一種開花提前的轉(zhuǎn)基因植物的培育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種開花提前的轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，屬于分子生物學技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] MicroRNAs(miRNAs)是一種基本的、具有序列特異性的真核基因組的調(diào)節(jié)因子，通 常在轉(zhuǎn)錄水平或者轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)其靶基因的表達。成熟的miRNAs是一系列小的非編碼單 鏈小分子RNA，在動物中，它通常由20-22核苷酸組成，而在植物中通常是20-24個核苷酸大 小。MicroRNAsUiRNAs)在植物的生長發(fā)育以及植物對環(huán)境的適應(yīng)方面發(fā)揮了重要的作用， 成為近幾年研究的熱點。
[0003] miR172最早在擬南芥中通過小RNA測序獲得的，由于它極度保守，在多種植物中也 被相繼發(fā)現(xiàn)。之前的大多數(shù)研究顯示miR172通過抑制一系列AP2-like類轉(zhuǎn)錄因子參與植物 花器官的形成與開花時間調(diào)控。然而，到目前為止，對大豆miR172家族的研究相對較少，尚 沒有以大豆miRl72基因培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對以上問題，本發(fā)明提供了一種開花提前的轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，所采取的 技術(shù)方案如下：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種開花提前的轉(zhuǎn)基因植物的培育方法，該方法的步驟如 下：
[0006] 1)克隆待轉(zhuǎn)基因的如體序列，并構(gòu)建含有待轉(zhuǎn)基因如體序列序列的表達載體；
[0007] 2)將步驟1)構(gòu)建的表達載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，并利用所得農(nóng)桿菌侵染宿主植物；
[0008] 3)驗證步驟1)中前體序列對靶基因的降解位點，并篩選鑒定步驟2)中被侵染的宿 主植物，獲得轉(zhuǎn)基因陽性單株；
[0009] 4)通過表型驗證轉(zhuǎn)基因株系。
[0010] 優(yōu)選地，步驟1)所述前體序列，是含有大豆miRNA172a基因保守區(qū)域的序列，核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示;所述克隆所用引物的序列如SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示； 所述表達載體，還含有草丁膦抗性基因。
[0011] 優(yōu)選地，步驟1)所述表達載體，所用質(zhì)粒PCAMBIA3301。
[0012]優(yōu)選地，步驟2)所述農(nóng)桿菌，為農(nóng)桿菌EHA105;所述宿主植物，為擬南芥。
[0013] 優(yōu)選地，步驟3)所述靶基因為基因Glyma03g33470。
[0014] 更優(yōu)選地，所述驗證降解位點是驗證miRNA172a對祀基因Glyma03g33470的降解位 點，是提取侵染宿主植物的總RNA合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDN0.5和SEQID NO. 6所示的引物進行兩輪巢式PCR，并通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離，回收目的 DNA片段后，再將回收產(chǎn)物連接到pGM-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后進行測序鑒定。
[0 015 ]優(yōu)選地，所述測序鑒定，是分析確定降解位點是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5'-端第十和第^ 堿基之間。
[0016] 優(yōu)選地，所述靶基因，擴增靶基因所用引物的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8 所示。
[0017] 所述培育方法的具體步驟如下：
[0018] 1)以大豆基因組為模板，以如SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示的核苷酸序列為引 物，克隆如核苷酸序列如SEQIDN0.1所示含有大豆miRNA172a基因保守區(qū)域的序列，并利 用所得序列與草丁膦抗性基因、質(zhì)粒PCAMBIA3301構(gòu)建表達載體；
[0019] 2)將步驟1)構(gòu)建的表達載體導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EHA105中，再利用所得農(nóng)桿菌侵染擬南 芥，獲得侵染植物；
[0020] 3)提取步驟2)侵染植物中的總RNA并合成CDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDN0.5 和SEQIDNO.6所示的引物進行兩輪巢式PCR，并通過瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離， 回收目的DNA片段后，再將回收產(chǎn)物連接到pGM-T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后進行測序鑒定， 分析確定所轉(zhuǎn)序列對祀基因Glyma03g33470的降解位點是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5'-端第十和第^^一堿基之間，鑒定后通過草丁膦抗性篩選，PCR定量鑒 定，獲得轉(zhuǎn)基因陽性單株；
[0021] 4)通過與野生型對比驗證步驟3)所得轉(zhuǎn)基因陽性單株的開花時間是否提前，獲得 轉(zhuǎn)基因株系。
[0022] 以上所述培育方法在作物育種中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
[0023]本發(fā)明獲得的有益效果是：
[0024] 本發(fā)明從大豆全基因組中克隆出miRNA172a(gma-miRNA172a)基因，并通過構(gòu)建表 達載體將該基因轉(zhuǎn)到擬南芥中成功獲得轉(zhuǎn)基因純化植株及相應(yīng)表型，該基因能夠有效提前 擬南芥的開花時間。
[0025]利用本發(fā)明所提供的培育方法能夠培育出具有大豆miRNA172a基因的開花提前的 擬南芥植株系。利用本發(fā)明所提供方法培育出的轉(zhuǎn)基因植株，其長、短日照條件下開花時間 比對照組分別提前了 4和9天。本發(fā)明所提供的方法一方面驗證了大豆miRNA172a基因的促 進提前開花的作用，同時，本發(fā)明確定了大豆miRNA172a基因在大豆體內(nèi)的靶基因。
【附圖說明】
[0026]圖1為利用DNAman軟件對大豆miR172家族成員的前體序列進行比對的結(jié)果。
[0027] 圖2不同的生長天數(shù)、組織、光周期條件下的gma_miR172a和革E1基因Glyma03g33470 的表達情況；
[0028](其中，A為不同生長天數(shù)下不同miRNA172基因及靶基因Glyma03g33470的表達情 況;B為基因gma-miR172a和靶基因Glyma03g33470在植株不同部位的表達情況；C為大豆 miR172a的晝夜節(jié)律表達;D為大豆Glyma03g33470的晝夜節(jié)律表達）。
[0029] 圖3利用5'RACE實驗探索大豆miR172a對靶基因Glyma03g33470降解位點的位置。
[0030]圖4為轉(zhuǎn)基因植株的篩選鑒定結(jié)果；
[0031] (其中，A為T2代轉(zhuǎn)基因植物中目的基因的PCR鑒定，其中M:DL2000plusDNA分子量 標準；1-20 :PPT抗性干涉擬南芥；21:野生型擬南芥；22 :水；23 :陽性質(zhì)粒；B為抽提gma-miR172a轉(zhuǎn)基因T3代植株RNA)。
[0032]圖5以大豆miRNA172a的轉(zhuǎn)基因擬南芥為實驗組，野生型為對照組，比較轉(zhuǎn)基因T3 代在長、短日照條件下的開花情況；
[0033](其中，A為不同日照條件下轉(zhuǎn)基因植株的生長情況;B為不同日照條件下轉(zhuǎn)基因植 株與對照植株的葉片生長情況;C為不同日照條件下轉(zhuǎn)基因植株與對照植株的開花情況）。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明不受實施例的限制。
[0035]以下實施例中所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域中的常規(guī) 材料、試劑、儀器和方法，均可通過商業(yè)渠道獲得。
[0036] 實施例1大豆miRNA172a的克隆與表達載體構(gòu)建
[0037] 1.根據(jù)已知miRNA172a基因序列的保守區(qū)域，設(shè)計大豆miRNA172a引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。對由組織抽提的大豆全基因組DNA進行特異性PCR擴增；
[0038] 2.常溫凝膠電泳分離產(chǎn)物，檢測到大小約159bp的條帶；
[0039] 3.回收條帶純化，再次用同一引物擴增后測序，結(jié)果如SEQIDN0.1。
[0040] 4.利用限制性內(nèi)切酶Bgin、BstEII雙酶切pCAMBIA3301質(zhì)粒和pGM-T-miR172a質(zhì) 粒，得到酶切片段；回收所得PCAMBIA3301酶切體系中的載體大片段和miR172a基因小片段， 利用T4DNA連接酶將miR172a基因替代原pCAMBIA3301質(zhì)粒上的GUS基因，構(gòu)建表達載體 pCAMBIA3301-miR172a;將得到的載體pCAMBIA3301-miR172a導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105,進行PCR檢 測和酶切鑒定，用檢測轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌侵染植物，得到轉(zhuǎn)基因植物。
[0041 ] 實施例2大豆miR172成員序列分析與比對
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