一種生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌dr的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及鈾污染水體的生物修復(fù)處理領(lǐng)域，具體是利用一種生物表面活性劑對(duì)耐輻射奇球菌DR進(jìn)行功能化修飾的新方法，及其在鈾污染水體修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)境是人類賴以生存的空間，是人類進(jìn)行生產(chǎn)活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)和必要條件。人與自然環(huán)境之關(guān)系的和諧是社會(huì)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展的基本保證。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和人類開(kāi)發(fā)創(chuàng)造能力的不斷提高，對(duì)自然環(huán)境的改造力度和影響程度也越來(lái)越大。
[0003]核工業(yè)的發(fā)展、核技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及其他工業(yè)、農(nóng)業(yè)、能源、軍事、交通、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域內(nèi)的活動(dòng)使人類周圍生態(tài)環(huán)境的放射性核素本底值不斷增加，進(jìn)入環(huán)境中的放射性核素會(huì)在大氣、水和土壤中迀移，隨食物鏈進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)，產(chǎn)生輻射損傷，部分核素還將影響人體的生理生化反應(yīng)及代謝過(guò)程。鈾是一種重要的放射性核素，同時(shí)兼有化學(xué)污染毒性和放射性，在水體和土壤中大多以鈾酰離子(UO22+)形式存在，可以通過(guò)采礦作業(yè)、核試驗(yàn)、核燃料、核武器和意外泄露等方式釋放到土壤、沉積物和地下水中，造成土壤和地下水中的鈾污染，危害人類賴以生存的環(huán)境。
[0004]目前，我國(guó)處理含鈾廢水的方法主要有化學(xué)沉淀法、離子交換法、混凝沉淀法、萃取法、氧化還原法、沉降-結(jié)晶法、凝結(jié)-絮凝法、膜分離法、蒸發(fā)濃縮法、浮選法、電化學(xué)處理法、滲析法、反滲透法和吸附法。這些傳統(tǒng)方法雖然在一定程度上取得了較好的效果，但是普遍存在工藝流程冗長(zhǎng)、后續(xù)工藝復(fù)雜，成本高、投資大，能耗高、效率低、操作困難、易產(chǎn)生二次污染，特別對(duì)于處理低含量鈾污染水體時(shí)，其操作成本相對(duì)過(guò)高。
[0005]近年來(lái)發(fā)展的生物修復(fù)法，以其成本低廉、效率高、成本低、安全、環(huán)保等特點(diǎn)，成為鈾污染水體修復(fù)技術(shù)的一個(gè)研究熱點(diǎn)，吸引了眾多學(xué)者進(jìn)行了大量研究，并取得了很多可喜的研究成果，它利用生物體的生命代謝活動(dòng)降低鈾礦冶含鈾廢水中鈾的濃度或使其完全無(wú)害化，使其部分或完全恢復(fù)到原始狀態(tài)。但是，很多生物在修復(fù)鈾礦冶含鈾廢水時(shí)，由于其對(duì)輻射比較敏感，因此它們修復(fù)鈾污染水體的能力受到較大限制。
[0006]耐福射奇球菌(Deinococcus Rad1durans，DR菌)是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的福射抗性最強(qiáng)的生物之一，能夠在60 Gy/h的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，而且能在超過(guò)15 kGy的急性γ輻照環(huán)境下不出現(xiàn)致死或發(fā)生誘變，一直倍受核環(huán)境工程界的廣泛關(guān)注和重視。
[0007]然而，目前國(guó)內(nèi)外開(kāi)展耐輻射奇球菌DR修復(fù)鈾污染水體的研究鮮有報(bào)道。另外，耐輻射奇球菌DR在含鈾廢水溶液中容易以懸浮態(tài)生長(zhǎng)，菌體與水的密度差較小，難于與水分離，導(dǎo)致影響其修復(fù)鈾污染水體的實(shí)際效果。因此，通過(guò)對(duì)耐輻射奇球菌DR進(jìn)行功能化修飾，以增強(qiáng)其化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，是實(shí)現(xiàn)耐輻射奇球菌DR對(duì)鈾污染水體修復(fù)的有效途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR的方法，該方法既具有取材方便、成本低廉、環(huán)境友好，修復(fù)效率高(尤其是對(duì)鈾含量在0.5 mg/L的低濃度含鈾廢水效果更佳)，又具有操作步驟簡(jiǎn)單，水體環(huán)境適中(pH值接近中性，適宜溫度范圍寬)，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)小等多重特點(diǎn)。
[0009]一種生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR的方法，其具體措施是:首先將稻谷秸桿和谷殼埋入農(nóng)田土壤中堆肥，在低溫條件下經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)和平板化學(xué)培養(yǎng)初篩，得到一種生物表面活性劑菌株液體，將其代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)試劑對(duì)耐輻射奇球菌DR進(jìn)行功能化修飾，得到一種生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR吸附劑，并將其應(yīng)用于鈾污染水體修復(fù)中。
[0010]具體步驟如下:
(I)耐輻射奇球菌DR菌體的制備
將保存在實(shí)驗(yàn)室的耐輻射奇球菌DR劃線接種在預(yù)先配制好的固體TGY培養(yǎng)基上，使用接種環(huán)挑取單株耐輻射奇球菌DR接種于三角瓶中搖瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期，然后按一定比例的接種量接種轉(zhuǎn)至大瓶的培養(yǎng)基中，在一定溫度下繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間。待耐輻射奇球菌DR細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后，離心收集耐輻射奇球菌DR菌體，經(jīng)7000 r/min離心10 min后，收集得到新鮮的耐輻射奇球菌DR菌體。然后使用pH值為7的磷酸緩沖溶液將菌體重新懸浮，充分振蕩后，再次離心收集耐輻射奇球菌DR菌體，經(jīng)8000 r/min離心15 min后，然后將收集的耐輻射奇球菌DR菌體置于真空冷凍箱中-20 °C條件下冷凍12 h，在-80 1條件下繼續(xù)冷凍12h。最后將冷凍的耐輻射奇球菌DR菌體置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到干燥的耐輻射奇球菌DR菌體。
[0011 ] (2)生物表面活性劑菌株液體的制備
取10 g處理后的堆肥樣品，置于裝有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中振蕩25 min后，靜置30 min，得到土壤懸液。吸取2 mL土壤懸浮液接種到富集培養(yǎng)基中，放入溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為220 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)5 d。吸取上述I mL富集培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入溫度為30 °C、轉(zhuǎn)速為220 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，直至觀測(cè)到乳化現(xiàn)象。取I mL稀釋至10—3之后，以該稀釋發(fā)酵液I mL涂布于平板培養(yǎng)基上，于37 °C恒溫靜置培養(yǎng)3 d。挑選平板長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落進(jìn)行劃線分離，按照上述方法進(jìn)行再次發(fā)酵培養(yǎng)、馴化2次，即可得到馴化后的菌株。將馴化后的菌株在富集培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)I d后，吸取I mL菌液按4.5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值為6.5，在溫度為25 °C、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)2 d后，即為生物表面活性劑菌株液體。
[0012](3)生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR
稱取一定質(zhì)量干燥的耐輻射奇球菌DR菌體置于300 mL帶塞三角瓶中，加入一定體積生物表面活性劑菌株液體，再加入50 mL去離子水，超聲分散30 min，將三角瓶放在恒溫水浴箱中磁力攪拌，待混合液混合均勾后，經(jīng)8000 r/min離心15 min后，再分別用無(wú)水乙醇和去離子水洗滌3次，置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到一種生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR吸附劑。
[0013](4)生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR吸附劑對(duì)鈾的吸附
量取50 mL不同濃度的鈾標(biāo)準(zhǔn)溶液，裝入150 mL的錐形瓶中，隨后加入一定質(zhì)量的生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR吸附劑，調(diào)節(jié)溶液的pH值。然后將其放入恒溫水浴箱中進(jìn)行恒溫振蕩。待吸附反應(yīng)完成后，經(jīng)6000 r/min離心15 min后，取上清液并采用三氯化鈦還原/釩酸銨氧化滴定法測(cè)定鈾的剩余濃度，并根據(jù)吸附前后溶液中鈾的濃度計(jì)算生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR吸附劑對(duì)鈾的吸附率P (%)。
[0014]所述的步驟(I)中耐輻射奇球菌DR菌體的制備，使用的固體TGY培養(yǎng)基組成是:胰蛋白胨5 g;酵母提取物3 g;葡萄糖I g;瓊脂15 g;去離子水1000 mL；pH= 7.0。
[0015]所述的步驟(I)中耐輻射奇球菌DR菌體的制備，菌株接種量為0.5?1.5%;培養(yǎng)溫度為25?35 °C;培養(yǎng)時(shí)間為20?30 h;真空冷凍干燥溫度為-50?-60 °C;真空冷凍干燥時(shí)間為28?30 ho
[0016]所述的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的富集培養(yǎng)基組成是:氯化鉀1.5 g;硫酸銨12 g;氯化鈉1.2 g;七水硫酸亞鐵3 X 10—5 g;磷酸氫二鉀3.5 g;三水磷酸氫二鉀0.65 g；EDTA 1.1 g;酵母浸膏0.6 g;植物油5 g;去離子水1000 mL。
[0017]所述的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基組成是:氯化鉀1.5 g;硫酸銨12 g;氯化鈉1.2 g;七水硫酸亞鐵3 X 10—5 g;磷酸氫二鉀3.5 g;三水磷酸氫二鉀0.65 g;硫酸鎂0.6 g;氯化鈣0.25 g;硫酸鋅0.3 g;硫酸銅0.3 g；EDTA 1.1 g；酵母浸膏0.6 g;植物油5 g;去離子水1000 mL。
[0018]所述的步驟(2)中生物表面活性劑菌株液體的制備，使用的平板培養(yǎng)基組成是:葡萄糖20 g;蛋白胨5 g;酵母浸膏0.25 g;瓊脂20 g;去離子水1000 mL。
[0019]所述的步驟(3)中生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR，使用的干燥的耐輻射奇球菌DR菌體質(zhì)量為1.5?2.5 g;生物表面活性劑菌株液體體積為20?30 mL，功能化修飾溫度為40?50 °C;功能化修飾時(shí)間為4?5 h;真空冷凍干燥溫度為70?80 °C;真空冷凍干燥時(shí)間為2 - 3 ho
[0020]所述的步驟(4)中生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR吸附劑對(duì)鈾的吸附，鈾標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為0.45?0.5 mg/L;吸附劑的質(zhì)量為I?2 g;溶液的pH值為3?8;反應(yīng)溫度為25?50 °C;吸附時(shí)間為20?70 min。
[0021 ]本發(fā)明所述的一種生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR的方法及其應(yīng)用，相比現(xiàn)有的技術(shù)，具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
(I)在生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR的過(guò)程中，使用自制的生物表面活性劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中使用的化學(xué)試劑，從而避免了有毒有害的化學(xué)物質(zhì)排入到環(huán)境中，真正做到了對(duì)環(huán)境友好。
[0022](2)本發(fā)明使用的耐輻射奇球菌DR對(duì)鈾污染水體具有較好的耐輻射性能，克服了常用吸附生物的耐輻射抗性問(wèn)題。
[0023](3 )本發(fā)明在使用生物表面活性劑功能化修飾耐輻射奇球菌DR過(guò)程中，制備工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，不需要任何加壓等化工設(shè)備，加熱條件也容易實(shí)現(xiàn)，能耗低。
[0024](4)本發(fā)明使