此種長時間的因素是由于氣相試劑只能以一種低效率的對流方式與肽接觸。而且，溶劑萃取及干燥過程是在沒有攪拌或其他強制的對流措施下進行的。
此方法的另一個缺點是它只對相對小的蛋白質(zhì)或肽的片段的降解有效。人們相信這種低效率在很大程度上是由于機械的及萃取的損失以及未能防止反應(yīng)物的氧化。
此方法的另一缺點是必須用不同的溶劑來萃取組氨酸及精氨酸衍生物，而這些溶劑也同樣易于萃取肽。人們相信這是由于在紙片上的肽的不完全固定所造成的。
螺旋杯自動定序器Edman，P.，及Begg，G.，在歐洲生物化學(xué)雜志1，80(1967)及美國專利第3，725，010號中敘述了自動化的蛋白質(zhì)定序器。在這些定序器中，Edman降解作用是按上述液相技術(shù)相同的基本原理及方法進行的。其基本的區(qū)別在于其反應(yīng)是在螺旋杯的內(nèi)表面上的一種薄膜中進行，而液體則是由溢流出杯邊而被除去，而不是用移液管或注射器。用泵及閥門系統(tǒng)將試劑加到杯中，而物質(zhì)的除去則與上述的液相手工操作的Edman方法相同，是用真空蒸發(fā)或在非極性溶劑中溶解或萃取。
使樣品在杯內(nèi)壁上保持一層薄膜。上述儀器中的一個問題是對于小的肽的定序效率低。這是由于在杯壁上的樣品的膜。受到劇裂攪拌后很容易溶于用來帶走過量的試劑、付產(chǎn)物及所需要的ATZ-氨基酸衍生物的洗滌用的或萃取用的溶劑中。因此，小的肽就被溶解或懸浮于這些溶劑中并在定序完成之前即被洗出螺旋杯之外。在美國專利第3，725，010號中應(yīng)用了可用蒸發(fā)的方法除去的一種揮發(fā)性偶合緩沖液。但是可應(yīng)用一種液體萃取步驟從肽中除去大量的非揮發(fā)性的物質(zhì)。在這一步驟中，可將相對小的肽從杯中萃取出來。
螺旋杯方法的另一缺點是，蛋白質(zhì)的干燥必須很小心地進行以保持一層薄膜，因此，如果試圖立即將大量的溶劑進行蒸發(fā)，則在杯壁上的溶劑將沸騰并飛濺出來，從而將膜破壞。因此，在開始干燥蛋白質(zhì)時是在一種緩和的受限制的真空中進行。在這種條件下形成了穩(wěn)定的干膜以后，再繼續(xù)進行較大量的蒸發(fā)以完成干燥的過程。如果不應(yīng)用全真空蒸發(fā)，某些揮發(fā)性溶劑將留在杯壁上并將與其他步驟中的不同的試劑化合，而形成可干擾降解反應(yīng)的不溶性鹽。這種廣度的干燥是費時間的而實際上影響了整個循環(huán)時間。此外，該系統(tǒng)還需要有一個高度精密的真空裝置。由于在真空系統(tǒng)中揮發(fā)的各種物質(zhì)，在固定的空間中結(jié)合而形成固體鹽類，故為了對裝置進行適當(dāng)?shù)谋ｐB(yǎng)，必須在每次操作之后清潔該系統(tǒng)。這個問題很嚴(yán)重，以致某些工作者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有必要對于在美國專利第3，725，010號中所敘述的裝置的真空系統(tǒng)整個地重新設(shè)計。
螺旋杯定序器的另一個缺點是，它需要精密地計量加入杯中的試劑及溶劑，以確保以相同的數(shù)量送入后繼的循環(huán)中。此外，在杯中未反應(yīng)或部份反應(yīng)的蛋白質(zhì)會形成一個環(huán)，這樣就難以達到進一步的反應(yīng)，而妨礙了降解的過程。此種計量系統(tǒng)是復(fù)雜的而且難以保養(yǎng)。
Laursen，R.A.歐洲生物化學(xué)雜志20(1971)陳述了另一類型的自動定序器。將要降解的肽以共價鍵連接到一種凝膠型的固相支持物上并裝在管狀玻璃柱內(nèi)以形成一個反應(yīng)室。可用其他的溶劑或試劑替換的方法將所有的試劑和溶劑從反應(yīng)柱上除去。
上述系統(tǒng)與以前的定序方法相比，其主要的區(qū)別是，不用蒸發(fā)的方法來作為除去物質(zhì)的技術(shù)。而代之以在整個過程中以液體注入柱中，以便使固體支持物保持在膨脹的、多孔的狀態(tài)。上述Laursen論文認(rèn)為膨脹的聚合物小球支持物限制了對長度為30或較小殘基的肽的定序過程。
在Waschter，E.，Machleidt，H.，Hofner，H.，及Otto，J.，歐洲生物化學(xué)協(xié)會聯(lián)合會通信35，97(1973)中，應(yīng)用了大孔玻璃支持物，使蛋白質(zhì)及較大的肽能夠定序，上述系統(tǒng)的一個主要的缺點是只能使用液態(tài)的試劑。因此，肽以完全的共價鍵連接到固相支持物上是必需的。這是由于裂解的酸是蛋白質(zhì)及肽的極好溶劑，它會將未以共價連接的蛋白質(zhì)及肽從支持物質(zhì)上洗下來。由于肽或蛋白質(zhì)偶合的效率(約30至50%)，所以完全以共價鍵連接的要求限制了這種技術(shù)的使用率。另一個缺點是由于凝膠型的支持物受到許多溶劑的不利的影響，所以只有有限選擇出的溶劑可用來溶解用于偶合到支持物上的肽。必須指出的是此類凝膠型支持物對于留住小的肽是很有效的。由于所要求的偶合技術(shù)之故，某些殘基是不能被鑒定出來的。另一個缺點是偶合是一個長而令人生厭的過程。
在上述系統(tǒng)中另一個主要問題是，裂解酸必須被用作從反應(yīng)柱中萃取ATZ-氨基酸的溶劑，因為后者在前者中有高的溶解度，裂解酸也可從柱中萃取尺寸過小的物質(zhì)，而這些物質(zhì)干擾組氨酸及精氨酸的鑒定。應(yīng)用裂解酸作為ATZ-氨基酸溶劑的另一個缺點是延長ATZ-氨基酸的暴露可引起干擾ATZ-氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)镻TH衍生物的化學(xué)變化。
本系統(tǒng)的另一個限制是在反應(yīng)室中的液態(tài)溶劑及試劑的交換必須用泵將其泵進其他液體中來實現(xiàn)，因為它們之中沒有一種可用蒸發(fā)作用來除去，泵送量受到柱的反壓力的限制，因此這種交換是相對慢的。
PTH-氨基酸的鑒定已經(jīng)制備成多種多樣的異硫氰酸酯，以便使用多種方法來監(jiān)測由降解產(chǎn)生的PTH-氨基酸。已經(jīng)用過薄層色譜(TLC)，氣體色譜(GC)，氣體色譜/質(zhì)譜分析(GC/MS)，液相色譜(LC)及帶有紫外光及螢光監(jiān)測的的高效液相色譜(HPLC)來鑒定PTH-氨基酸。而所有目前的方法都應(yīng)用HPLC。
為了克服在肽的液態(tài)及固態(tài)定序中所遇到上述難題，發(fā)展了本發(fā)明的方法，其中先前所用的液-液萃取由液-固萃取所代替。所應(yīng)用的固體是一種鍵合的硅膠吸附劑(它通過加入特定的反應(yīng)官能度而對其進行化學(xué)的改性)。為了應(yīng)用本發(fā)明的方法，已制備出一類新的異硫氰酸酯(ITC)，它含有設(shè)計用來與改性結(jié)合的硅膠吸附劑相偶合的功能團，本發(fā)明的ITC試劑及其合成方法，兩者同樣是分別待批的專利申請項目。
在本發(fā)明的方法中，所用的異硫氰酸酯試劑或其衍生物，具有A-B-C形式，其中A是一種順式或共平面的1，2或1，3二醇(-OH)或1，3羥基叔胺，它們可用于與硼酸部份進行反應(yīng)而形成一種環(huán)化結(jié)構(gòu)(硼酸酯);B是任何的發(fā)色團，熒光團或起電團(electrophore)它們可用可見光的紫外光、用電化學(xué)方法的熒光來鑒定;而C是一種化學(xué)功能團，該團可用來與一種由肽而來的未端氨基酸反應(yīng)，結(jié)果形成一種脲或硫脲鍵，并可以是但并不限于是下述這些伯胺反應(yīng)活性物質(zhì)
上述ITC化合物的每一種試劑通常都被稱為“ITC試劑”。
在本發(fā)明的方法的第一步中，在可使ITC試劑的C部份及N-末端氨基酸的氨基部份之間進行反應(yīng)的堿性條件下，將一種過量的ITC試劑加到多肽或蛋白質(zhì)中以便定序。
使過量的ITC試劑與含有一個其反應(yīng)性比脂肪族的N-末端的胺活潑的芳香胺的清除劑發(fā)生反應(yīng)，完成以過量的ITC試劑的提取。這種清除劑也含有一個可與固定化的有機汞基質(zhì)(PHgOH)進行反應(yīng)而能有效地被提取的巰基。過量的ITC-清除劑和清除劑是被固定在PHgOH柱上或淤漿中，而反應(yīng)了的ITC試劑則留在溶液中。
在Edman降解反應(yīng)的技術(shù)中已知的標(biāo)準(zhǔn)條件下，通常是應(yīng)用三氟乙酸(TPA)來裂解留下的ITC氨基酸部份，在裂解反應(yīng)之后，將所得到的ATZ氨基酸及剩余的肽溶于偶合緩沖液中，而ATZ氨基酸則由它與固定化的苯基硼酸(PBA)進行反應(yīng)來萃取。此反應(yīng)的最適反應(yīng)條件與偶合反應(yīng)的條件相同。余下的肽并不保留在固定化的PBA上而是進入另一次降解循環(huán)。利用酸化作用使ATZ-氨基酸從吸附劑上分離，而酸化作用亦有利于ATZ-氨基酸轉(zhuǎn)變成PTH-氨基酸，而接著再用常規(guī)的技術(shù)，如高效的液相色譜法來鑒定這種氨基酸。
圖1說明現(xiàn)有技術(shù)水平的Edman降解。
圖1A表示第4步，將PITC偶合到一種肽上。
圖1B表示從肽上裂解N-末端氨基酸復(fù)合物(ATZ-氨基酸)的步驟。
圖1C表示ATZ-氨基酸轉(zhuǎn)化成PTH-氨基酸。
圖2說明合成ITC試劑(DHMPITC)的各步驟。
圖3說明應(yīng)用本發(fā)明的方法，在一個肽定序中的一次循環(huán)。
圖3A表明一個ITC試劑偶合到一個肽上。
圖3B表明過量的ITC試劑結(jié)合到用于提取的清除劑分子上。
圖3C表明應(yīng)用固定化的PHgOH提取過量的ITC試劑-清除劑復(fù)合物。
圖3D表明ITC試劑-肽復(fù)合物裂解成一種ATZ-氨基酸及縮短了的肽。
圖3E說明在一個固定化的PBA柱上提取ATZ-氨基酸。
圖3F說明ATZ-氨基酸轉(zhuǎn)化成PTH-氨基酸。
本發(fā)明是一種用于從蛋白質(zhì)或肽的N-末端對該蛋白質(zhì)或肽定序的通用系統(tǒng)而且對于非常少量的起始物質(zhì)是有效的。
該方法包括下裂步驟合成a)ITC試劑的合成(圖2)。
b)固定化的有機汞制劑化合物(PHgOH)的合成。
c)固定化的苯基硼酸的合成。
定序d)ITC試劑偶合到多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸上(圖3A)。
e)第一次提取-除去過量的ITC試劑。
1)將清除劑分子以H2N-〔 〕-SH的形式加到偶合反應(yīng)混合物中，以形成由清除劑的巰基化合物與過量的ITC試劑結(jié)合成的一種復(fù)合物(圖3B)。
2)使步驟e(l)的反應(yīng)混合物流過裝有一種固定化的有機汞制劑(PHgOH)的柱中，使過量的清除劑與ITC-清除劑復(fù)合物結(jié)合到柱上，從而使多肽-ITC復(fù)合物流過柱而不保留在柱上。(圖3C)f)在無水酸條件下升溫1至30分鐘裂解。(圖3D)。此反應(yīng)從蛋白質(zhì)的肽余下部份除下ATZ-末端氨基酸部份。
g)第二次提取-將(f)步驟的反應(yīng)混合物倒入裝有固定化的苯基硼酸(PBA)的柱中該PBA將1，2或1，3二醇或類似的活性部份結(jié)合到硼酸上而將ATZ-氨基酸從多肽殘余物中分離出來(圖3E)。
h)收集通過柱而未被保留在柱上的殘余多肽并使其經(jīng)受接著發(fā)生的降解循環(huán)。
i)在含水酸中從PAB柱上除下ATZ-氨基酸。
j)將ATZ-氨基酸轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH-氨基酸。
k)應(yīng)用高效液相色譜或其他的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定PTH-氨基酸。
ITC試劑應(yīng)用于本發(fā)明的ITC試劑具有化學(xué)式A-B-C，式中A是一種順式或共平面的1，2或1，3二醇(-OH)或在堿性或中性條件下可用來與硼酸反應(yīng)的1，3羥基叔胺。
B是在已知條件下任何可檢測的發(fā)色團、熒光團或可檢測的起電團(electrophore);在應(yīng)用高效液相色譜、氣相色譜、液相色譜及類似的方法將氨基酸分離之后，應(yīng)用檢測技術(shù)B就可被用來對氨基酸進行定位及鑒定。
C是一個化學(xué)功能團，它可用于與從多肽而來的一個末端氨基酸進行反應(yīng)從而形成一個脲或硫脲鍵同時它可能是但并不限于下列的這些伯胺反應(yīng)活性物質(zhì)
這些基團也具有與下列通式的一類清除劑化合物反應(yīng)的活性H2N-〔 〕-SH這類化合物導(dǎo)致一種清除劑-ITC復(fù)合物具有能與一個有機汞制劑部份發(fā)生反應(yīng)的反應(yīng)活性。
有用的ITC試劑的例子包括2，3-二羥馬來酰亞胺-4′-異硫氰酸苯酯(DHMPITC)，表示于圖2并敘述如下;
2，3-二羥基，異硫氰酸萘酯;
1，8-二羥基，異硫氰酸萘酯，二羥基馬來酰亞胺-4′-偶氮苯異硫氰酸苯酯以及類似的化合物。在某些條件下，一個叔胺部份可用來代替在一個ITC試劑上的羥基。
由ITC試劑與固定化苯基硼酸反應(yīng)所得到的硼酸酯必須是很易于水解的。因此在二醇之間的鍵或相似的反應(yīng)活性部份，以及該硼酸可用水解來斷開，因此可以從PBA柱上將ATZ-氨基酰洗脫。
清除劑分子本發(fā)明的清除劑分子可與過量的ITC試劑反應(yīng)，并具有通式H2N-〔 〕-SH式中〔 〕是任何相關(guān)的非活性烷基、芳基或其衍生物。其氨基是用來與在ITC試劑上的-N＝C＝S或類似的活性基團反應(yīng)的。其SH基可與PHgOH反應(yīng)，因此可以除去過量的ITC試劑，在現(xiàn)有的定序技術(shù)中除去過量的ITC試劑，已成為一個主要的難題。該〔 〕組份與在氨基酸上發(fā)現(xiàn)的任何典型的基團應(yīng)該沒有特別的反應(yīng)活性。適用的清除劑分子的例子是H2N-苯基-SH(氨基硫酚)，H2N-苯基-CH2SH(甲巰基)苯胺)，H2N-CH2-CH2-SH(胱胺)及前述的任何化合物的全鹵化的類似物。特別適用的清除劑分子是(甲巰基)苯胺及胱胺。
其他考慮在定序的準(zhǔn)備中，必須將肽或蛋白質(zhì)用化學(xué)方法改性以阻止半胱氨酸及賴氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)，從而防止在半胱氨酸側(cè)鏈與固定化的有機汞制制之間的中間反應(yīng)，并防止可導(dǎo)致與固定化的硼酸起中間反應(yīng)的賴氨酸側(cè)鏈的氨基發(fā)生改性。
實施例Ⅰ2，3-二羥基馬來酰亞胺-4-異硫氰酸苯酯的合成(DHMPITC)(圖2)將3.7克水合二羥基富馬酸溶于80毫升的無水四氫呋喃中。再將含有5.2克的1，3-二環(huán)己基羰二酰亞胺的50毫升四氫呋喃溶液逐滴加到該酸溶液中。產(chǎn)生一種白色的固體沉淀并將沉淀從溶液中濾出。將含有2，3-二羥基馬來酸酐的淡黃色溶液立即應(yīng)用如下
將含有5克叔丁氧羰基-1，4-亞苯基二胺的50毫升四氫呋喃逐滴加到2，3-二羥基馬來酸酐中，生成一種深橙色溶液并在約50℃加熱4小時。使溶液冷卻到室溫然后蒸發(fā)至干。得到一種棕色帶紅的蠟狀物質(zhì)，然后將此粗產(chǎn)品溶于在二氧雜環(huán)己烷中的150毫升4N鹽酸中并在室溫下攪拌一小時。然后用純氮氣通入溶液中鼓泡以除去鹽酸。將所得到的不均勻的混合物在減壓下蒸發(fā)至干而產(chǎn)生一種暗棕色的固體。
將4′-(2，3-二羥基馬來酰亞胺)苯胺粗產(chǎn)品懸浮于200毫升水中，向其中加入25毫升濃鹽酸。攪拌所得到的深紅色溶液同時加入二氯硫化碳2.3毫升。然后在室溫下使反應(yīng)進行3小時。將粗產(chǎn)品從溶液中濾出，用0.1N鹽酸洗滌，然后溶解于氯仿中并用快速硅膠柱提純，用氯仿洗脫。在真空下干燥首次洗脫下的產(chǎn)品，得到2，3-二羥基馬來酰亞胺-4′-異硫氰酸苯酯。產(chǎn)率為64%。紅外線分析表明在2100cm-1處有一異硫氰酸酯特性的強帶，在3400cm-1處有一連羥基特性帶。
實施例Ⅱ由N-苯基汞-N′-丙基甲硅烷基脲硅膠(PHgOH)合成將氨基丙基硅膠(1.5%N)，(粒度40微米不均勻及60A孔隙度)在80℃干燥三小時，然后在干燥器中冷卻至室溫。每一克氨基丙基硅膠需要用10毫升二氯甲烷溶解的0.8克N，N′-羰基二咪唑及0.13毫升的三乙胺。將氨基丙基硅膠加至該反應(yīng)混合物中并在室溫攪拌三小時。
將被活化的硅膠從溶液中濾出并用二氯甲烷洗滌再用二甲基甲砜(DMSO)洗滌2次。然后將被活化的硅膠立即加到含于DMSO中的10%乙酸對一氨基苯汞的溶液中。每一克的活化硅膠，需用7毫升的溶液。在40℃將反應(yīng)混合物攪拌24小時。然后將改性的硅膠放回到用氨飽和了的DMSO溶液中，并在室溫將反應(yīng)混合物攪拌3小時。最后，將產(chǎn)品從溶液中濾出并用50%DMSO∶水，0.02N鹽酸，1N氯化鈉洗滌及再用水洗滌兩次。然后使產(chǎn)品在室溫下干燥。
實施例ⅢN-苯基硼酸-N′-丙基甲硅烷基脲硅膠(PBA)將氨基丙基硅膠(1.5%N)，(40微米不均勻的及60A平均孔隙度)，在80℃干燥3小時，然后在干燥器中使之冷卻至室溫。每一克的氨基丙基硅膠，需要用10毫升的二氯甲烷溶解的0.8克的N，′N′-羰基二咪唑及0.13毫升的三乙胺。將氨基丙基硅膠加到此反應(yīng)混合物中并在室溫下攪拌3小時。將活化硅膠從溶液中濾出并用二氯甲烷洗滌再用二甲基亞砜(DMSO)洗滌兩次。然后將此活化硅膠立即加到含于90%的DMSO中的5.3%對-氨基苯基硼酸半硫酸酯的溶液中。每一克活化硅膠需用7毫升的溶液。在40℃將反應(yīng)混合物攪拌24小時。然后將此改性的硅膠放回用氨飽和的DMSO的溶液中并將此反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時。最后，將產(chǎn)品從溶液中濾出并用50%DMSO、0.02N鹽酸、1N氯化鈉洗滌再用水洗滌兩次。然后使產(chǎn)物在室溫下干燥。
實施例Ⅳ在定序中應(yīng)用將2，3-二羥基馬來酰亞胺-4′-異硫氰酸苯酯(DHMPITC)(實施例Ⅰ)溶于乙腈中其濃度為5%(重量/體積)。將50毫微克分子的血管緊張肽1溶解于200微升的固相定序緩沖液中(3∶2吡啶∶三氟乙酸N-甲基嗎啉酯，pH8.2)并將其轉(zhuǎn)移到一個1毫升的反應(yīng)小玻瓶中。加入20微升的DHMPITC溶液。用氮氣吹洗小玻瓶并在50℃加熱15分鐘。接著將50微升的5%(體積/體積)(甲巰基)苯胺溶液加至反應(yīng)小玻瓶中并繼續(xù)再加熱15分。然后將小玻瓶從加熱器上移開并將瓶中所裝物質(zhì)在真空和50℃下加熱10分鐘。
一支內(nèi)徑為4毫米的100毫克的N-苯基汞-N′-丙基正硅烷基脲硅膠(PHgOH)柱(實施例Ⅱ)預(yù)先用甲醇、水及200毫克分子的乙酸三甲基銨酯緩沖液，pH6.8洗滌備用。用3;2的乙酸三甲基銨酯(pH6.8)二氧雜環(huán)己烷緩沖液500微升溶解反應(yīng)小玻瓶中的干物質(zhì)并將其加到PHgOH柱中，用吸氣法洗脫該柱再用另一份500微升的上述緩沖液洗滌。將流出液合并，并在50℃及真空中干燥30分鐘。
向不裝有過量的DHMPITC及(甲硫基)苯胺而裝有2，3-二羥基-馬來酰亞胺-4′-苯基硫代氨基甲酰肽的干殘余物的小玻瓶中加入250微升的無水三氟乙酸并將小玻瓶加熱到50℃十分鐘。然后將小玻瓶中所裝的物質(zhì)在50℃及真空中干燥十分鐘。
將一支100毫克的N-苯基硼酸-N′-丙基正硅烷基脲硅膠(PBA)的柱(內(nèi)徑4毫米)(實施例Ⅲ)用甲醇、水及50毫克分子乙酸三乙基銨酯緩沖液(pH8.2)洗滌備用。用500微升的1∶1乙酸三乙基銨酯(pH8.2)∶乙腈緩沖液溶解反應(yīng)小玻瓶中的干物質(zhì)并將其加到PBA柱上。用吸氣法將殘余的肽從柱上洗脫再用另一份500微升的上述緩沖液洗滌該柱。合并流出物，在真空中干燥并用于另一次定序循環(huán)。
用500微升的5∶3∶2的乙腈∶水∶三氟乙酸將2，3-二羥基馬來酰亞胺-4′-苯胺基噻唑啉酮氨基酸從PBA柱上洗脫并在85℃加熱15分鐘，使之環(huán)化成相應(yīng)的苯基乙內(nèi)酰硫脲。
在一尺寸為4.6×150毫米的十八烷基柱上，用逆相高效液相色譜法(HPLC)鑒定所得到的2，3-二羥基-4′-苯基乙內(nèi)酰硫脲。用加到0.15%(V/V)三氟乙酸的水緩沖液中的乙腈(達到40%(V/V)進行梯度洗脫來測定DHMPTH氨基酸的滯留時間。應(yīng)用與紫外光檢測相關(guān)聯(lián)的熒光來檢測。
權(quán)利要求
1.測定一種多肽末端氨基酸種類的一種方法，包括b)將所說的末端氨基酸與在所說的試劑上的所說的c部份偶合；c)除去過量的試劑；d)從剩余的上述多肽上裂解出上述試劑-末端氨基酸復(fù)合物；e)將剩余的上述多肽與上述試劑-末端氨基酸分離；f)將上述試劑末端氨基酸復(fù)合物轉(zhuǎn)化成一種穩(wěn)定的化合物；并且g)鑒定此轉(zhuǎn)化了的末端氨基酸。
2.權(quán)利要求
1的方法還包括重復(fù)進行權(quán)利要求
1的步驟，對從上述f步驟中獲得的上述剩余的多肽，進行多肽或蛋白質(zhì)的定序，從而鑒定每一個循環(huán)的剩余的多肽的末端氨基酸。
3.權(quán)利要求
1的方法，其中的步驟c還包括(ⅰ)將步驟b的反應(yīng)混合物與一種具有下列化學(xué)式的清除劑分子進行反應(yīng)H2N-〔〕-SH，式中〔〕是一個烷基、芳基或全鹵化了的烷基或芳基，反應(yīng)是在有利于上述NH2部份與上述過量的試劑的上述c部分之間發(fā)生反應(yīng)的條件下進行;(ⅱ)將步驟(ⅰ)的產(chǎn)品與固定化的有機汞制劑混合，以便結(jié)合過量的清除劑分子與清除劑分子-試劑復(fù)合物;及(ⅲ)除去未固定的試劑-多肽復(fù)合物。
4.權(quán)利要求
3的方法，其中清除劑是選自含有H2N-苯基-SH，H2N-苯基-CH2-SH，H2N-CH2-CH2-SH，及其全鹵化衍生物的化合物組。
5.權(quán)利要求
4的方法，其中所說的清除劑是(甲巰基)苯胺。
6.權(quán)利要求
3的方法，其中所說的固定化的有機汞制劑包括鍵合到一種固定化的硅膠上的苯基汞氫氧化物。
7.權(quán)利要求
1的方法，其中步驟e還包括將步驟d的反應(yīng)混合物與一種固定化硼酸混合，并除去未固定化的物質(zhì)。
8.權(quán)利要求
7的方法，其中所說的固定化硼酸是將苯基硼酸鍵合到硅膠上。
9.權(quán)利要求
8的方法，其中所說的步驟e(ⅲ)包括用含水酸處理上述的固定化硼酸，以從其中除下所說的試劑-氨基酸復(fù)合物。
10.權(quán)利要求
3，4，5，及6的方法，其中將上述的有機汞制劑基質(zhì)放置在一條柱中。
11.權(quán)利要求
7，8及9的方法，其中上述固定化的硼酸是被放置在一條柱中。
12.測定一種多肽的N-末端氨基酸種類的一種方法，包括a)獲得2，3-二羥基馬來酰亞氨-4′-異氰酸苯酯(DHMPITC);b)將上述多肽的末端氨基酸偶合到上述的DHMPITC上;c)將(甲巰基)苯胺加到步驟b所說的反應(yīng)混合物中;d)在含有N-苯基硼酸-N′-丙基正硅烷基脲(PBA)的柱上洗提上述步驟c的反應(yīng)混合物;e)在無水酸的條件下裂解步驟d的洗提液;f)將步驟e的反應(yīng)混合物加到含有N-苯基硼酸-N′-丙基正硅烷基脲(PBA)的柱上;g)在含水酸的條件下，將由步驟f得到的固定化產(chǎn)物從PBA柱上洗脫;h)將從步驟g所得的洗脫液轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的苯基乙內(nèi)酰硫脲氨基酸衍生物;以及i)鑒定步驟h的產(chǎn)物。
13.測定一種多肽的N-末端氨基酸的種類的方法，包括a)提供一種含有A-B-C形式的異硫氰酸酯或其衍生物的偶合試劑，式中A部份是一種順式或共平面的1-2，或1-3二醇或者1-3羥基叔胺，而B部份是能用可見光、紫外光、熒光或電化學(xué)的方法來鑒定的任何發(fā)色團、熒光團或起電團(electrophore)，而c部份是能與一種多肽的末端氨基酸反應(yīng)，以形成脲或硫脲鍵的功能團;b)將一種多肽的樣品與一種偶合試劑接觸而形成一種反應(yīng)混合物，從而使偶合試劑的c部份與一種多肽的N-末端氨基酸反應(yīng)而形成偶合試劑多肽復(fù)合物;c)用過量偶合試劑與一種清除劑分子反應(yīng)以形成一種清除劑分子復(fù)合物，以便從反應(yīng)混合物中除去過量的偶合試劑;d)將反應(yīng)混合物與第一個固定化試劑接觸以結(jié)合過量的清除劑分子，同時也可結(jié)合清除劑分子復(fù)合物，并由于與第一個固定化試劑接觸而除下偶合試劑多肽復(fù)合物;e)將偶合試劑多肽復(fù)合物裂解以形成含有偶合試劑-多肽的N-末端氨基酸復(fù)合物和裂解后的多肽的一種混合物;f)將上述混合物與可和偶合試劑的A部分進行反應(yīng)的第二個固定化試劑相接觸，而使偶合試劑N-末端氨基酸復(fù)合物與裂解出來的殘余多肽分離，以便將偶合的N-末端氨基酸復(fù)合物結(jié)合到固定化試劑上，并由于與第二個固定化試劑接觸而將裂解出來的多肽除去;g)將偶合試劑N-末端氨基酸復(fù)合物轉(zhuǎn)化成一個穩(wěn)定化合物;以及h)鑒定在步驟f中形成的穩(wěn)定的化合物。
14.權(quán)利要求
13的方法還包括重復(fù)進行權(quán)利要求
1的步驟，對從步驟e獲得的裂解的多肽進行定序。
15.權(quán)利要求
13的方法，其中清除劑分子具有H2N-〔〕-SH化學(xué)式，式中〔〕是一個烷基或芳基或其全鹵化的衍生物，第一個固定化試劑包括一種固定的有機汞制劑，而清除劑分子復(fù)合物是由清除劑分子的NH2部份與過量的偶合試劑的c部份之間進行反應(yīng)形成的。
16.權(quán)利要求
15的方法，其中清除劑分子是選自包括H2N-苯基-SH，H2N-苯基-CH2SH，H2N-CH2-CH2SH及其全鹵化的衍生物的一組化合物。
17.權(quán)利要求
16的方法，其中清除劑分子是(甲巰基)苯胺。
18.權(quán)利要求
15的方法，其中固定化有機汞制劑包括鍵合到硅膠上的苯基汞氫氧化物。
19.權(quán)利要求
13的方法，其中第二個固定化試劑包括固定化硼酸。
20.權(quán)利要求
19的方法，其中固定化的硼酸是鍵合到硅膠上的苯基硼酸。
21.權(quán)利要求
20的方法，其中步驟e還包括以含水酸處理固定化硼酸，以從其中除下鍵偶合試劑N-末端氨基酸復(fù)合物。
22.權(quán)利要求
15，16，17或18的方法，其中將固定化的有機汞制劑物質(zhì)放置在一條柱中。
23.權(quán)利要求
19，20或21的方法，其中將固定化的硼酸放置在一條柱中。
24.測定多肽的N-末端氨基酸種類的方法包括a)提供一種偶合試劑包括2，3-二羥基馬來酰亞胺-4′-異硫氰酸苯酯(DHMPITC);b)將多肽的一份樣品與一種偶合試劑接觸，因而使偶合試劑的異硫氰酸酯部份與多肽的N-末端氨基酸反應(yīng)，以形成一種偶合試劑多肽復(fù)合物;c)將(甲巰基)苯胺加到反應(yīng)混合物中，因而使過量的偶合試劑與(甲巰基)苯胺反應(yīng)以形成一種清除劑分子復(fù)合物;d)通過含有N-苯基汞-N-丙基正硅烷基脲硅膠柱洗提步驟c的反應(yīng)混合物，而將過量的(甲巰基)苯胺及清除劑分子復(fù)合物結(jié)合到柱上并形成含有偶合劑多肽復(fù)合物的洗提液;e)在無水酸條件下將步驟d洗提液的偶合試劑多肽復(fù)合物裂解，以形成裂解的多肽和含有偶合試劑及多肽的N-末端氨基酸的復(fù)合物的混合物;f)通過含有N-苯基硼酸-N′-丙基正硅烷基脲硅膠(PBA)柱，洗提步驟e的混合物，以使偶合試劑N-末端氨基酸復(fù)合物結(jié)合到柱上并形成含有裂解的多肽的洗提液;g)在含水酸條件下，使在步驟f中被結(jié)合到PBA柱上的偶合試劑N-末端氨基酸復(fù)合物，從柱上洗出而得到含有偶合試劑N-末端氨基酸復(fù)合物的洗提液;h)將步驟g的洗提液中的偶合試劑N-末端氨基酸復(fù)合物轉(zhuǎn)化成一個穩(wěn)定的苯基乙內(nèi)酰脲氨基酸衍生物;以及i)鑒定在步驟h中形成的穩(wěn)定的苯基乙內(nèi)酰脲氨基酸衍生物。
專利摘要
一種利用液—固親合色譜法對多肽定序的方 法。該方法利用一種試劑與末端氨基酸的氨基部分 在一個位置上的反應(yīng)活性及與硼酸在另一位置上的 反應(yīng)活性。該試劑與末端氨基酸偶合。具有一個巰 基與一個氨基的清除劑分子與過量的試劑反應(yīng)，并用 一個固定化的有機汞制劑柱將過量的清除劑及清除 劑-試劑復(fù)合物除去。將末端氨基酸從多肽上裂解， 并偶合到一個固定化硼酸柱上。將氨基酸從柱上除 下并將其進行鑒定，而余下的多肽則進行另一次的循 環(huán)。
文檔編號G01N33/68GK87100897SQ87100897
公開日1987年11月11日 申請日期1987年2月20日
發(fā)明者馬克·L·斯托洛維茲 申請人:分析化學(xué)國際有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan