一種利用siRNA以植物為發(fā)生器的生物農(nóng)藥的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種利用siRNA以植物為發(fā)生器的生物農(nóng)藥。
【背景技術(shù)】
[0002] 小干擾核糖核酸（siRNA)是一類由20多個(gè)核苷酸組成的雙鏈RNA分子，可以通過(guò) 特異性降解革G基因的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA)起到沉默基因表達(dá)的作用，這一 過(guò)程被稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi)，在基因調(diào)控和生長(zhǎng)發(fā)育等方面發(fā)揮著重 要作用。
[0003] RNA干擾（RNAi)是一種抗病毒機(jī)制。它是由dsRNA介導(dǎo)的序列特異性的同源基因 的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，在細(xì)胞內(nèi)有效作用方式為siRNA。RNA干擾可以利用siRNA或siRNA 表達(dá)載體特異地沉默靶基因，此方式快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，且具有高度的序列專一性，可以獲得 功能喪失或減低突變序列特異方式剔除目的基因表達(dá)，成為探索基因功能的重要研究手 段。大量實(shí)驗(yàn)證明，RNAi現(xiàn)象廣泛存在于生物界中，是生物抵御病毒侵染和阻斷轉(zhuǎn)座子的 古老防御機(jī)制之一。隨著研究的不斷深入，RNAi的機(jī)制正在被逐步闡明，而同時(shí)作為功能 基因組和基因治療研究中的有效工具，RNAi也越來(lái)越為人們所重視。有研究表明，siRNA可 以成功敲出棉鈴蟲、小菜蛾和豌豆芽的部分抗藥基因，并且可以通過(guò)敲出昆蟲的乙酰膽堿 酯酶起到防止蟲害的作用，從而在害蟲防治中的起到與農(nóng)藥相當(dāng)?shù)淖饔谩?br>[0004] 目前，市場(chǎng)上的農(nóng)藥根據(jù)原料來(lái)源可分為有機(jī)農(nóng)藥、無(wú)機(jī)農(nóng)藥、植物性農(nóng)藥、微生 物農(nóng)藥。此外，還有昆蟲激素。根據(jù)加工劑型可分為粉劑、可濕性粉劑、可溶性粉劑、乳劑、 乳油、濃乳劑、乳膏、糊劑、膠體劑、熏煙劑、熏蒸劑、煙霧劑、油劑、顆粒劑和微粒劑等。大多 數(shù)是液體或固體，少數(shù)是氣體。農(nóng)藥流失到環(huán)境中，將造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，有時(shí)甚至造成 極其危險(xiǎn)的后果。
[0005] 傳統(tǒng)農(nóng)藥會(huì)有以下缺點(diǎn)：1.污染大氣、水環(huán)境，造成土壤板結(jié)。2.增強(qiáng)病菌、害蟲 對(duì)農(nóng)藥的抗藥性3.殺傷有益生物4.野生生物和畜禽中毒5.對(duì)人體健康的危害。為克服 上述缺點(diǎn)，高效、低毒、低殘留是農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。
[0006] 雖然研究人員針對(duì)RNA干擾用于防治蟲害已有初步研究，但目前該技術(shù)仍有一些 難以解決的問題限制其商業(yè)化發(fā)展。其中，如何遞送siRNA、如何對(duì)害蟲進(jìn)行大面積撲殺是 妨礙其應(yīng)用的主要原因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種用于制備生物農(nóng)藥的siRNA 表達(dá)載體和含有該載體的細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供一種生物農(nóng)藥。
[0009] 本發(fā)明的又一目的是提供該生物農(nóng)藥的制備方法。
[0010] 本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0011] -種生物農(nóng)藥，所述的生物農(nóng)藥以表達(dá)針對(duì)害蟲生命代謝關(guān)鍵基因的siRNA的植 物為原料。本發(fā)明中所述的siRNA是由轉(zhuǎn)基因植物所表達(dá)，被害蟲接觸或取食后會(huì)通過(guò) RNAi機(jī)制沉默其靶向的害蟲生命代謝關(guān)鍵基因。
[0012] 其中，"生命代謝關(guān)鍵基因"是指在害蟲生命代謝中起重要作用的基因，本發(fā)明生 物農(nóng)藥以表達(dá)針對(duì)害蟲生命代謝關(guān)鍵基因的siRNA的植物為原料。可用于本發(fā)明的針對(duì)害 蟲生命代謝關(guān)鍵基因沒有特別限制，通常包括消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)特異性毒害基因、經(jīng)過(guò) 表型篩選的影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育基因如昆蟲幾丁質(zhì)合成酶基因、蛻皮激素受體基因、谷胱甘 肽-s-轉(zhuǎn)移酶基因等。
[0013] 針對(duì)害蟲生命代謝關(guān)鍵基因包括鱗翅目、雙翅目或半翅目害蟲的乙酰膽堿酯酶基 因、AV2基因、GPCR基因、V-ATPase基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因，更優(yōu)選地，在 一實(shí)施例中包含針對(duì)害蟲生命代謝關(guān)鍵基因包括優(yōu)選鱗翅目、雙翅目或半翅目害蟲的乙酰 膽堿酯酶基因。
[0014] 所述的生物農(nóng)藥，優(yōu)選通過(guò)基因工程手段構(gòu)建表達(dá)高靶向害蟲生命代謝關(guān)鍵基因 的siRNA的轉(zhuǎn)基因植物，種植此種轉(zhuǎn)基因植物，將轉(zhuǎn)基因植物或其提取物用于制造生物農(nóng) 藥。
[0015] 所述的生物農(nóng)藥，進(jìn)一步優(yōu)選將所述的轉(zhuǎn)基因植物的葉片或其他器官制備成粉劑 作為生物農(nóng)藥；或者提取轉(zhuǎn)基因植物中所述的SiRNA表達(dá)產(chǎn)物作為生物農(nóng)藥。
[0016] 在本發(fā)明中，可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段將外源siRNA導(dǎo)入到載體，并在轉(zhuǎn)基因 植物中表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明的植物種類沒有特別限制，通常包括禾本科、香蒲科、菊科、唇 形科、百合科、石蒜科、紫草科、天南星科、傘形科、十字花科、報(bào)春花科、寥科、藜科、石竹科、 柳葉菜科、蕁麻科、車前草科、楊梅科、?？?、大麻科、虎耳草科、豆科、蕨科、堇菜科、銀齒萵 苣科、莧科、殼斗科、小球藻科、茶科、茜草科、梧桐科、松科、萌蘆科、大風(fēng)子科、羅漢松科、樺 木科、胡桃科、胡椒科、木蘭科、齒菌科、木耳科、口蘑科、傘菌科、紅燕科、杜鵲花科、薔薇科、 獼猴桃科、番杏科、葡萄科、番荔枝科、秋海棠科、鳳梨科、白花菜科、銀杏科、八角茴香科、姜 科、石榴科、毛茛科、夾竹桃科、小檗科、蕓香科、茄科、罌粟科、馬鞭草科、鹿蹄草科、鴨跖草 科、瑞香科、桑寄生科、蘿蘑科、三白草科、景天科、鱗始蕨科、馬齒莧科、澤瀉科、錦葵科、玄 參科、紫葳科、防已科、海金沙科、爵床科、旋花科、多孔菌科、無(wú)患子科、柏科、苦木科、大戟 科、楝科、使君子科、忍冬科、檉柳科、列當(dāng)科、燈心草科、金縷梅科、龍膽科、椴樹科、菖蒲科、 冬青科、車前科、漆樹科、五味子科、五加科、木棉科、馬兜鈴科、木犀科、棕櫚科、睡蓮科、檀 香科植物中的一種、或幾種的組合。
[0017] 優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物包括為生菜、水稻、小麥、玉米、花生、高粱、大豆、馬鈴薯、蕎 麥、藜、薊、胡椒、八角、茴香、桃、杏、梨、蘋果、香蕉、猴頭、木耳、山藥、山楂、人參、當(dāng)歸、番 茄、辣椒、茄子、胡蘿卜、甘藍(lán)、花椰菜、大白菜、小白菜、油菜、菠菜、芥菜、豌豆、南瓜、黃瓜、 西瓜、甜瓜、石刁柏、洋蔥、或其組合。
[0018] 更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物包括生菜、苜蓿、黑麥草、大豆或水稻。
[0019] 所述的生物農(nóng)藥，也可優(yōu)選將所述siRNA在同一株植物中與至少一種不同于該 siRNA革E1標(biāo)基因表達(dá)廣物的第二種殺蟲蛋白質(zhì)一起表達(dá)或者在不同的植物中進(jìn)彳丁表達(dá)后混 合作為生物農(nóng)藥的原料。
[0020] 其中，所述第二種殺蟲蛋白質(zhì)為Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀 粉酶或過(guò)氧化物酶。
[0021] 所述siRNA在同一株植物中與至少一種不同于該siRNA靶標(biāo)基因表達(dá)產(chǎn)物的第二 種殺蟲蛋白質(zhì)一起表達(dá)通過(guò)遺傳工程使植物包含并表達(dá)siRNA以及第二種殺蟲蛋白質(zhì)來(lái) 實(shí)現(xiàn)；或者通過(guò)利用遺傳工程操作使第1親本植物表達(dá)siRNA和第2親本植物表達(dá)第二種 殺蟲蛋白質(zhì)，再將第I親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第I親本和第2親本的所有基因 的后代植物。
[0022] -種用于制備生物農(nóng)藥的siRNA表達(dá)載體，將針對(duì)害蟲生命代謝關(guān)鍵基因的 siRNA的模板序列插入雙元表達(dá)載體所得；所述的針對(duì)害蟲生命代謝關(guān)鍵基因選自對(duì)害蟲 消化系統(tǒng)或神經(jīng)系統(tǒng)具有特異性毒害的基因、或經(jīng)過(guò)表型篩選的影響昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的基 因；優(yōu)選鱗翅目、雙翅目或半翅目害蟲的乙酰膽堿酯酶基因、AV2基因、GPCR基因、V-ATPase 基因、Cathespin基因、IAP基因、APN基因，優(yōu)選鱗翅目、雙翅目或半翅目害蟲的乙酰膽 堿酯酶基因；所述的雙元表達(dá)載體選自pcambial301，pcambial300，pcambia2300或選自 pcambia系列的其他載體。本發(fā)明所用雙元表達(dá)載體優(yōu)選地為pCAMBIA2301 (購(gòu)自北京鼎國(guó) 昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）
[0023] 所述的制備生物農(nóng)藥的siRNA表達(dá)載體，優(yōu)選將針對(duì)SEQ ID NO. 1所示的乙 酰膽堿酯酶靶基因設(shè)計(jì)的SEQ ID N0. 19所示的siRNA的模板序列插入雙元表達(dá)載體 PCAMBIA2301 所得。
[0024] 含有本發(fā)明所述的siRNA表達(dá)載體的細(xì)胞。
[0025] 本發(fā)明所述的siRNA表達(dá)載體、所述的含有所述siRNA表達(dá)載體的細(xì)胞在制備生 物農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0026] -種用于控制害蟲的方法，使侵襲這種植物的害蟲與所述的生物農(nóng)藥或含有所述 的生物農(nóng)藥的組合物接觸，從而控制害蟲對(duì)這種植物的侵襲。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"RNA干擾（RNA interference, RNAi) "是指一些RNA可以高效、特異地阻斷 體內(nèi)特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，其也稱為RNA 干預(yù)或者干涉。RNA干擾是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機(jī)制。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"干擾RNA"或"dsRNA"是指一種RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為其 目標(biāo)降解特定的mRNA,這個(gè)過(guò)程就是RNA干擾途徑（RNAinterferencepathway)。
[0029] 有益效果：
[0030] 本發(fā)明針對(duì)設(shè)計(jì)特意靶向害蟲生命代謝關(guān)鍵基因的siRNA，并創(chuàng)造性地將植物作 為siRNA載體生產(chǎn)生物農(nóng)藥。通過(guò)將高靶向害蟲的siRNA模板序列轉(zhuǎn)入植物中，使植物表達(dá) 相應(yīng)的目標(biāo)siRNA，大面積種植此種轉(zhuǎn)基因植物，將其提取物用于制造生物農(nóng)藥，此種農(nóng)藥 對(duì)環(huán)境無(wú)危害、從基因?qū)用嫔蠚绾οx，阻礙害蟲發(fā)育，殺死效率高，不容易造成害蟲抗性。
[0031] 作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，針對(duì)乙酰膽堿酯酶基因設(shè)計(jì)并篩選了多條可以靶向 性殺死害蟲的siRNA序列，將其導(dǎo)入植物進(jìn)行表達(dá)，粉碎后作為生物農(nóng)藥使用，對(duì)鱗翅目昆 蟲具有理想的致死作用。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1載體構(gòu)建流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1:構(gòu)建在植物中穩(wěn)定表達(dá)外源siRNA的質(zhì)粒載體的方法
[0034] 本實(shí)施例提供了目的基因的篩選、獲得及構(gòu)建含有目的基因核酸構(gòu)載體的具體方 法。通過(guò)篩選，獲得多條可以靶向性殺死害蟲的siRNA序列。
[0035] 以下為靶基因及相應(yīng)siRNA序列：
[0054] 各小干擾RNA殺蟲原理：
[0055] 小菜蛾乙酰膽堿酯酶基因：用于產(chǎn)生dsRNA的靶標(biāo)序列是以小菜蛾乙酰膽堿酯酶 基因，siRNA可以沉默乙酰膽堿酯酶基因1和2,從而影響昆蟲正常的神經(jīng)沖動(dòng)傳遞，使昆蟲 持續(xù)處于興奮狀態(tài)而死亡，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)昆蟲的治理。
[0056] 蚜蟲AV2基因：用于產(chǎn)生dsRNA的靶標(biāo)序列是從棉蚜中分離的V-型質(zhì)子栗ATPase 的A亞基基因的同源片段。但靶標(biāo)序列可以不限于該基因以及棉蚜。本發(fā)明載體中，dsRNA 的轉(zhuǎn)錄是由特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的，使dsRNA主要在篩管中積累。其潛在的害蟲防治對(duì)象為 用刺吸式口器取食的蚜蟲、粉虱、介殼