專利名稱：新的α－芋螺毒素肽，其編碼多核苷酸及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的α-芋螺毒素肽，編碼該肽的多核苷酸，含有該多核苷酸的構(gòu)建體和宿主細胞，以及人工合成和重組生產(chǎn)所述肽的方法。本發(fā)明還涉及所述芋螺毒素肽的用途。
背景技術(shù)：
芋螺(Conus)屬腹足綱前腮亞綱芋螺科，是一類肉食性軟體動物。地球上約有500種芋螺，每種芋螺毒液中有約50-200種不同的芋螺毒素(Conotoxin，CTX)，且不同芋螺種類的毒素肽互不相同。至少有幾萬種芋螺毒肽具有調(diào)節(jié)各種離子通道的特殊功能，CTX能區(qū)分各種離子通道的不同亞型，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)藥理學(xué)的研究、和作為診斷試劑與治療藥物。因而將芋螺毒液稱之為“海洋藥物寶庫”，它們是一種近乎無限的藥物資源。芋螺毒素是當(dāng)今海洋藥物研究和開發(fā)的熱點，備受世界藥學(xué)界的關(guān)注。芋螺毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，生物活性強，作用靶位的選擇性高，已成為藥理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)的有力工具和新藥開發(fā)的新來源。食蟲芋螺毒素對多種蠕蟲有選擇性的麻痹和致死作用，在多肽殺蟲劑開發(fā)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。生活在熱帶海洋中的芋螺在我國僅存在于南海，是海南特有的藥用海洋生物資源。
根據(jù)芋螺毒素作用于生物體內(nèi)的不同靶位可分為3類(1)作用于配體門控離子通道的CTX，包括煙堿受體、5HT3受體、NMDA受體。配體門控通道又稱化學(xué)門控通道或遞質(zhì)依賴性通道，后者按相應(yīng)的受體命名。(2)作用于電壓門控離子通道的CTX，電壓門控離子通道又稱電壓敏感性通道，常以通透離子(如Na+，K+，Ca2+等)命名。(3)作用于其他受體的CTX，CTX除了作用于離子通道以外，還有以G-蛋白為靶標(biāo)的，如芋螺加壓素和芋螺惰性素，以及2種磷脂(conodipine M和PLA2)，它們基本上不含有二硫鍵。按其作用的受體靶可將芋螺毒素分為α、ω、μ、δ等多種亞型。根據(jù)芋螺毒素基因及其前體蛋白信號肽的保守性，可將芋螺毒素分為A、O、T、M、P、I等多個超家族。每個超家族根據(jù)受體靶類型，又可分為α、αA、κA(A-超家族)，ω、δ、κ、μO(O-超家族)，μ、ψ、KM(M-超家族)等家族(亞型)。
配體門控離子通道是介導(dǎo)快速突觸傳遞的膜結(jié)合蛋白，許多這類蛋白已被克隆，可根據(jù)其結(jié)構(gòu)與功能的相似性來分類，其中有一大類屬于同一基因家族，是由乙酰膽堿(acetylcholine)，血液中的復(fù)合胺(serotonin)，如5-羥色胺-3受體(5HT3)，γ-氨基丁酸(GABA)，氨基乙酸(glycine)激活的。有功能的通道蛋白復(fù)合體由5個亞基組成，每個亞基含有四個跨膜螺旋。除了其配體特異性外，在對通透離子選擇性上仍有區(qū)別。其他基因家族的配體門控離子通道是谷氨酸受體，通常可細分為NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸N-methyl-D-aspartate)受體和非NMDA受體(kainate/AMPA)。第三類配體門控離子通道是與某些神經(jīng)線連接遞質(zhì)相關(guān)的ATP受體。
在CTX中以配體門控離子通道為靶標(biāo)的有作用于n-AChR受體的α-CTX、αA-CTX和ψ-CTX，作用于5HT3受體的σ-CTX和作用于NMDA受體的conantokins。其中α-CTX(C C-C-C)、αA-CTX(CC-C-C-C-C)都屬于A超家族，具有不同的半胱氨酸模式。ψ-CTX(CC-C-C-CC)屬于M超家族。其中研究得最多的是α-CTX。α-CTX包括GI，GIA，等，它們在結(jié)構(gòu)上大體相似保守的半胱氨酸骨架、作用于肌肉類的n-AChR，一般含有13～15個氨基酸，主要來源于食魚芋螺，如地紋芋螺(C.geographus)，幻芋螺(C.magus)，線紋芋螺(C.striatus)等。PnIA和PnIB是αA-CTX類的CTX，來源于食軟體動物芋螺席芋螺(C.pennaceus)。而ImI是一種作用于n-AChR的ψ-CTX，來源于食蟲芋螺堂皇芋螺(C.imperialis)，它們同食魚芋螺中的α-CTX具有相同的半胱氨酸骨架，但序列模式不同，作用的靶標(biāo)為n-AChR的神經(jīng)元亞類。
不同的α-CTX對脊椎動物受體的親和性不同，有時相差幾個數(shù)量級。這種種系間的差異使得α-CTX可作為有用的探針用于研究脊椎動物n-AChR的種系發(fā)生，可作為分子探針來確定nAchR的不同亞型；α-CTX作為分子模型，設(shè)計新藥；作為研究神經(jīng)性疾病如帕金森氏病、行動障礙、精神分裂癥等的工具藥，探討發(fā)病機理。α-芋螺毒素還能結(jié)合和阻斷小細胞肺癌表面的nAchR，在小細胞肺癌的診斷和治療中有潛在應(yīng)用價值。食蟲α-CTX可開發(fā)為多肽殺蟲劑。
Fainzilber等研究過αA-PnIA和αA-PnIB，其特性不同于α-CTX，最大的不同是C端存在單一負電荷殘基。同其他的CTX相比，它對脊椎動物的骨骼肌n-AChR具有更大的選擇性。ψ-CTX也抑制n-AChR，不過它不阻滯α-銀環(huán)毒素(競爭性n-AChR拮抗劑)的結(jié)合點，證明ψ-CTX不與AChR結(jié)合。其原因可能是該毒素的二硫鍵連接與α-CTX或-αA CTX的不同，而與Na+通道起抑制作用的μ-CTX類似。
α-CTX特異性地作用于神經(jīng)末端的乙酰膽堿受體，大多數(shù)種類的芋螺毒管中存在α-CTX，估計在芋螺屬的毒液中至少有1000中不同的α-CTX。至今已發(fā)現(xiàn)和研究過的、或有臨床應(yīng)用價值的α-CTX僅十來種，不足百分之一。絕大多數(shù)α-CTX(99％以上)尚未被發(fā)現(xiàn)和研究。因此研究與開發(fā)新的α-CTX具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于的是從我國海南產(chǎn)的疣蒿芋螺(Conus lividus Hwass)、信號芋螺(Conus littertus Linnaeus)、織錦芋螺(C.textile Linnaeus)中分別發(fā)現(xiàn)的具有藥用功能的新型α-芋螺毒素(α-Conotoxin，α-CTX)肽。
因此，在一個方面，本發(fā)明提供了新的α-芋螺毒素(α-CTX)肽。
在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼該肽的多核苷酸。
本發(fā)明還提供了含有所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體，含有該核酸構(gòu)建體的表達載體，以及被所述核酸構(gòu)建體或表達載體轉(zhuǎn)化了的細胞。
本發(fā)明還提供了所述肽的人工合成制備方法。
本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，所述芋螺毒素肽對蟑螂、棉鈴蟲、煙青蟲、水稻螟蟲、甘蔗螟蟲等害蟲有致死作用，而將它們注射到小鼠體內(nèi)，未見異常反應(yīng)。因此，本發(fā)明的芋螺毒素可作為多肽殺蟲劑開發(fā)。其基因可用于轉(zhuǎn)化微生物(例如昆蟲桿狀病毒、大腸桿菌和酵母等)和植物，開發(fā)出新型生物農(nóng)藥，培育出抗蟲作物新品種。
本發(fā)明的芋螺毒素肽可通過結(jié)合乙酰膽堿受體(nAChR)發(fā)揮作用，具有鎮(zhèn)痛活性。它們是新藥開發(fā)的候選藥物和先導(dǎo)藥物。
因此，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明所述肽的藥物組合物或殺蟲劑組合物。
具體實施例方式
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了α-芋螺毒素肽，其包含選自下組的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-3中任一所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO4-6中任一所示的氨基酸序列；(3)與上述(1)或(2)所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或(4)因1-5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加而與上述(1)或(2)所示序列有所不同的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述芋螺毒素肽具有的氨基酸序列與SEQ ID NO1-6中任一氨基酸序列至少大約85％相同，更優(yōu)選至少大于90％相同，尤其優(yōu)選至少大約95％相同，最優(yōu)選至少大約97％相同(在本文中稱作“同源肽”)。
為了本發(fā)明的目的，兩個或更多個氨基酸序列之間的相同程度是通過BLAST2.0蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫查詢程序(Aaltschul等，1997，核酸研究253389-3402)并采用下列參數(shù)確定的blastall-p blastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查詢文檔]-d prot_all，其中-p指程序名稱，-a指將要用到的服務(wù)器數(shù)，-e指期望值，-E指延伸缺口的代價，-v指單線描述(one-line description)數(shù)，-b指將要顯示的比對數(shù)，-I指查詢文檔，-d指用于查詢的數(shù)據(jù)庫。
同源多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO1-6中任一氨基酸序列不同之處可能在于取代、插入、添加和/或缺失了1或多個、優(yōu)選1-5個、更優(yōu)選1-3個、尤其優(yōu)選1-2個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基。優(yōu)選地，氨基酸改變是性質(zhì)改變較小的變化，即是不會顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大約5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1個氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸殘基；有多達大約20-25個殘基的小連接肽；或可通過改變凈電荷或者其它功能而有助于純化的小延伸如多聚組氨酸片段、抗原表位或結(jié)合區(qū)。
保守性取代的例子是在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)內(nèi)進行的取代。通常不會改變特異活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白質(zhì)》一書，Academic Press，New York中描述過。最常見的替換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向進行的替換。
本發(fā)明還包括在本發(fā)明芋螺毒素肽的N-末端和/或C-末端融合了其它肽/多肽的融合多肽或可裂解的融合多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)已知，包括連接編碼本發(fā)明肽的編碼序列與編碼所述其它肽/多肽的編碼序列，使它們在同一讀框中，并且融合多肽的表達受控于相同的啟動子和終止子。
多核苷酸本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明所述肽的核酸序列的分離多核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，該多核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO1-6中任一所示氨基酸序列的多肽的核酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，該多核苷酸包含SEQ ID NO7-9中任一所示的核苷酸序列或者其中的相應(yīng)成熟肽編碼序列。本發(fā)明還包括編碼具有SEQ ID NO1-6中任一所示氨基酸序列的多肽的核酸序列，它與SEQ ID NO7-9中的相應(yīng)成熟肽編碼序列之間因遺傳密碼的簡并性而有所不同。本發(fā)明的核酸序列包括基因組序列，以及相應(yīng)的cDNA和RNA序列。此處所用術(shù)語“核酸序列”應(yīng)理解為包括合成DNA在內(nèi)的所有這類變種。
本發(fā)明還涉及編碼活性芋螺毒素肽、與SEQ ID NO7-9中任一序列的成熟肽編碼序列有一定同源性的核酸序列，同源程度至少約為70％、優(yōu)選約80％、更優(yōu)選約90％，還要優(yōu)選的是約95％，最優(yōu)選的是大約97％同源。就本發(fā)明目的而言，兩個核酸序列間的同源程度是通過Wilbur-Lipman方法(Wilbur & Lipman，1983，美國國家科學(xué)院學(xué)報80726-730)用LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)以及相同性表和以下多重對比參數(shù)缺口罰分和缺口長度罰分均為10確定的。成對對比參數(shù)為Ktuple＝3，缺口罰分＝3，窗口＝20。
合成與本發(fā)明所述多肽基本相似的多肽時，可能有必要對編碼本發(fā)明多肽的核酸序列進行修飾。術(shù)語與所述多肽“基本相似”是指非天然形式的多肽。這些多肽可能與從天然來源分離到的多肽在某些加工方式上不同。例如，可能希望用例如定點誘變來合成多肽的變體，這些變體有不同的熱穩(wěn)定性或最適pH等?？梢栽赟EQ ID NO7-9之成熟肽編碼部分的核酸序列基礎(chǔ)上構(gòu)建出類似序列；并/或通過引入核苷酸取代而構(gòu)建，所述取代不會使產(chǎn)生的氨基酸序列與原核酸序列編碼的多肽不同，但它們符合酶制備所用宿主生物對密碼子的使用習(xí)慣；或通過引入會產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代而構(gòu)建。關(guān)于核苷酸取代的綜述，參見例如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達和純化295-107。
本發(fā)明還涉及包含編碼活性芋螺毒素肽、與SEQ ID NO7-9中任一序列的成熟肽編碼序列或其互補序列可雜交的核酸序列的多核苷酸。關(guān)于多核苷酸之間的雜交，在現(xiàn)有技術(shù)中有眾多的文獻可供參考，包括例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室，冷泉港，1989。雜交中可以應(yīng)用各種程度的嚴(yán)謹條件，例如中度、中度-高度，或者高度嚴(yán)謹條件。越嚴(yán)謹?shù)臈l件，形成雙螺旋要求的互補程度越高。可以通過溫度、探針濃度、探針長度、離子強度、時間等等控制嚴(yán)謹程度。對于雙鏈DNA基因探針，雜交于低于DNA雜合體熔解溫度[melting temperature，Tm])20-25℃下在6X SSPE、5XDenhardt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中進行過夜。清洗通常如下進行于Tm-20℃在0.2X SSPE、0.1％SDS中一次15分鐘(中度嚴(yán)謹條件清洗)。
對于寡核苷酸探針，雜交于低于雜合體的熔解溫度Tm 10-20℃下在6X SSPE、5X Denhardt氏溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml變性DNA中進行過夜。清洗通常如下進行于雜交溫度在1X SSPE、0.1％SDS中一次15分鐘(中度嚴(yán)謹條件清洗)核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明所述核酸序列及與之可操作連接的1或多個調(diào)控序列的核酸構(gòu)建體，所述調(diào)控序列在其相容條件下能指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細胞中進行表達。表達應(yīng)理解為包括多肽生產(chǎn)中所涉及的任何步驟，包括，但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
“核酸構(gòu)建體”在文中定義為單鏈或雙鏈核酸分子，它們分離自天然基因，或者經(jīng)修飾而含有以非天然方式組合和并列的核酸片段。當(dāng)核酸構(gòu)建體包含表達本發(fā)明所述編碼序列必需的所有調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與表達盒同義。術(shù)語“編碼序列”在文中定義為核酸序列中直接確定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的部分。編碼序列的邊界通常是由緊鄰mRNA 5’端開放讀碼框上游的核糖體結(jié)合位點(對于原核細胞)和緊鄰mRNA 3’端開放讀碼框下游的轉(zhuǎn)錄終止序列確定。編碼序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
可以以多種方式操作編碼本發(fā)明所述肽的分離的核酸序列，使其表達所述肽。可能期望或必須在插入載體之前對核酸序列進行加工，這取決于表達載體。應(yīng)用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知。
本文中術(shù)語“控制序列”定義為包括表達本發(fā)明肽所必需或有利的所有組分。每個調(diào)控序列對于編碼多肽的核酸序列可以是天然含有的或外來的。這些調(diào)控序列包括，但不限于，前導(dǎo)序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，調(diào)控序列要包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。為了導(dǎo)入特定的限制位點以便將調(diào)控序列與編碼多肽的核酸序列的編碼區(qū)進行連接，可以提供帶接頭的調(diào)控序列。術(shù)語“可操作連接”在文中定義為這樣一種構(gòu)象，其中調(diào)控序列位于相對DNA序列之編碼序列的適當(dāng)位置，以使調(diào)控序列指導(dǎo)多肽的表達。
調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列，即可被表達核酸序列的宿主細胞識別的核酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選宿主細胞中有轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，可以得自編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。
調(diào)控序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止序列，即能被宿主細胞識別從而終止轉(zhuǎn)錄的一段序列。終止序列可操作連接在編碼多肽的核酸序列的3’末端。在所選宿主細胞中可發(fā)揮功能的任何終止子都可以用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，即對宿主細胞的翻譯十分重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作連接于編碼多肽的核酸序列的5’末端。在所選宿主細胞中可發(fā)揮功能的任何前導(dǎo)序列均可用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是信號肽編碼區(qū)，該區(qū)編碼一段連在多肽氨基端的氨基酸序列，能引導(dǎo)編碼多肽進入細胞分泌途徑。核酸序列編碼區(qū)的5’端可能天然含有翻譯讀框一致地與分泌多肽的編碼區(qū)片段自然連接的信號肽編碼區(qū)?；蛘撸幋a區(qū)的5’端可含有對編碼序列是外來的信號肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列在正常情況下不含有信號肽編碼區(qū)時，可能需要添加外來信號肽編碼區(qū)?；蛘?，可以用外來的信號肽編碼區(qū)簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以增強多肽分泌。但是，任何能引導(dǎo)表達后的多肽進入所用宿主細胞的分泌途徑的信號肽編碼區(qū)都可以用于本發(fā)明。
調(diào)控序列還可以是肽原編碼區(qū)，該區(qū)編碼位于多肽氨基末端的一段氨基酸序列。所得多肽被稱為酶原或多肽原。多肽原通常沒有活性，可以通過催化或自我催化而從多肽原切割肽原而轉(zhuǎn)化為成熟的活性多肽。
在多肽的氨基末端即有信號肽又有肽原區(qū)時，肽原區(qū)緊鄰多肽的氨基末端，而信號肽區(qū)則緊鄰肽原區(qū)的氨基末端。
添加能根據(jù)宿主細胞的生長情況來調(diào)節(jié)多肽表達的調(diào)控序列可能也是需要的。調(diào)控系統(tǒng)的例子是那些能對化學(xué)或物理刺激物(包括在有調(diào)控化合物的情況下)作出反應(yīng)，從而開放或關(guān)閉基因表達的系統(tǒng)。調(diào)控序列的其他例子是那些能使基因擴增的調(diào)控序列。在這些例子中，應(yīng)將編碼多肽的核酸序列與調(diào)控序列可操作連接在一起。
表達載體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸序列、啟動子和轉(zhuǎn)錄及翻譯終止信號的重組表達載體。可以將上述各種核酸和調(diào)控序列連接在一起來制備重組表達載體，該載體可以包括1或多個方便的限制位點，以便在這些位點插入或取代編碼多肽的核酸序列?；蛘撸梢酝ㄟ^將核酸序列或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適當(dāng)表達載體而表達本發(fā)明所述核酸序列。制備表達載體時，可使編碼序列位于載體中以便與適當(dāng)?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作連接。
重組表達載體可以是任何便于進行重組DNA操作并表達核酸序列的載體(例如質(zhì)粒或病毒)。載體的選擇通常取決于載體與它將要導(dǎo)入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒。
載體可以是自主復(fù)制型載體(即存在于染色體外的完整結(jié)構(gòu)，可獨立于染色體進行復(fù)制)，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保證自我復(fù)制的任何機制?；蛘?，載體是一個當(dāng)導(dǎo)入宿主細胞時，將整合到基因組中并與所整合到的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可應(yīng)用單個載體或質(zhì)粒，或總體包含將導(dǎo)入宿主細胞基因組的全部DNA的兩個或多個載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。
優(yōu)選本發(fā)明所述載體含有1或多個便于選擇轉(zhuǎn)化細胞的選擇標(biāo)記。選擇標(biāo)記是這樣一個基因，其產(chǎn)物賦予對殺生物劑或病毒的抗性、對重金屬的抗性，或賦予營養(yǎng)缺陷體原養(yǎng)型等。細菌選擇標(biāo)記的例子如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素的抗性標(biāo)記。
優(yōu)選本發(fā)明所述載體包含能使載體穩(wěn)定整合到宿主細胞基因組中，或保證載體在細胞中獨立于細胞基因組而進行自主復(fù)制的元件。
就進行自主復(fù)制的情況而言，載體還可以包含復(fù)制起點，使載體能在目標(biāo)宿主細胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以帶有使其在宿主細胞中成為溫度敏感型的突變(參見例如，fEhrlich，1978，美國國家科學(xué)院學(xué)報751433)。
可以向宿主細胞插入1個以上拷貝的本發(fā)明核酸序列以提高該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。該核酸序列的拷貝數(shù)增加可以通過將該序列的至少1個附加拷貝插入宿主細胞基因組中，或者與該核酸序列一起插入一個可擴增的選擇標(biāo)記，通過在有合適選擇試劑存在下培養(yǎng)細胞，挑選出含有擴增拷貝的選擇性標(biāo)記基因、從而含有附加拷貝核酸序列的細胞。
用于連接上述各元件來構(gòu)建本發(fā)明所述重組表達載體的操作是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989)。
宿主細胞本發(fā)明還涉及包含可用來重組生產(chǎn)多肽的本發(fā)明所述核酸序列的重組宿主細胞?？蓪景l(fā)明之核酸序列的載體導(dǎo)入宿主細胞，從而使該載體以上述染色體整合體或自我復(fù)制的染色體外載體形式得以維持。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋任何由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細胞不同的后代。宿主細胞的選擇很大程度上取決于多肽編碼基因及其來源。
宿主細胞可以是原核細胞或者真核細胞，例如細菌或酵母細胞?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)將載體導(dǎo)入宿主細胞。
制備方法本發(fā)明還涉及重組制備本發(fā)明肽的方法，該方法包括(a)在適于產(chǎn)生所述肽的條件下，培養(yǎng)含有核酸構(gòu)建體的宿主細胞，該核酸構(gòu)建體包含編碼所述肽的核酸序列；和(b)回收該肽。
在本發(fā)明所述制備方法中，用本領(lǐng)域已知方法在合適多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。例如，可以在合適的培養(yǎng)基中，在允許多肽表達和/或分離的條件下，通過搖瓶培養(yǎng)、實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、分批加料或固態(tài)發(fā)酵)來培養(yǎng)細胞。在包含碳和氮源以及無機鹽的合適的培養(yǎng)基中，采用本領(lǐng)域已知的步驟進行培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可由供應(yīng)商提供或者可以參照公開的組成(例如，美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述)來制備。如果多肽被分泌到培養(yǎng)基中，則可以直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，可以從細胞裂解物中回收。
可以用本領(lǐng)域已知方法回收所產(chǎn)生的多肽。例如，可以通過常規(guī)操作(包括，但不限于離心、過濾、抽提、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀)從培養(yǎng)基中回收多肽。
可以通過各種本領(lǐng)域已知的操作來純化本發(fā)明所述多肽，這些操作包括，但不限于層析(例如，離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、層析聚焦、和大小排阻層析)、電泳(例如，制備性等電點聚焦)、差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或抽提(參見例如，蛋白質(zhì)純化，J.C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。
轉(zhuǎn)基因動物和植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化了本發(fā)明的核酸序列的動物或植物細胞，優(yōu)選小麥、玉米、水稻、大豆等植物細胞，賦予被轉(zhuǎn)化宿主新的性狀(如抗蟲性)。這可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)，用此處公開的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化動物或植物細胞而實現(xiàn)。
用于控制害蟲的方法和制劑可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的多種方法，使用本發(fā)明的芋螺毒素肽或多核苷酸來實現(xiàn)控制害蟲。這些方法包括例如將重組微生物應(yīng)用于害蟲(或它們的所在地)、和用編碼本發(fā)明的芋螺毒素肽的基因轉(zhuǎn)化植物。轉(zhuǎn)化可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)進行。此處公開了用于這些轉(zhuǎn)化的必要物質(zhì)，或者熟練的技術(shù)人員可以通過其它方法容易的獲得。
可以將配制的含有芋螺毒素肽、或包含本發(fā)明所述多核苷酸的重組微生物的制劑應(yīng)用于土壤。還可以將配制的產(chǎn)品作為種子覆料或根部處理或作物生長周期晚期的完整植株處理應(yīng)用。制劑可以包括擴散-增稠佐劑、穩(wěn)定劑、其它殺蟲添加劑、或表面活性劑。液體制劑可以是基于水的或非水的，并以泡沫、凝膠、懸浮液、可乳化濃縮物等等形式使用。成分可以包括流變劑、表面活性劑、乳化劑、分散劑、或聚合物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，殺蟲劑濃度將由于特殊制劑的本性廣泛變化，特別是可作為濃縮物或直接使用。殺蟲劑將以至少1％(重量計)存在，而且可能是100％(重量計)。干燥制劑通常有大約1-95％(重量計)的殺蟲劑，而液體制劑將通常是液相中固體重量大約1-60％。含有細胞的制劑將通常含有大約102-大約104個細胞/mg。這些制劑將以每公頃大約50mg(液體的或干的)-1kg或更多的量使用。通過噴、撒、灑、等等，可以將制劑應(yīng)用于害蟲環(huán)境，例如土壤和植物。
藥物組合物本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明肽和藥學(xué)可接受載體和/或賦形劑的藥物組合物。所述藥物組合物可用于緩解或治療與缺血性損傷有關(guān)的疾病或病癥。在一個實施方案中，含有治療有效量的本發(fā)明肽的藥物組合物以利于藥用的方式配制和給藥，并需考慮到個體病人的臨床狀況、運送位點、給藥方法、給藥日程安排和醫(yī)生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由這些方面的考慮決定。
含治療有效量的本發(fā)明多肽的藥物組合物可口服、非腸道給藥、腦池內(nèi)給藥等?！八帉W(xué)可接受載體”指無毒的固體、半固體或液體填充物、稀釋液、膠囊材料或任何類型的配方輔助物。本文所用術(shù)語“非腸道的”表示的給藥方式包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。本發(fā)明多肽還可通過緩釋系統(tǒng)恰當(dāng)?shù)亟o藥。
還可應(yīng)用本發(fā)明的芋螺毒素肽或基因作為有用的探針來用于研究動物nAChR的種系發(fā)生；作為分子探針來確定nAchR的不同亞型；作為分子模型，設(shè)計新藥；作為研究神經(jīng)性疾病如帕金森氏病、行動障礙、精神分裂癥等的工具藥；治療小細胞肺癌的侯選藥物；作為多肽殺蟲劑，開發(fā)為新型生物農(nóng)藥等。
下面參考實施例對本發(fā)明作進一步說明。給出這些實施例只是為了舉例說明，它們不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1芋螺毒素基因的克隆1芋螺總RNA的提取以從海南島、西沙群島等沿海采集的疣蒿芋螺(Conus lividusHwass)、信號芋螺(Conus littertus Linnaeus)、和織錦芋螺(C.textileLinnaeus)活體為材料。用小量柱離心式組織/細胞總RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)，或用Total RNA Isolation System試劑盒(Promega)，按操作手冊提取總RNA。下面以上海華舜產(chǎn)的RNA抽提試劑盒為例。
先把芋螺毒腺或毒管用液氮冷凍并研成粉末，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中。樣品中加500μL TCL液(RNA裂解液，上海華舜)，混勻后12000rpm離心3分鐘→轉(zhuǎn)移上清并向上清液中加入250μL 75％的乙醇徹底混勻→移入RNA吸附柱中，10000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→加500μL RP液(去蛋白液)，10000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→加500μL W3液(洗滌液)，10000rpm離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱移入同一收集管中→同法用W3液洗兩次→10000rpm離心1分鐘→將吸附柱移入另外一個干凈的1.5mL離心管中→在吸附膜中央加入50ul純水溶解RNA，室溫凈置1分鐘→10000rpm離心1分鐘→將1.5mL離心管放-70℃保存。
2cDNA的合成采用AMV Transcriptase試劑盒(Invitrtogen)，以步驟1提取的總RNA為模板，Oligo(dT)15為引物，合成cDNA。
合成cDNA的反應(yīng)成分為0.5ug Oligo(dT)15，2ug總RNA，1×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，1mM dNTP，20U重組RNA酶抑制劑核糖核酸酶抑制劑(Recombinant Rnasin Ribonuclease Inbibitor)，25U AMV反轉(zhuǎn)錄酶，重蒸水。反應(yīng)總體積為20uL。反應(yīng)程序先將總RNA在70℃溫育10分鐘，再加入其他反應(yīng)成分；于42℃溫育1小時，95℃終止反應(yīng)5分鐘；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放-20℃保存。取5ul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行1％瓊脂糖電泳檢測。
3反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(RT-PCR)以步驟2合成的cDNA為模板，根據(jù)A-超家族芋螺毒素信號肽區(qū)域保守區(qū)和3’非翻譯區(qū)序列(J.Michael McIntosh，Cheryl Dowell et al.α-Conotoxin GIC from Conus geographus，a Novel Peptide Antagonist of NicotinicAcetylcholine Receptors.J.Biol.Chem.，2002，277，(37)33610-33615.Michael Ellison，J.Michael McIntosh，and Baldomero M.Olivera.α-ConotoxinsImI and ImII SIMILAR alpha7 NICOTINIC RECEPTOR ANTAGONISTS ACT AT DIFFERENTSITES.J.Biol.Chem.，2003，278(2)757-764.)，設(shè)計α-CTX引物(上游引物5’TCT G ATG GCA GGA ATG ACG CAG 3’(SEQ ID NO10)，下游引物5’TCG TGG TTC AGA GGG TCC TGG 3’(SEQ ID NO11))，進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)總體積為25ul，包括cDNA模板50ng，10×PCR buffer，200uM dNTPs，1umol上下游引物，2mM MgCl2，1UTaq酶和去離子水。循環(huán)程序94℃預(yù)變性3分鐘，94℃變性30秒，50℃(55℃)退火30秒，72℃延伸30秒，35個循環(huán)后，72℃再延伸2分鐘。PCR擴增產(chǎn)物取5ul點樣，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。
4PCR產(chǎn)物的克隆與測序回收上述特異PCR產(chǎn)物，與T-easy載體(Promega)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1菌株，利用藍白菌落和氨芐青霉素抗性挑選重組子，抽提純化重組子質(zhì)粒用于測序分析。經(jīng)序列分析比較，獲得了本發(fā)明的三種新型α-CTX前體基因LiC22N(SEQ ID NO7)、LeD2N(SEQ IDNO8)和TeA21N(SEQ ID NO9)。
根據(jù)前體基因及芋螺毒素特點，推測出芋螺毒素前肽LiC22P、LeD2P和TeA21P，它們分別具有SEQ ID NO4、5和6所示的氨基酸序列；根據(jù)前肽序列再推測出成熟肽LC22M、LeD2M和TeA21M，它們分別具有SEQ ID NO1、2和3所示的氨基酸序列。三種基因的核酸序列、所編碼的前體肽和相應(yīng)的成熟肽的氨基酸序列如下LC22N(α-CTX基因，148bp，來自疣蒿芋螺(Conus lividus Hwass，Livid Cone))TCTGATGGCAGGAATGACGCAGCCAACGACAAAGCGTCTAAACTGATGGTTCTTAGGAACGAATGCTGTGACAATCCTCCGTGCAAGTCGAGTAATCCAGATTTGTGTGACTGGAGAAGCTGATGCTCCAGGACCCTCTGAACCACGA(SEQ ID NO7)。
由LiC22N編碼的前肽LiC22P由40個氨基酸組成，序列為SDGRNDAANDKASKLMVLRNECCDNPPCKSSNPDLCDWRS(SEQ ID NO4)。
由前肽LiC22P經(jīng)加工產(chǎn)生的成熟肽LiC22M由21個氨基酸組成，序列為NECCDNPPCKSSNPDLCDWRS(SEQ ID NO1)。LeD2N(α-CTX基因，151bp，來自信號芋螺(Conus litteratusLinnaeus，Lettered Cone))TCTGATGGCAGGAATGACGCAGCCAGCAACAAAGCGTCTCACCTGATCGCCCTGGCCGTCAGGGGATGCTGTGCCCGTGCTGCCTGTGCCGGGATTCATCAAGAACTTTGTGGAGGAGGACGCTGATGCTCCAGGACCCTCTGAACCACGA(SEQ ID NO8)。
由LeD2N編碼的前肽(LeD2P)由41氨基酸組成，序列為SDGRNDAASNKASHLIALAVRGCCARAACAGIHQELCGGGR(SEQ ID NO5)。
由前肽LeD2P經(jīng)加工產(chǎn)生的成熟肽LeD2M由16個氨基酸組成，序列為GCCARAACAGIHQELC#(SEQ ID NO2，#代表該毒素羧基端被酰胺化)。
TeA21N(α-CTX基因，151bp，來自織錦芋螺(C.textile Linnaeus，Textile Cone))TCTGATGGCAGGAATGACGCAGCCAAAGCGTCTGGCCTGGTCAGTCTGACTGACAGGAGACCAGAATGCTGTAGTGATCCTCGCTGTAACTCGAGTCATCCAGAACTTTGTGGTTGACGACGCTGATGCTCCAGGACCCTCTGAACCACGA(SEQ ID NO9)。
由TeA21N編碼的前肽(TeA21P)由38個氨基酸組成，序列為SDGRNDAAKASGLVSLTDRRPECCSDPRCNSSHPELCG(SEQID NO6)。
由前肽TeA21P經(jīng)加工產(chǎn)生的成熟肽TeA21M由17個氨基酸組成，序列為PECCSDPRCNSSHPELC#(SEQ ID NO3，#代表該毒素羧基端被酰胺化)。
實施例2芋螺毒素LC22M、LeD2M的合成根據(jù)芋螺毒素成熟肽LC22M、LeD2M的氨基酸序列，采用Fmoc方法人工合成了這兩種多肽。具體方法如下。
采用固相合成法中的Fmoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成儀上合成了LC22M、LeD2M兩條芋螺毒素肽。Fmoc氨基酸的側(cè)鏈保護基為Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)，OBut(Asp)，Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法，Rink樹脂及Fmoc氨基酸，合成步驟參考儀器合成手冊進行。為反應(yīng)完全，在哌啶脫保護及偶合時間上分別適當(dāng)延長，對難接氨基酸采用雙偶合。回收線性肽粗品，用250*4.6mm，Hypersil ODS-2柱純化，線性肽純度達85％以上，并通過質(zhì)譜(MS)鑒定。LC22M的分子量為2382.59；LeD2M的分子量為1604.90。凍干后用于折疊。
實施例3芋螺毒素LC22M、LeD2M線性肽氧化折疊10μM充分還原的LC22M、LeD2M線性肽，在折疊緩沖液(100mM NH4HCO3(pH 8.0)，23-25℃)中攪拌折疊24-48h.經(jīng)氧化折疊的肽再用液相層析(Bio-Rad)系統(tǒng)純化。
實施例4LiC22M抗蟲活性的測試。
參照Xiu-hong Wang，Ross Smith et al，Structure-functionstudies of ω-atracotoxin，a potent antagonist of insect voltage-gatedcalcium channels.Eur.J.Biochem.264，488-494(1999)的方法，測試LiC22M的抗蟲活性.將LiC22M以不同的濃度注射到蟑螂(Periplaneta americana)、棉鈴蟲(Heliothis armigera Huber)、煙青蟲(Heliothis assulta Guenee)、水稻螟蟲(三化螟，Tryporyza incertulas(Walker)，)、甘蔗螟蟲(Chilo infuscatellus Snellen)的幼蟲(體重50-180mg)體內(nèi)，觀察48h內(nèi)蟲體的反應(yīng)情況。每只昆蟲用微量注射器注射5μL到腹部中央，注射前蟲體暫時置冰上防止昆蟲運動。對照同時注射5μL蒸餾水(ddH2O)或5μL昆蟲生理鹽水.LiC22M毒素用昆蟲生理鹽水(200mM NaCl，3.1mM KCl，5.4mM CaCl2，5mM MgCl2，2mM NaHCO3，0.1mM NaH2PO4，pH 7.2)配制。毒素濃度為10-103pmol(每克體重)。每組10只昆蟲，記錄注射后48h內(nèi)的死亡率。計算害蟲半致死劑量LD50。
計算公式為y＝(a-b)LD50/xLD50＝xy/(a-b)y是注射后48h樣本群體的死亡百分率，x是中毒劑量(pmol·g-1)，a是最大反應(yīng)劑量，b是最小反應(yīng)劑量。LD50是害蟲半致死劑量。
結(jié)果表明，LiC22M對上述害蟲的半致死劑量LD50較相似，分別為LD50蟑螂95±10pmol·g-1、LD50棉鈴蟲86±8pmol·g-1、LD50煙青蟲76±6pmol·g-1、LD50水稻螟蟲92±9pmol·g-1、LD50甘蔗螟蟲82±7pmol·g-1。當(dāng)LiC22濃度達到200pmol·g-1時，所試?yán)ハx死亡率為100％，而對照組死亡率不到5％，個別對照死亡多因注射操作引起。因此LiC22M對所試?yán)ハx均有很強的致死作用。

實施例5測試LeD2M的鎮(zhèn)痛活性利用小鼠熱板試驗測定LeD2M的鎮(zhèn)痛活性.
測試用昆明小鼠體重為(20g±3g)。小鼠采用側(cè)腦室給藥，每只注射20μL含不同毒素濃度的LeD2M鹽溶液(150mM NaCl)，用熱板法測量小鼠腳部受熱鎮(zhèn)痛后舔后足或抬后足并回頭時間為痛閾時間，60s為100％鎮(zhèn)痛。設(shè)4個劑量濃度0、5、10、20ng/只，每劑量5只小鼠。結(jié)果表明LeD2M劑量大于10ng/只，鎮(zhèn)痛活性(熱板法)大于60s，且作用4h以上。表明鎮(zhèn)痛活性強大。
上述實施例只是為了闡明、而不是限制本發(fā)明。相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚地知道，可對本文所述的內(nèi)容作其它適當(dāng)?shù)男揎椇妥兓⒖稍诒景l(fā)明或其任何實施方案的范圍內(nèi)進行這種修飾和變化。這樣的修飾和變化都落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種芋螺毒素肽，其包含選自下組的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-3中任一所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO4-6中任一所示的氨基酸序列；(3)與上述(1)或(2)所示氨基酸序列至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、尤其優(yōu)選至少95％、最優(yōu)選至少97％相同的氨基酸序列；或(4)因1-5個、優(yōu)選1-3個、更優(yōu)選1-2個、最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失、插入和/或添加而與上述(1)或(2)所示序列有所不同的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的芋螺毒素肽，其具有選自下組的氨基酸序列(1)SEQ ID NO1-3中任一所示的氨基酸序列；或(2)SEQ ID NO4-6中任一所示的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求1或2所述芋螺毒素肽的多核苷酸。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，其包含選自下組的核苷酸序列(1)編碼SEQ ID NO1-3任一所示氨基酸序列的核苷酸序列；(2)編碼SEQ ID NO4-6任一所述氨基酸序列的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO7-9中任一所示的核苷酸序列；(4)SEQ ID NO7-9中任一所包含的相應(yīng)成熟肽編碼序列；或(5)在嚴(yán)謹條件下可與上述(1)、(2)、(3)或(4)所述核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
5.一種核酸構(gòu)建體，其中包含權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸，以及與之可操作連接、可指導(dǎo)多肽在適當(dāng)表達宿主中生產(chǎn)的一個或多個控制序列。
6.一種表達載體，其中包含權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建體。
7.一種轉(zhuǎn)化的細胞，其中轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體或權(quán)利要求6的表達載體。
8.權(quán)利要求7的細胞，它是原核細胞例如細菌細胞，或真核細胞例如酵母細胞，或植物細胞，例如小麥、玉米、水稻或大豆細胞。
9.一種藥物組合物，其中包含藥學(xué)有效量的權(quán)利要求1或2所述芋螺毒素肽以及藥學(xué)上可接受的載體。
10.一種殺蟲劑組合物，其中包含殺蟲有效量的權(quán)利要求1或2所述芋螺毒素肽以及任選的載體。
11.一種融合蛋白，其中包含權(quán)利要求1或2的芋螺毒素肽以及與之相融合的其它氨基酸序列。
12.一種殺滅害蟲的方法，包括對含有所述害蟲的位點使用權(quán)利要求10的殺蟲劑組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的α－芋螺毒素肽(α－CTX)，編碼所述肽的多核苷酸，含有該多核苷酸的構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化細胞，以及重組生產(chǎn)所述肽的方法。本發(fā)明還涉及所述芋螺毒素肽的人工合成和用途。
文檔編號C12N15/64GK1796414SQ20041010356
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日
發(fā)明者羅素蘭, 長孫東亭, 張本, 權(quán)婭茹 申請人:海南大學(xué)