專利名稱：Tlp肽以及編碼它們的dna序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼肽的DNA分子，其中所述肽來源于TLP復(fù)合體的蛋白質(zhì)。更具體地，本發(fā)明涉及編碼100kDa TLP復(fù)合體的肽的cDNA序列。
首字母縮寫詞TLP(Tumor Liberated Particles，腫瘤釋放顆粒)系指存在于人腫瘤細(xì)胞，特別是肺癌中的蛋白質(zhì)復(fù)合體。依照EP283433中公開的方法在腫瘤組織中首次分離得到TLPs。隨后，某些形成TLP復(fù)合體的蛋白質(zhì)得到鑒定。在腫瘤學(xué)(Oncology)，1983，40248-253中公開了一種在肺癌中普遍表達(dá)的214kDa蛋白質(zhì)。
在WO 98/01462中公開了這種蛋白質(zhì)的特異性表位及針對它的抗體，另外，EP649433中公開了一種從肺癌中分離的100kDa蛋白質(zhì)，以及來源于其的免疫原性肽。這其中，肽RTNKEASI用于產(chǎn)生識別100kDa TLP復(fù)合體的多克隆抗體。這些抗體被用于鑒定不同來源組織中TLP表達(dá)的模式，并且用于證實(shí)作為腫瘤標(biāo)志的同一蛋白質(zhì)(WO 98/15282)。對不同腫瘤細(xì)胞系中TLP表達(dá)的研究已經(jīng)揭示出來自乳腺癌(MCF7)和結(jié)腸癌(HT29)細(xì)胞系中有相似的TLP表達(dá)水平。
而且，用化學(xué)治療劑進(jìn)行體外處理，在一種腫瘤細(xì)胞群(NSCLC)中呈現(xiàn)TLP抗原的表達(dá)增加，而用100kDa TLP蛋白質(zhì)以及來源于其的肽處理淋巴細(xì)胞時(shí)，淋巴細(xì)胞有特異性抗腫瘤作用(WO 98/15282)。
從腫瘤蛋白質(zhì)TLP復(fù)合體提供較多種的抗原性和免疫原性肽，以及提供用于大量產(chǎn)生具有診斷或治療用途的該TLP蛋白質(zhì)的有效方法的重要性是顯而易見的。為此，本發(fā)明人獲得了下文所述的編碼100kDa TLP復(fù)合體的肽的cDNA序列。
制備表達(dá)TLP的腫瘤細(xì)胞裂解物，從中提取總RNA，然后用成對的寡核苷酸引物進(jìn)行RT-PCR，其中所述寡核苷酸引物對分別為對應(yīng)于肽TNKEASI的簡并序列(正向引物)和隨機(jī)六核苷酸序列(反向引物)。將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至合適載體，然后測序。在其中鑒定出一300個(gè)堿基的開放閱讀框(ORF)，其序列報(bào)道在SEQ ID N.1中；由該ORF所編碼的氨基酸序列報(bào)道在SEQ ID N.2中。
第一方面，本發(fā)明提供了包含序列SEQ ID N.1的核酸分子、其按照遺傳密碼的簡并性而衍生的變體以及在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N.1的互補(bǔ)鏈雜交的核酸分子。
本發(fā)明還包括含有此處公開的核酸分子的表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體或常用于基因技術(shù)的任何其它載體，這些載體除含有編碼序列外，還可以包含控制元件，如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的序列，包括起始和終止密碼子、增強(qiáng)子、啟動子、信號序列等。此外，本發(fā)明包括轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化了上述載體的真核或原核細(xì)胞。
TLP蛋白質(zhì)的全序列使得可通過基因工程體外制備大量該蛋白質(zhì)。此類抗原制品的獲得使TLP在人惡性腫瘤中的作用得以深入研究。該全序列也使得可制備用于相應(yīng)腫瘤早期診斷的檢測試劑盒以及產(chǎn)生特異性抗癌疫苗。
本發(fā)明的另一方面涉及由SEQ ID N.1的DNA序列編碼的肽(正如SEQ ID N.2中所報(bào)道)或其片段。這些肽可用所述cDNA通過重組DNA方法制備或按照已知的方法化學(xué)合成(例如參見“Merrifield，(1986)科學(xué)(Science)232341-347”或“Barany和Merrifield，1979，肽(Thepeptides)，Gross和Meienhofer主編，紐約科學(xué)出版社(NY AcademicPress)，1-284”)。合成可以利用自動合成儀在液相或固相進(jìn)行。為維持免疫原性作用，可將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用不同的L-型或D-型殘基替換；或?yàn)樘岣咧T如免疫原性、免疫反應(yīng)誘導(dǎo)的選擇性或施用后生物利用度等特性，也可對它們進(jìn)行化學(xué)修飾，如羧基末端的酰胺化、連接親脂性基團(tuán)(如十四烷基)或進(jìn)行糖基化或與其他肽偶聯(lián)。肽也可以在側(cè)鏈上進(jìn)行化學(xué)衍生，例如在游離羧基上形成鹽、酯、酰肼。此外，所述肽可與已知表位偶聯(lián)以誘導(dǎo)出更高的抗腫瘤的細(xì)胞毒或輔助免疫反應(yīng)。
肽的免疫原活性易于通過體外試驗(yàn)確定。例如用T-淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(Protti M.P.等人，1990，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1441711-1720)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)(Protti M.P.等人，1996，癌研究(Cancer Res.)561210-1213)或與MHC分子的結(jié)合試驗(yàn)。
根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，來源于SEQ ID N.2的肽用于產(chǎn)生TLP特異性抗體。后者可以是單克隆或多克隆抗體，且識別于此處公開的肽的特異性TLP表位。這些抗體優(yōu)選用在免疫試驗(yàn)中檢測腫瘤中TLP的表達(dá)。
另一方面，本發(fā)明提供了上述核酸分子或肽的用途，它們用于制備藥物組合物以預(yù)防性或治療性治療腫瘤，尤其是肺癌。涉及cDNA用途的一個(gè)典型應(yīng)用是制備DNA疫苗，其可按照US5593972或US5580859中所授進(jìn)行。該肽也可與不同的化學(xué)治療劑結(jié)合使用，已知這些化學(xué)治療劑可以增加該肽的效果(WO98/15282)。
本發(fā)明的組合物包含有效量的DNA或肽及可作藥用的賦形劑?！坝行Я俊笔侵缸阋约せ盍馨图?xì)胞以及足以啟動細(xì)胞或體液反應(yīng)以對抗腫瘤的量。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，藥物組合物用于對瘤形成易感性受試者進(jìn)行預(yù)防接種或用于腫瘤患者的治療性接種。本文中術(shù)語“接種”是指主動接種或被動接種，其中所述主動接種即直接在患者體內(nèi)施用肽或cDNA以激活免疫反應(yīng)，其中所述被動接種即用肽體外激活T細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞并將它們隨后再接種至患者。疫苗的制備和使用方法為任一本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知；大量描述見例如Paul，基礎(chǔ)免疫學(xué)(Fundamental Immunology)，Raven出版社，紐約(1989)或Cryz，S.J.，免疫治療和疫苗(Immunotherapy andVaccines)，VCH Verlagsgesselschaft(1991)。疫苗通常以溶液、注射劑、懸液形式制備，但也可以固態(tài)或基于脂質(zhì)體制備物的形式制備。免疫原性成分可以與可作藥用的賦形劑混合以增加疫苗的有效性，所述可作藥用的賦形劑如乳化劑、緩沖劑、佐劑。
下述實(shí)施例較詳細(xì)地闡明了本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1—TLP cDNA的分離與克隆從幾種細(xì)胞系(HT29、SAOS-2、A 549、MCF-7、H23、H157、H1819、WI38)中用RNAzol B試劑(TEL-TEST，INC)提取總RNA，并用ReverseTranscription System(PROMEGA)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用上游簡并寡核苷酸ACN AAY AAR GAR GCN TCN ATH TC，以及作為下游引物的隨機(jī)六堿基(Random Hexamers)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，其中的上游簡并寡核苷酸對應(yīng)于RTNKEASI的氨基酸序列。PCR進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(95℃ 1分鐘，40℃ 2分鐘，72℃ 1分鐘)。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的1％瓊脂糖膠上電泳，將PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T easy載體(PROMEGA)(圖)。所得質(zhì)?？寺≡趹?yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)的373A型DNA測序儀上利用鏈終止法測序。推定出一個(gè)開放閱讀框(SEQ ID N.1)。
實(shí)施例2-抗體的產(chǎn)生與鑒定通過免疫四只兔獲得兔抗TLP血清，其中的免疫是指采用與0.5毫升弗氏完全佐劑相混合的溶于0.5毫升磷酸鹽緩沖液(PBS)中的0.5毫克肽SEQ ID N.2皮下注射兔。用不完全佐劑每隔兩周進(jìn)行加強(qiáng)注射。每隔一周通過耳靜脈取血收集血清。在96孔微量滴定板上通過放射免疫測定法測定抗血清的滴度?？變?nèi)包被固定濃度的肽抗原、洗滌、并與不同稀釋度的血清孵育。用125I標(biāo)記的蛋白A檢測結(jié)合的免疫球蛋白，并通過放射免疫測定法定量。在1∶1000稀釋時(shí)，所有的血清顯示與肽抗原的陽性顯色反應(yīng)。從相應(yīng)兔中取的免疫前血清也經(jīng)過試驗(yàn)，未檢測到明顯反應(yīng)。
Western印跡腫瘤細(xì)胞裂解物通過在200微升裂解緩沖液(50mM Tris，5mMEDTA，250mM NaCl，50mM NaF，0.1％Trion，0.1mM Na3PO4，加蛋白酶抑制劑)中重懸沉淀細(xì)胞得到。50微克蛋白質(zhì)提取物在8％聚丙烯酰胺凝膠上電泳。聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)在CAPS緩沖液(10mM CAPS，20％甲醇，pH11)中轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)。膜用在TBS-T緩沖液(2mMTris，13.7mM NaCl，0.1％Tween-20，pH7.6)中的5％牛奶封閉，隨后用TBS-T清洗。親和純化的抗TLP抗體與膜在3％牛奶中孵育，隨后用TBS-T清洗。然后，將膜與偶聯(lián)辣根過氧化物酶的兔抗兔Ab孵育且在TBS-T中清洗。用ECL系統(tǒng)(Dupont NEN)檢測與膜結(jié)合的二級抗體的存在。在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞裂解物中檢測出特異性染色。免疫前血清和對照裂解物均沒有顯示明顯反應(yīng)。
序列表序列表<110>尤尼哈特公司<120>TLP肽以及編碼它們的DNA序列<130>IFI<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>300<212>DNA<213>人<400>1accaacaaag aagcctccat ctgtccatcc gtatatctat ccaccctacc atccatccat 60tcacccacta attcatccat ttattatcca tgcatccatc tgtccataag tctatccgtc 120cacccaccac ttatccatcc atccatttac ccatcatact catccattca ttcatccagc 180caccacccat gcactcacct atccacccat tcagtcatta atccagtaaa aaattttgag 240cacctactac caatcaggcc ctgcacttgg accttagggt agtgtgtaaa taaaacccca 300<210>2<211>93<212>PRT<213>人<400>2Thr Asn Lys Glu Ala Ser Ile Cys Pro Ser Val Tyr Leu Ser Thr Leu1 5 10 15Pro Ser Ile His Ser Phe Thr Asn Ser Ser Ile Tyr Tyr Pro Cys Ile20 25 30His Leu Ser Ile Ser Leu Ser Val His Pro PrO Leu Ile His Pro Ser35 40 45Ile Tyr Pro Ser Tyr Ser Ser Ile His Ser Ser Ser His His Pro Cys50 55 60Thr His Leu Ser Thr His Ser Val Ile Asn Pro Val Lys Asn Phe Glu65 70 75 80His Leu Leu Pro Ile Arg Pro Cys Thr Trp Thr Leu Gly85 90
權(quán)利要求
1.一種核酸分子，其編碼具有序列SEQ ID N.2的TLP肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子，其具有序列SEQ ID N.1。
3.SEQ ID N.2的肽。
4.權(quán)利要求3的肽的單克隆或多克隆抗體。
5.一種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的核酸分子。
6.藥物組合物，其包根據(jù)權(quán)利要求1-2的核酸分子或根據(jù)權(quán)利要求3的肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其為疫苗形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求6-7的組合物，其用于預(yù)防或治療腫瘤。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其用于預(yù)防或治療肺腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明總的來說涉及編碼肽的DNA分子，其中所述肽來源于TLP復(fù)合體的蛋白質(zhì)。更具體地，本發(fā)明涉及編碼100kDa TLP復(fù)合體的蛋白質(zhì)的cDNA序列。
文檔編號A01G25/02GK1404527SQ01805475
公開日2003年3月19日 申請日期2001年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月17日
發(fā)明者G·塔羅 申請人:尤尼哈特公司