本發(fā)明屬于生物制藥和生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物法制備莫西沙星側(cè)鏈的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

(S,S)-2,8-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷(1)及其N-保護(hù)衍生物(2)是合成應(yīng)用廣泛的喹諾酮類抗菌藥莫西沙星的關(guān)鍵手性中間體，又稱莫西沙星側(cè)鏈或莫西小環(huán)：

由于(S,S)-2,8-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷含有兩個手性中心，其合成方法通常有拆分法，不對稱合成法和手性源法。拆分法是最主要的應(yīng)用方法，以2,3-二甲酸吡啶為起始原料，通過高壓氫化等方法獲得芐基保護(hù)的1的消旋體，利用酒石酸等拆分劑進(jìn)行拆分獲得產(chǎn)品，理論收率低于50％，過程復(fù)雜，收率低(徐丹丹等，精細(xì)與專用化學(xué)品，2011，19卷第1期，43-44頁，收率43.3％)。

手性源法使用手性起始物料，如D-苯甘氨醇等合成1。但是由于沒有與1較為接近的手性化合物，存在步驟較長，收率較低(9步總收率27％)等問題(崔棟等，浙江化工，2013，44卷第8期，5-9頁)。

不對稱合成法包括:如US 5703244報道的通過sharpless不對稱環(huán)氧化構(gòu)建手性中心：

和通過手性胺試劑氨化引入手性基團(tuán)，如CN 201110312411的報道：

不對稱合成法較拆分法和手性源法具有較高的效率，但仍需要使用金屬催化劑和有機溶劑。US 5703244的合成路線需要11步反應(yīng)，難以工藝化應(yīng)用。CN 201110312411路線只需要5步反應(yīng)，但是其關(guān)鍵步驟反應(yīng)底物和產(chǎn)物需要柱層析分離，收率不高(36％-57％)，且需要等量的手性反應(yīng)試劑。綜上所述，化學(xué)法制備(S,S)-2,8-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬烷普遍存在步驟長，收率低，條件苛刻，需要手性試劑等問題，導(dǎo)致產(chǎn)物成本較高，生產(chǎn)過程環(huán)境壓力較大。

另外一種生物法不對稱合成路線利用轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行羰基的氨化(CN 201410418987)，如圖所示，由于產(chǎn)物的ee值和得率都較低，且所用的酶來源未知，所以缺乏產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值。

本領(lǐng)域仍然需要一種能以較高的產(chǎn)品收率和生產(chǎn)效率制備莫西沙星側(cè)鏈的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了一種利用轉(zhuǎn)氨酶催化制備莫西沙星側(cè)鏈的方法，產(chǎn)品收率和生產(chǎn)效率較目前方法具有明顯的優(yōu)勢。

具體而言，本發(fā)明公開一種下式2化合物的制備方法：

該方法包括：

(1)利用轉(zhuǎn)氨酶催化下式4化合物，形成式3化合物，

和

(2)在允許式3化合物自發(fā)閉環(huán)的條件下，由式3化合物自發(fā)閉環(huán)而得到式2 化合物；

其中，式2、3和4中，R選自：

在一個具體實施例中，所述反應(yīng)在含有有機溶劑、氨基供體、緩沖液、轉(zhuǎn)氨酶和轉(zhuǎn)氨酶的輔酶的體系中進(jìn)行。

在一個具體實施例中，所述有機溶劑選自：DMSO、乙腈、二甲基四氫呋喃、甲基叔丁基醚和DMF。

在一個具體實施例中，所述氨基供體為異丙胺、(R)-甲基芐胺、(S)-甲基芐胺或丙氨酸，優(yōu)選為異丙胺。

在一個具體實施例中，所述轉(zhuǎn)氨酶選自：節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)、土曲霉(Aspergillus terreus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)、青紫色素桿菌(Chromobacterium violaceum)中的ω-轉(zhuǎn)氨酶。

在一個具體實施例中，所述轉(zhuǎn)氨酶的序列如SEQ ID NO:1－20中任一所示。

在一個具體實施例中，所述轉(zhuǎn)氨酶的序列與SEQ ID NO:1－20中任一所示序列具有至少80％相同性。

在一個具體實施例中，所述輔酶選自磷酸吡哆醛。

在一個具體實施例中，所述體系的pH為7.0-10.0，優(yōu)選8.0-10.0，更優(yōu)選9.0-10.0。

在一個具體實施例中，所述體系的pH使用選自三乙醇胺緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液的緩沖液和補加異丙胺維持。

在一個具體實施例中，體系的反應(yīng)溫度為30～45℃。

在一個具體實施例中，體系的反應(yīng)溫度為35±3℃，優(yōu)選35±1℃。

在一個具體實施例中，反應(yīng)時間為8～24小時。

在一個具體實施例中，所述轉(zhuǎn)氨酶與式4化合物的用量(重量)配比為0.05～1：1。

在一個具體實施例中，輔酶與轉(zhuǎn)氨酶的用量(重量)配比為0.02～0.2：1。

在一個具體實施例中，以反應(yīng)體系總體積計，式4化合物的濃度為1～120g/L。

在一個具體實施例中，化合物2的ee值大于99％，de值大于99％，收率大于95％。

附圖說明

圖1顯示實施例9制備得到的產(chǎn)物的NMR圖譜。

圖2顯示實施例9制備得到的產(chǎn)物的MS圖譜。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種利用轉(zhuǎn)氨酶催化制備2的路線，通過轉(zhuǎn)氨酶催化易得的底物4(參照路線4，合成只需要2步反應(yīng))轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物3，3自發(fā)閉環(huán)得到2，剩余的R-底物5在堿性反應(yīng)環(huán)境中自發(fā)消旋回到底物4，可以以>99％de，>99％ee和>90％收率一步獲得光學(xué)純的莫西沙星側(cè)鏈衍生物，且過程溫和環(huán)保。2脫保護(hù)基后即得到莫西沙星側(cè)鏈1，整個過程只需4步反應(yīng)，收率高，條件溫和，無需手性試劑，與現(xiàn)有過程比較具有較高的實用性。

其中，

反應(yīng)通常在含有氨基供體、緩沖溶液、轉(zhuǎn)氨酶、轉(zhuǎn)氨酶的輔酶和任選的有機溶劑的體系中進(jìn)行。

通常，有機溶劑占反應(yīng)體系總體積的0～30％。適用于本發(fā)明的有機溶劑可以是DMSO、乙腈、二甲基四氫呋喃、甲基叔丁基醚和DMF中的一種或多種。

適用于本發(fā)明的氨基供體可以是異丙胺、(R)-甲基芐胺、(S)-甲基芐胺和丙氨酸中的一種或多種，優(yōu)選為異丙胺。在某些實施例中，氨基供體與底物4的摩爾比為1～5：1，優(yōu)選1～3：1。

通常，使用有機溶劑時，反應(yīng)體系中，有機溶劑和氨基供體的體積比通常在4～40：1的范圍之內(nèi)，優(yōu)選4～20：1。例如，在某些實施例中，使用DMSO和異丙胺的混合物，兩者的體積比為4～40：1，優(yōu)選為4～20：1。

可用來制備式2化合物的轉(zhuǎn)氨酶包括但不限于來自節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)、土曲霉(Aspergillus terreus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、海王生絲單胞菌(Hyphomonas neptunium)或青紫色素桿菌(Chromobacterium violaceum)的ω-轉(zhuǎn)氨酶。

在一個具體實施例中，所述轉(zhuǎn)氨酶的序列如SEQ ID NO:1(來自文獻(xiàn)Appl.Microbiol.Biotechnol.93(4),1563-1573(2012))、SEQ ID NO:2(來自文獻(xiàn)Appl.Microbiol.Biotechnol.61(5-6),463-471(2003))、SEQ ID NO:3(來自文獻(xiàn)Protein Eng.Des.Sel.26(1),25-33(2013))、SEQ ID NO:4(來自文獻(xiàn)Genome Announc 2(5)(2014))、SEQ ID NO:5(來自文獻(xiàn)J.Bacteriol.193(16),4199-4213(2011))、SEQ ID NO:6(Genebank序列號：GAN13094.1)、SEQ ID NO:7(來自文獻(xiàn)J.Bacteriol.188(19),6841-6850(2006))、SEQ ID NO:8(來自文獻(xiàn)J.Bacteriol.188(19),6841-6850(2006))、以及SEQ ID NO:9－19所示。

本發(fā)明也包括使用與SEQ ID NO:1－20中任一序列的序列相同性為至少80％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、更優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少98％的轉(zhuǎn)氨酶。優(yōu)選的是，所述轉(zhuǎn)氨酶的酶活與SEQ ID NO:1－20中任一所示的轉(zhuǎn)氨酶的酶活至少相當(dāng)?？刹捎帽绢I(lǐng)域周知的方法來確定兩條序列之間的序列相同性，例如BLAST。

在優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明使用SEQ ID NO:18－20中任一項所示的轉(zhuǎn)氨酶。

輔酶通常是磷酸吡哆醛。輔酶與轉(zhuǎn)氨酶的重量配比為0.02～0.2：1，優(yōu)選0.05～0.2：1，例如0.08～0.15：1。

轉(zhuǎn)氨酶與式4化合物的重量配比通常為1：1～20，優(yōu)選為1：2～20，例如1：5～20。

以反應(yīng)體系總體積計，式4化合物的濃度為1～120g/L，優(yōu)選5～100g/L，例如5～80g/L、10～80g/L不等。

生成化合物3的反應(yīng)通常在pH為7.0～10.0的條件下進(jìn)行，優(yōu)選pH為8.0～1.0，更優(yōu)選為9.0～10.0。通常使用三乙醇胺緩沖溶液、Tris-HCl緩沖溶液、磷酸鹽緩沖溶液的緩沖液來維持反應(yīng)體系的pH，優(yōu)選使用三乙醇胺緩沖液。

生成化合物3的反應(yīng)溫度通常為30～45℃，優(yōu)選35±3℃，更優(yōu)選35±1℃。

反應(yīng)時間通常為8～24小時。在某些實施例中，式4化合物中R為芐氧基羰基；有機溶劑為DMSO，氨基供體為異丙胺，DMSO和異丙胺的體積比為4～40：1，優(yōu)選為4～20：1；轉(zhuǎn)氨酶為SEQ ID NO:18－20中任一序列所示；輔酶與轉(zhuǎn)氨酶的重量配比為00.05～0.2：1；氨基供體與底物式4化合物的摩爾比為1～5：1；式4化合 物的濃度為5～100g/L；體系pH為9.0～10.0，使用三乙醇胺緩沖液調(diào)節(jié)和/或維持；反應(yīng)溫度為35±1℃，反應(yīng)時間為8～24小時。

在其它實施例中，可采用上述反應(yīng)條件的任意組合來實施本發(fā)明的方法。

本發(fā)明采用的分析方法如下：

轉(zhuǎn)化率分析方法：HPLC/MS(安捷倫1260)裝備有C18色譜柱(4.6*50mm，5μm)，流動相：0-3min，5％乙腈95％水，3-6min，40％乙腈60％水，6-7min，90％乙腈10％水，7-10min，5％乙腈95％水，流速0.3mL/min，檢測波長214nm，柱溫30度，出峰時間為：產(chǎn)物2c 6.2min，產(chǎn)物3c 5.5min，底物4c 8.3min。

產(chǎn)物光學(xué)純度分析方法：HPLC(島津LC-10AT)裝備有AD-H手性色譜柱(4.6*250mm，5μm)，流動相：30％乙醇70％正己烷，流速1mL/min，檢測波長214nm，柱溫40度，出峰時間為：RR-2c 14min，SS-2c 17min。

實施例1：氨基保護(hù)基團(tuán)的篩選

底物分別為芐基保護(hù)、甲酸乙酯保護(hù)和Cbz基團(tuán)保護(hù)的4-(3-氯丙基)-3-吡咯烷酮(4a,4b,4c)10mg，溶解于0.2mL DMSO中，加入0.8mL三乙醇胺緩沖溶液中(pH8.0，0.1M)，加入轉(zhuǎn)氨酶(SEQ ID NO:18)10mg，磷酸吡哆醛(PLP)1mg，異丙胺0.01mL，30度下反應(yīng)24小時，檢測轉(zhuǎn)化率>99％，加入1mL乙酸乙酯萃取5次，合并有機相，干燥濃縮之后得到產(chǎn)品2a，2b，2c分別為3.44mg，7.44mg和8.37mg，其摩爾得率分別為40％，88％和95％。

實施例2：芐基保護(hù)底物穩(wěn)定性考察

由于芐基保護(hù)底物的穩(wěn)定性可能存在問題，故對其穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。底物芐基保護(hù)的4-(3-氯丙基)-3-吡咯烷酮(4a)10mg，溶解于0.2mL DMSO中，分別加入0.8mL三乙醇胺緩沖溶液(pH 8.0，0.1M)，磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0，0.1M)和去離子水，加入異丙胺0.01mL，30度下震蕩24小時，取樣檢測底物在HPLC中峰面積的變化，如下表：

表明該底物在酶反應(yīng)條件下不穩(wěn)定。

實施例3：反應(yīng)溫度選擇

將10mg底物4c溶解于0.2mL DMSO中，加入0.8mL三乙醇胺緩沖溶液中(pH8.0，0.1M)，加入轉(zhuǎn)氨酶(SEQ ID NO:18)1mg，PLP 0.1mg，異丙胺0.01mL，不同溫度下度下反應(yīng)24小時，檢測轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如下表所示：

實施例4：反應(yīng)pH選擇

底物4c 10mg溶解于0.2mL DMSO中，加入0.8mL不同pH的緩沖溶液(0.1M)，加入轉(zhuǎn)氨酶(SEQ ID NO:19)1mg，PLP 0.1mg,異丙胺0.01mL，35度下反應(yīng)8小時，檢測轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如下表所示：

實施例5：PLP用量選擇

底物4c 10mg溶解于0.2mL DMSO中，加入0.8mL三乙醇胺緩沖溶液中(pH9.0，0.1M)，加入轉(zhuǎn)氨酶(SEQ ID NO:19)1mg，PLP 0.2-0.02mg，異丙胺0.01mL，35度下反應(yīng)12小時，檢測轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如下表所示：

實施例6：DMSO用量選擇

底物4c 10mg加入1mL三乙醇胺緩沖溶液中(pH 9.0，0.1M)，加入轉(zhuǎn)氨酶(SEQ ID NO:20)1mg，PLP 0.05mg,異丙胺0.01mL，添加入不同量DMSO，35度下反應(yīng)8小時，檢測轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如下表所示：

實施例7：異丙胺用量選擇

底物4c 10mg溶解于0.2mL DMSO中，加入0.8mL三乙醇胺緩沖溶液中(pH9.0，0.1M)，加入轉(zhuǎn)氨酶(SEQ ID NO:20)1mg，PLP 0.05mg,異丙胺0.005-0.02mL，35度下反應(yīng)8小時，檢測轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如下表所示：

實施例8：底物濃度選擇

底物4c 10,20,40,80,100mg溶解于0.2mL DMSO中，加入0.8mL三乙醇胺緩沖溶液中(pH 9.0，0.1M)，加入轉(zhuǎn)氨酶(SEQ ID NO:20)4mg，PLP 0.05mg,異丙胺0.01mL，35度下反應(yīng)8小時，檢測轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如下表所示：

實施例9：產(chǎn)物制備

反應(yīng)器中加入400mL 100mM pH 9.0三乙醇胺緩沖溶液，底物(3-(3-氯丙基)-4-羰基吡咯烷-1-甲酸苯甲酯)50g，DMSO 100mL，異丙胺25mL，磷酸吡哆醛0.25g，重組轉(zhuǎn)氨酶(購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，商品牌號EW094，SEQ ID NO:20) 2.5g，35度下反應(yīng)24小時，HPLC檢測轉(zhuǎn)化率99.8％，產(chǎn)物ee值99.9％，de值99.9％。

加入1mL乙酸乙酯萃取5次，合并有機相，干燥濃縮之后得到產(chǎn)品41.9g，收率95％。

產(chǎn)物的NMR圖譜和MS圖譜分別如圖1和2所示。

對比實施例：

將10mg底物4c溶解于0.2mL DMSO中，加入0.8mL三乙醇胺緩沖溶液中(pH8.0，0.1M)，加入轉(zhuǎn)氨酶(SEQ ID NO:1和4)1mg，PLP 0.1mg，異丙胺0.01mL，35度下反應(yīng)24小時，檢測轉(zhuǎn)化率，分別為2.8％和5.0％。