牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，包括以下步驟：精確稱取牛肉試樣，加入超聲提取溶劑后萃取，將萃取液離心，得到的離心后上清液過反相固相萃取柱凈化，再以5mL甲醇洗脫，得到的洗脫液在溫度60℃下用氮吹儀吹干，再以流動相溶解后，以0.22μm濾膜過濾到進樣瓶里，上帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀進行測定即可。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，對萃取時間和提取液用量兩個最主要的因素進行了優(yōu)化，得到了最佳的超聲萃取時間和提取液物料比，具有提取效果好，耗時短，靈敏度、精密度和準確度好等優(yōu)點，適合用于牛肉樣品中氟喹諾酮類藥物殘留的快速檢測。
【專利說明】牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及肉制品藥物殘留的測定方法，具體涉及牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的 測定方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 氟喹諾酮是一類抗菌藥，作用機制是：抑制細菌DNA螺旋酶，阻礙DNA復制。氟喹 諾酮類對G-桿菌，包括綠膿桿菌均有良好抗菌作用，對G+球菌也具一定抗菌活性，尤其對 耐藥G-桿菌，仍可呈現(xiàn)敏感。臨床用于治療尿路、腸道、呼吸道以及皮膚軟組織、腹腔、骨關(guān) 節(jié)等感染。任何藥物都有副作用，氟喹諾酮也不例外，而且由于氟喹諾酮類藥物的廣 泛應用，常常有不合理用藥和濫用藥情況發(fā)生，氟喹諾酮藥物的不良反應主要發(fā)生在人 類，動物則反應不大，但動物用藥后的藥物殘留可以通過食物鏈傳播，同樣會引起人類 不良反應現(xiàn)象的發(fā)生，影響人類健康，為此，對動物體內(nèi)氟喹諾酮的殘留檢測已越來越 引起人們的重視。
[0004] 超聲波提取分離主要是依據(jù)物質(zhì)中有效成分和有效成分群體的存在狀態(tài)、極性、 溶解性等設計的一項學科。合理利用超聲波振動的方法進行提取的新工藝，使溶劑快速地 進入固體物質(zhì)中，將其物質(zhì)所含的有機成分盡可能完全地溶于溶劑之中，得到多成分混合 提取液。利用超聲波技術(shù)來強化提取分離過程，可有效提高提取分離率，縮短提取時間、節(jié) 約成本、甚至還可以提高產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。超聲波提取(也稱為超聲波萃?。┮云涮崛?溫度低、提取率高、提取時間短的獨特優(yōu)勢被具有創(chuàng)新意識者應用于中藥材和各種動、植物 有效含量的提取，是替代傳統(tǒng)剪切工藝方法實現(xiàn)高效、節(jié)能、環(huán)保式提取的現(xiàn)代高新技術(shù)手 段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一種牛肉中氟諾喹酮類藥 物殘留的測定方法。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測 定方法，包括以下步驟： 1) 精確稱取牛肉試樣1. 99-2.Olg，放入50mL的具塞磨口錐形瓶中，按照每lg牛肉試 樣加入2. 5mL-12. 5mL的比例加入超聲提取溶劑，蓋緊塞子后置于超聲清洗儀上進行萃取， 萃取時間為5-25min，得到萃取液； 2) 將步驟1)得到的萃取完畢后的萃取液立即離心，離心轉(zhuǎn)速為8000r/m，離心時間 6min，得到離心后上清液； 3) 將步驟2)得到的離心后上清液過反相固相萃取柱凈化，再以5mL甲醇洗脫，得到洗 脫液； 4)將步驟3)得到的洗脫液在溫度60°C下用氮吹儀吹干，再以流動相溶解后，以 0. 22ym濾膜過濾到進樣瓶里，上帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀進行測定即可。
[0007] 進一步的，上述的牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，所述步驟1)中，牛肉試 樣重量為2g;超聲提取溶劑為按照體積比計乙腈：10%三氯乙酸溶液為30 :70 ;所述超聲提 取溶劑的加入比例為每lg牛肉試樣加入7. 5mL超聲提取溶劑；所述萃取時間為20min。
[0008] 進一步的，上述的牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，所述步驟3)中，反相固 相萃取柱需先用3mL甲醇和3mL水依次活化。
[0009] 進一步的，上述的牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，所述步驟4)中，流動相 為按照體積比計檸檬酸/乙酸銨緩沖液：乙腈為82 :18,流速為0. 8mL/min，柱溫為25°C，進 樣體積為20yL，熒光檢測器激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長為450nm。
[0010] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，是 將超聲萃取技術(shù)應用到牛肉中氟喹喏酮類藥物殘留的檢測當中，采用超聲萃取技術(shù)來提取 牛肉當中殘留氟喹喏酮類藥物，并對萃取時間和提取液用量兩個最主要的因素進行了優(yōu) 化，得到了最佳的超聲萃取時間和提取液物料比，超聲提取的樣品經(jīng)固相萃取凈化后，用帶 有熒光檢測器的高效液相色譜儀進行測定，該方法具有提取效果好，耗時短，靈敏度、精密 度和準確度好等優(yōu)點，適合用于牛肉樣品中氟喹諾酮類藥物殘留的快速檢測。該方法的回 收率在62-97%之間，相對標準偏差RSD< 15%，最低檢出限為介于4. 05-13. 3i!g/kg之間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為牛肉加標25iig/kg的色譜圖。

【具體實施方式】
[0012] 本發(fā)明所用試劑及儀器： 儀器： KQ-600DE型超聲清洗儀：昆山超聲清洗儀器廠； XS205型電子天平：MettlerToledo公司； 組織均楽儀：美國waters公司； H-2050R型湘雅離心機； 氮吹儀：美國waters公司； Waters2695型高效液相色譜儀(配有突光檢測器）：美國waters公司； SunFireTMC18柱：4.6 mmX250mm，5um，美國waters公司。
[0013]試劑： 檸檬酸、乙酸銨、三氯乙酸和氫氧化鈉均為分析純試劑：購自上海國藥集團； 甲醇、乙腈：色譜純，購自比利時fisher公司； 實驗用水為超純水； 環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達氟沙星和沙拉沙星標準品：購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。
[0014] 檸檬酸/乙酸銨緩沖液制備方法：稱取10. 6g檸檬酸和7. 9g乙酸銨，用純水定容 至ljlmL，滴加三乙胺lmL，過0. 22iim濾膜備用即可。
[0015] 超聲提取液制備方法：體積比為30:70的乙腈一 10%三氯乙酸溶液，量取300mL 乙腈和700mL10%三氯乙酸溶液互溶。
[0016] 實施例1 : 1、超聲提?。?精確稱取試樣2. 0±0. 01g，放入50mL的具塞磨口錐形瓶中，加入一定量的提取液為 提取液，蓋緊塞子，置于超聲清洗儀上進行萃取，萃取完畢后將萃取液立即離心，上清液過 固相萃取小柱凈化，甲醇洗脫，洗脫液在60°C下用氮吹儀吹干。最后用流動相溶解，過濾到 進樣瓶里面，上高效液相色譜儀測定。
[0017] 2、液相色譜儀器方法： 流動相為檸檬酸/乙酸銨緩沖液-乙腈（V:V=82:18)，流速為1.0mL/min，柱溫25°C， 進樣體積20yl，熒光檢測器激發(fā)波長：280nm，發(fā)射波長450nm。
[0018] 3、超聲提取條件的優(yōu)化： 氟喹諾酮類藥物具有相似的化學性質(zhì)和物理性質(zhì)，因此選擇環(huán)丙沙星為代表，采用牛 肉樣品中加標環(huán)丙沙星標準溶液（25yg/kg)，經(jīng)處理后，測定環(huán)丙沙星色譜峰峰面積，峰面 積可以反應最佳的提取條件。
[0019] 1)提取時間： 其他條件不變，分別設定超聲提取時間為5min、lOmin、15min、20min和25min為單因素 條件，測定不同超聲提取時間下的加標環(huán)丙沙星牛肉樣品的色譜峰峰面積，超聲提取提取 時間對提取效果的影響結(jié)果如表1所示。隨著超聲提取時間的延長，樣品中環(huán)丙沙星的檢 出峰面積逐漸增大；20min后，漸趨穩(wěn)定。隨著超聲時間的延長會造成阿維菌素類藥物的 損失，因此15min為最佳超聲萃取時間。
[0020] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 精確稱取牛肉試樣1. 99-2. Olg，放入50mL的具塞磨口錐形瓶中，按照每lg牛肉試 樣加入2. 5mL-12. 5mL的比例加入超聲提取溶劑，蓋緊塞子后置于超聲清洗儀上進行萃取， 萃取時間為5-25min，得到萃取液； 2) 將步驟1)得到的萃取完畢后的萃取液立即離心，離心轉(zhuǎn)速為8000r/m，離心時間 6min，得到離心后上清液； 3) 將步驟2)得到的離心后上清液過反相固相萃取柱凈化，再以5ml甲醇洗脫，得到洗 脫液； 4) 將步驟3)得到的洗脫液在溫度60°C下用氮吹儀吹干，再以流動相溶解后，以 0. 22 y m濾膜過濾到進樣瓶里，上帶有熒光檢測器的高效液相色譜儀進行測定即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，其特征在于，所述 步驟1)中，牛肉試樣重量為2g ;超聲提取溶劑為按照體積比計乙腈：10%三氯乙酸溶液為 30 :70 ;所述超聲提取溶劑的加入比例為每lg牛肉試樣加入7. 5mL超聲提取溶劑；所述萃 取時間為20min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，其特征在于，所述 步驟3)中，反相固相萃取柱需先用3ml甲醇和3ml水依次活化。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的牛肉中氟諾喹酮類藥物殘留的測定方法，其特征在于，所述 步驟4)中，流動相為按照體積比計檸檬酸/乙酸銨緩沖液：乙腈為82 :18,流速為0. 8mL/ min，柱溫為25°C，進樣體積為20 y L，熒光檢測器激發(fā)波長為280nm，發(fā)射波長為450nm。
【文檔編號】G01N30/02GK104330497SQ201410666699
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】熊琳, 高雅琴, 李維紅, 郭天芬, 楊曉玲 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所