專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種耐輻射奇球菌及產(chǎn)生的微生物抗紫外輻射制劑的制作方法一種耐輻射奇球菌及產(chǎn)生的微生物抗紫外輻射制劑發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵及其代謝產(chǎn)物領(lǐng)域，特別是涉及一種抗紫外輻射的微生物菌抹及其由該菌抹發(fā)酵產(chǎn)生的抗紫外輻射制劑的
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景陽(yáng)光中的紫外線是200~400nm的電磁波，分為三個(gè)波段，長(zhǎng)波(UVA,320~400nm)、中波(UVB,280~320nm)與短波(UVC，200~280nm)。其中UVB和UVA可以穿過(guò)大氣層，能使皮膚曬紅、曬黑、曬傷，引發(fā)皮膚細(xì)胞DNA氧化性損傷、免疫抑制、炎癥等，并可導(dǎo)致DNA突變及皮膚癌的發(fā)生。紫外輻射對(duì)生物體的損傷作用包括兩個(gè)部分，一是輻射的直接損傷；二是輻射引起的大量自由基導(dǎo)致的間接損傷?；瘖y品中加人一定量的防曬劑，能預(yù)防減少紫外線對(duì)人體的損傷。目前化妝品中使用的防曬劑有紫外線吸收劑和紫外線屏蔽劑，前者對(duì)UVA區(qū)和UVB區(qū)的紫外線有較強(qiáng)的吸收性能，能減少或完全吸收紫外線，成為防曬劑的主要發(fā)展方向，特別是天然成分的分離、篩選已經(jīng)成為醫(yī)藥、化妝品基礎(chǔ)研發(fā)的熱點(diǎn)，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。微生物具有多樣的生理代謝特征和超強(qiáng)的環(huán)境的適應(yīng)能力，其代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為人類(lèi)重要的化學(xué)品庫(kù)，是重要功能性化合物的研究與開(kāi)發(fā)基礎(chǔ)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，出于對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)性，微生物中存在對(duì)紫外輻射具有強(qiáng)抗性的4勿種,i口Moraxella-Acinetobacter(LewisC.Keller,ThomasL"Thompson，R.BurtMaxxy.UVLight-InducedSurvivalResponseinaHighlyRadiationResistantIsolateoftheMoraxella-AcinetobacterGroup十.AppliedandEnvironmentalMicrobiology.1982,2:424-429.)、Deinococcusfrigens、Deinococcussaxicola和Deinococcus3marmoris(PeterHirsch,ClaudiaA.Gallikowski,etal.Deinococcusfrigenssp.nov"Deinococcussaxicolasp.nov.,andDeinococcusmarmorissp.nov"LowTemperatureandDraught-tolerating,UV-resistantBacteriafromContinentalAntarctica.Appl.Microbiol.2004,27:636-645.)、Deinococcusyunweiensis(YuQinZhang,Cheng-HangSun，Wen-JunLi,Li-YanYu，Jian-QinZhou，lYue-QinZhang,Li-HuaXu,Cheng-LinJiang.Deinococcusyunweiensissp.nov"agamma-andUV-radiation-resistantbacteriumfromChina.InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology.2007,57:370-375.)、耐輻射桿菌RR533.2(呂星，邢瑞云，周緒斌，劉瓊明，鄭暉.一種短桿狀耐輻射菌的分離與鑒定.微生物學(xué)報(bào).2003,6:301-306.)、PantoeaagglomeransKFS-9(王洪嫂,抗UV-B輻射菌PantoeaagglomeransKFS-9的選育及其抗輻射機(jī)制的研究.中國(guó)海洋大學(xué)，2006.)、PantoeaagglomeransTCa-7(梁曉婷，PantoeaagglomeransTCa-7抗紫外輻射損傷作用的研究.中國(guó)海洋大學(xué)，2007.)等各類(lèi)微生物。近年來(lái)對(duì)抗輻射微生物研究發(fā)現(xiàn)，其代謝產(chǎn)物或是具有紫外輻射吸收作用，或是具有清除氧自由基的功效，或是具有多種醫(yī)藥功能，并對(duì)其它生物具有良好的4呆護(hù)作用。如抗紫外菌PantoeaagglomeransKFS-9產(chǎn)生的色素類(lèi)物質(zhì)對(duì)290~340nm的紫外線輻射具有良好的吸收特性，多糖類(lèi)物質(zhì)具有清除氧自由基的功效，且能有效保護(hù)UVB輻射下的微生物細(xì)胞(王洪媛，江曉路，抗UV-B輻射菌紫外吸收代謝產(chǎn)物分析及其抗輻射輻射活性研究.中國(guó)海洋藥物雜志.2006,4:l-5.);在南極強(qiáng)紫外輻射環(huán)境中的藍(lán)藻細(xì)菌(cyanobacteria)產(chǎn)生的一種可吸收紫外線的特殊脂溶性色素Scytonemi(SinhaRP，KlischM,GronigerA，etal.Uhraviolet-absorbing/screeningsubstancesincyanobactefia,phytoplanktonandmacroalgae[J].JPhotochemPhotobio舊Biol，1998,47(2):83-88.)、真菌產(chǎn)生一種具有吸收紫外輻射特性的水溶性代謝物(KarentzD,Bosch1,DunlapWC.DistributionofUV-absorbingcompoundsintheAntarcticlimpetNacehaconci腿[J].AntarcticJUS,1992,27(5):121-126.)、以及地衣產(chǎn)生的具有良好輻射吸收特性的多酚類(lèi)代謝產(chǎn)物(BachereauF,AstaJ.Effectsofsolarultravioletradiationathighaltitudeonthephysiologyandthebiochemistryofaterricolouslichen(CetrariaislandicaL.)[J].Symbiosis,1997，23(2-3):197-201.)等。微生物作為一種重要的生物資源，其代謝產(chǎn)物已在化妝品、醫(yī)藥、食品等行業(yè)得到了廣泛的研究并取得了重大的應(yīng)用。利用對(duì)紫外輻射具有良好抗性的微生物進(jìn)行抗紫外輻射制劑及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于通過(guò)獲得抗紫外輻射菌抹及通過(guò)對(duì)獲得菌抹的發(fā)酵培養(yǎng)從而獲得具有抗紫外輻射特性的制劑。本發(fā)明通過(guò)從新疆地區(qū)分離篩選出的一林抗紫外輻射特性的微生物菌林RUV-113,從而獲得抗紫外微生物產(chǎn)物產(chǎn)生菌，經(jīng)微生物菌抹的分類(lèi)與鑒定分析，確定其為耐輻射奇球菌(Dez'"ococc船取)。同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明提供的菌林，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)及提取工藝獲得的微生物抗紫外輻射粗制劑。本發(fā)明提供了一株抗紫外輻射菌抹RUV-113,命名為Deinococcussp.，其能夠產(chǎn)生抗紫外輻射代謝產(chǎn)物。該菌林已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期是2009年3月18日，保藏號(hào)是CGMCCNo2960。經(jīng)-微生物學(xué)鑒定為耐輻射奇球菌(Z)ef"oeoecwsi^Wwra"ce)，筒稱(chēng)耐輻射奇球菌(Z)&"oc。cc附)。該菌株培養(yǎng)溫度10-55°C,最適培養(yǎng)溫度30。C。該菌種生長(zhǎng)于MM培養(yǎng)基(牛肉膏1.5g、酵母膏3g、蛋白陳5g、葡萄糖10g、瓊脂15-20g、蒸餾水1L)表面，經(jīng)30。C、72h培養(yǎng)，菌落呈橙紅色、小、圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑、不透明；細(xì)胞圓形、呈二聯(lián)或四聯(lián)狀。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等對(duì)RUV-113菌抹進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化測(cè)定，主要生理生化測(cè)定結(jié)果如下表所示。通過(guò)PCR獲得RUV-113菌株的16SrDNA/RNA序列，經(jīng)序列測(cè)定及BLAST同源性對(duì)比與進(jìn)化分析，結(jié)果表明RUV-113與DeinococcusradioduransDSM20539T(Y11332)16SrDNA同源性為97%,確定為耐輻射奇球菌(De/"ococcww.)。本發(fā)明提供了利用耐輻射奇球菌(D"'"ococcww.)CGMCCNo2960，通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)及提取工藝獲得的微生物抗紫外輻射制劑的方法及制劑。RUV-113菌林可采用斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)保存方式或是真空冷凍干燥方法進(jìn)行長(zhǎng)期的保藏。其中斜面培養(yǎng)方式適合于RUV-113生長(zhǎng)的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，30°C、48~72h,待菌落形成橙紅色后置于4'C下恒溫保藏，3-6個(gè)月傳代一次。利用真空干燥法進(jìn)行菌種保藏，在低溫或常溫下可保藏1年以上。長(zhǎng)期保藏的菌種在發(fā)酵培養(yǎng)之前首先在適合于RUV-113生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，本發(fā)明選擇TGY培養(yǎng)基，以平板劃線法或涂布法接種RUV-113于固體培養(yǎng)基表面，30°C、48~72h恒溫培養(yǎng)，同時(shí)^r測(cè)其是否有雜菌污染。將增殖培養(yǎng)的RUV-113接種于TGY液體培養(yǎng)基中，180-200rpm、30°C、24~48h;發(fā)酵培養(yǎng)所獲得的培養(yǎng)物經(jīng)4000rpm離心或過(guò)濾處理后收集上清液，在4045。C下真空旋轉(zhuǎn)濃縮到45倍；將濃縮液在室溫下用1:1的乙酸乙酯萃取。加入乙酸乙酯后充分混勻，靜置，等分層后，回收乙酸乙酯部分。將回收的部分利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在40-45。C下進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至樣品成膠體狀物質(zhì)且體積不再發(fā)生變化，此為RUV-113發(fā)酵獲得的抗紫外輻射代謝產(chǎn)物粗制劑，此粗制劑可利用真空冷凍干燥法獲得固體粉制劑。同時(shí)，本發(fā)明也可通過(guò)利用本發(fā)明提供的耐輻射奇球菌(Z)ez'"ococcws取)CGMCCNo2960,通過(guò)公知的傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)及提取工藝技術(shù)可獲得的微生物抗紫外輻射制劑。通過(guò)實(shí)施本發(fā)明具體的
發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下有益效果本發(fā)明定向篩選到抗紫外輻射產(chǎn)生菌RUV-113，經(jīng)鑒定為耐輻射奇球菌(DeinococcusRadiodurance)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明耐輻射奇球菌(De/wococcws5p.)CGMCCNo2960是一種抗紫外輻射菌抹，通過(guò)發(fā)酵獲得的抗紫外輻射代謝產(chǎn)物粗制劑;利用乙酸乙酯或正丁醇提取胞外代謝產(chǎn)物，從而獲得具有抗紫外輻射特6性的制劑。圖1為基于16SrDNA序列的RUV-113菌林同源進(jìn)行化分析結(jié)果；圖2為正丁醇提取物對(duì)紫外波長(zhǎng)掃描結(jié)果；圖3為乙酸乙酯提取物紫外波長(zhǎng)掃描結(jié)杲；圖4為正丁醇提取物清除DPPH自由基特性測(cè)定結(jié)果；圖5為乙酸乙酯提取清除DPPH自由基特性測(cè)定結(jié)果；圖6為乙酸乙酯提取物對(duì)紫外輻射下大腸桿菌(五.co/f)的保護(hù)作用,其中，00//為未加入乙酸乙酯提取的對(duì)照處理樣，E-R為加入乙酸乙酯提取物的處理樣。具體實(shí)施方式下面，舉實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實(shí)施例。另夕卜，在下迷的說(shuō)明中，如無(wú)特別說(shuō)明，則％皆指質(zhì)量百分比。實(shí)施例一抗紫外輻射菌株RUV-113的鑒定通過(guò)從新疆馬蘭地區(qū)分離篩選出的一抹抗紫外輻射特性的微生物菌抹RUV-113,命名為耐輻射奇球菌(D""ococcM平)，其能夠產(chǎn)生抗紫外輻射代謝產(chǎn)物。該菌抹已于申請(qǐng)日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國(guó)際保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏日期是2009年3月18日，保藏號(hào)是CGMCCNo2960。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為耐輻射奇球菌(Deinococcus)屬菌。該菌林培養(yǎng)溫度10-55°C，最適培養(yǎng)溫度30。C。該菌種生長(zhǎng)于MM培養(yǎng)基(牛肉膏1.5g、酵母膏3g、蛋白陳5g、葡萄糖10g、瓊脂15-20g、蒸餾水1L)表面，經(jīng)3(TC、72h培養(yǎng)，菌落呈橙紅色、小、圓形、凸起、邊緣整齊、表面光滑、不透明；細(xì)胞圓形、呈二聯(lián)或四聯(lián)狀。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》等對(duì)RUV-113菌林進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化測(cè)定，主要生理生化測(cè)定結(jié)果如下表所示。通過(guò)PCR獲得RUV-113菌抹的16SrDNA/RNA序列，經(jīng)序列測(cè)定及BLAST同源性對(duì)比與進(jìn)化分析，結(jié)果表明RUV-113與DeinococcusradioduransDSM20539T(Y11332)16SrDNA同源性為97%,確定為耐輻射奇球菌(De/wococcwv.)。比對(duì)分析結(jié)果參見(jiàn)附圖1。RUV-113主要的生理生化特性如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"+"為陽(yáng)性反應(yīng)；"_"為陰生反應(yīng)。實(shí)施例二RUV-113發(fā)酵獲得的抗紫外輻射代謝產(chǎn)物制劑將耐輻射奇球菌(De/"ococcws平)CGMCCNo2960在TGY培養(yǎng)基,以平板劃線法或涂布法接種RUV-113于固體培養(yǎng)基表面，30。C、48-72h恒溫培養(yǎng)，同時(shí)檢測(cè)其是否有雜菌污染。將增殖培養(yǎng)的菌抹接種于TGY液體培養(yǎng)基中，180~200rpm、30°C、24~48h;發(fā)酵培養(yǎng)所獲得的培養(yǎng)物經(jīng)4000rpm離心或過(guò)濾處理后收集上清液，在40-45。C下真空旋轉(zhuǎn)濃縮到4~5倍；將濃縮液在室溫下用1:l的乙酸乙酯萃取。加入乙酸乙酯后充分混勻，靜置，等分層后，回收乙酸乙酯部分。將回收的部分利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在4045。C下進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至樣品成膠體狀物質(zhì)且體積不再發(fā)生變化，此為RUV-113發(fā)酵獲得的抗紫外輻射代謝產(chǎn)物粗制劑，此粗制劑可利用真空冷凍干燥法獲得固體粉制劑。實(shí)施例三正丁醇提取物對(duì)紫外輻射吸收特性測(cè)定將保藏的RUV-113菌林接種于TGY培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待菌種生長(zhǎng)成熟，檢測(cè)其是否有雜菌污染。確定無(wú)雜菌污染的情況下接其接種于TGY液體培養(yǎng)中，30~35°C、150rpm振蕩培養(yǎng)48-60h;發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)4000rpm離心處理，去沉淀，1000ml上清液在40~45°C下減壓濃縮5倍，獲得的濃縮液用1:1的正丁醇萃取，4~6h;回收正丁醇組分，在45。C下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至體積不發(fā)生改變，此為正丁醇提取物。濃縮液中加入20ml正丁醇溶解稀釋?zhuān)糜谧贤夥止夤舛扔?jì)下進(jìn)行220~400nm紫外掃描分析。分析結(jié)果參見(jiàn)附圖2所示，RUV-113菌抹的發(fā)酵正丁醇提取物對(duì)UVA、UVB、UVC均具有吸收特性。實(shí)施例四乙酸乙酯提取物對(duì)紫外輻射吸收特性測(cè)定將保藏的RUV-113菌抹接種于TGY培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待菌種生長(zhǎng)成熟，檢測(cè)其是否有雜菌污染。確定無(wú)雜菌污染的情況下接其接種于TGY液體培養(yǎng)中，30~35°C、150rpm振蕩培養(yǎng)4860h;發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)4000rpm離心處理，去沉淀，上清液在4045。C下減壓濃縮5倍，獲得的濃縮液用1:l的乙酸乙酯萃取，4~6h?；厥找宜嵋阴ソM分，在45。C下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至體積不發(fā)生改變，此為乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯提取物中加入20ml正丁醇溶解稀釋?zhuān)糜谧贤夥止夤舛扔?jì)下進(jìn)行220400nm紫外掃描分析。分析結(jié)果參見(jiàn)附圖3所示，RUV-113菌林的發(fā)酵乙酸乙酯提取物對(duì)UVA、UVB、UVC均具有吸收特性。實(shí)施例五DPPH法測(cè)定正丁醇提取物清除自由基能力。準(zhǔn)確稱(chēng)取DPPH(二苯代苦味?；?2.5mg，使用曱醇定溶至100ml，即配制成質(zhì)量濃度25ug/mlDPPH溶液。取上述溶液3.9ml與實(shí)施例一中的正丁醇提取物的20ml正丁醇溶解稀釋液O.lml迅速混合反應(yīng)，并在OD515nm測(cè)定5min中變化率。參見(jiàn)附圖4所示，在5分鐘內(nèi)，正丁醇提取物對(duì)DPPH產(chǎn)生物自由基具有一定的清除能力。實(shí)施例六DPPH法測(cè)定乙酸乙酯提取物清除自由基能力。準(zhǔn)確稱(chēng)取DPPH(二苯代苦味?；?2.5mg,使用曱醇定溶至lOOml，即配制成質(zhì)量濃度25ug/mlDPPH溶液。取上述溶液3.9ml與實(shí)施例二中乙酸乙酯提取物的20ml正丁醇溶解稀釋液0.1ml迅速混合反應(yīng)，并在OD515nm測(cè)定5min中變化率。參見(jiàn)附圖5所示，5分鐘內(nèi)乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH產(chǎn)生的自由基具有一定的清除能力。實(shí)施例七乙酸乙酯提取物對(duì)大腸桿菌(E.coli)的輻射保護(hù)作用以大腸桿菌JM109為測(cè)試菌抹，以液體LB(填加培養(yǎng)基配方)為勤出培養(yǎng)基對(duì)JM109進(jìn)行增殖培養(yǎng)24h。4000rpm收集培養(yǎng)物中的菌體，以生理鹽水(0.75%NaCL)溶液洗滌菌體兩次后再以生理鹽水進(jìn)^f亍懸浮并稀釋為OD600為0.2的菌懸液；處理樣中加入實(shí)施例二中的1%的乙酸乙酯萃取物以20ml生理鹽水溶解稀釋液，不加的樣設(shè)為對(duì)照。取5mL菌懸液置于9cm培養(yǎng)皿中，放置于15W紫外燈下20cm處，振蕩輻照處理，每10min取樣進(jìn)行1次，以平板涂布法檢測(cè)JM109的存活量。結(jié)果參見(jiàn)附圖6所示。RUV-113菌抹發(fā)酵代謝產(chǎn)物乙酸乙酯提取物對(duì)紫外輻照下的五.co//JM109具有良好的保護(hù)作用。權(quán)利要求1、一種耐輻射奇球菌(Deinococcussp.)CGMCCNo2960。2、一種利用權(quán)利要求1所述的耐輻射奇球菌(D"'"ococcmw.)CGMCCNo2960發(fā)酵獲得的抗紫外輻射制劑。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種耐輻射奇球菌(Deinococcussp.)CGMCCNo2960及發(fā)酵獲得的抗紫外輻射制劑。通過(guò)將菌種接種于培養(yǎng)基表面，30℃、48～72h恒溫培養(yǎng)，將增殖培養(yǎng)的菌株接種于培養(yǎng)基中，180～200rpm、30℃、24～48h；發(fā)酵培養(yǎng)所獲得的培養(yǎng)物經(jīng)4000rpm離心或過(guò)濾處理后收集上清液，在40～45℃下真空旋轉(zhuǎn)濃縮到4～5倍；將濃縮液在室溫下用乙酸乙酯萃取，將回收的部分利用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在40～45℃下進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮獲得抗紫外輻射制劑。本發(fā)明利用對(duì)紫外輻射具有良好抗性的微生物進(jìn)行抗紫外輻射制劑及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，將在化妝品、醫(yī)藥、食品等行業(yè)將具有廣泛的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N1/20GK101591630SQ20091011337公開(kāi)日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年6月30日優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日發(fā)明者唐琦勇,宋素琴,瑋常,張志東,瑋王,軍茆,謝玉清,東魏申請(qǐng)人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所